腹部迷走神经刺激植入手术和清醒大鼠的记录研究

摘要

本方案描述了将电极阵列植入大鼠腹部迷走神经的手术技术，以及使用植入装置进行慢性电生理学测试和刺激的方法。

摘要

腹部迷走神经刺激（VNS）可应用于大鼠迷走神经的膈下支。由于其解剖位置，它没有任何通常与颈部 VNS 相关的呼吸和心脏脱靶效应。缺乏呼吸和心脏脱靶效应意味着不需要降低刺激强度来减少颈椎 VNS 期间常见的副作用。最近的研究很少证明腹部 VNS 在炎症性肠病、类风湿性关节炎的大鼠模型和 2 型糖尿病大鼠模型中降低血糖的抗炎作用。大鼠是探索这项技术潜力的绝佳模型，因为迷走神经的解剖结构完善，神经尺寸大，易于处理，以及许多疾病模型的可用性。在这里，我们描述了在大鼠中清洁和消毒腹部VNS电极阵列和手术方案的方法。我们还描述了通过记录诱发的复合动作电位来确认超阈值刺激所需的技术。腹部 VNS 有可能为包括炎症性疾病在内的各种疾病提供选择性、有效的治疗，预计其应用范围将类似于颈椎 VNS。

引言

在颈部颈部进行迷走神经刺激 （VNS） 是美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的难治性癫痫、难治性抑郁症和缺血性卒中后康复^{的治疗方法 1}，以及欧盟委员会批准用于欧洲心力衰竭^{的治疗 2}。无创颈椎 VNS 已获得 FDA 批准用于偏头痛和头痛¹。预计其应用将扩大，最近的临床试验显示 VNS 在其他适应症中的疗效，例如克罗恩病³、类风湿性关节炎 ^4,5 和糖耐量受损和 2 型糖尿病 ^6,7。尽管很有希望，但颈部VNS可引起心动过缓和呼吸暂停，这是由于支配肺和心脏的神经纤维的脱靶激活^8,9,10。在接受颈椎 VNS^11,12 的患者中通常报告咳嗽、疼痛、声音改变、头痛和呼吸暂停低通气指数升高等副作用。降低刺激强度是减少这些副作用的常用策略，然而，降低电荷可能会因无法激活治疗纤维而限制VNS治疗的疗效¹¹。为了支持这一假设，接受高强度刺激治疗癫痫的患者的反应率高于接受低强度刺激的患者¹³。

腹部VNS施加在膈下迷走神经上，位于肝和腹腔分支¹⁴上方（图1）。我们之前的研究表明，在大鼠中，腹部VNS不会引起与颈椎VNS¹⁰相关的心脏或呼吸系统副作用。早期的研究还证明了腹部VNS在炎症性肠病和类风湿性关节炎的大鼠模型中的抗炎作用^10,15以及2型糖尿病大鼠模型中血糖的降低¹⁶。最近，腹部VNS技术已被转化为治疗炎症性肠病（NCT05469607）的首次人体临床试验。

用于向腹部迷走神经提供刺激的周围神经电极阵列（WO2019095020¹⁷）是为大鼠定制开发的，由两到三个相距 4.7 mm 的铂电极对组成，由医用级硅弹性体袖带、用于将阵列固定到食道的缝合片、一根导线和安装在腰部区域的经皮连接器支撑（图 2).引线在动物左侧的皮肤下开凿。多电极对设计允许对神经进行电刺激，并记录电诱发复合动作电位 （ECAP），从而确认植入物在神经上的正确放置和阈值以上的刺激强度。腹部VNS在自由移动的大鼠中耐受性良好，持续10,15,16个月。这允许评估其对疾病模型的疗效。

本文介绍了电极阵列灭菌、腹部迷走神经植入手术以及ECAPs在清醒大鼠中慢性刺激和记录的方法，以研究腹部VNS在多种疾病模型中的疗效。这些方法最初用于研究腹部VNS在炎症性肠病大鼠^{模型中的疗效10} ，并且还成功用于类风湿性关节炎¹⁵ 和糖尿病¹⁶的大鼠模型。

研究方案

所有涉及动物的程序均由圣文森特医院（墨尔本）动物伦理委员会批准，并符合《澳大利亚科学动物护理和使用法典》（澳大利亚国家卫生和医学研究委员会）和《防止虐待动物法》（1986年）法。总共使用了 24 只雌性 Dark Agouti 大鼠（8-9 周龄）进行本研究。实验组包括:未接受胶原蛋白注射或VNS植入物的正常队列（n = 8）;接受植入物和胶原蛋白注射（未进行电生理测试）的未受刺激的疾病队列 （n = 8）;以及接受植入物、胶原蛋白注射、电生理测试和 VNS 治疗的受刺激疾病队列 （n = 8）。植入手术发生在胶原蛋白注射前 5 天，VNS 治疗的习惯在胶原蛋白注射后 4 天开始，持续 7 天。在胶原蛋白注射^{后第 11} 天至第 17 天（含）应用 VNS 治疗 15.对于受刺激的疾病队列，在麻醉下植入手术后、胶原注射当天、胶原注射后10天和终止当天（胶原注射后17天）立即进行电生理测试。

1. 电极阵列的超声处理和灭菌

1. 将超声波清洗机的频率设置为 80 kHz，然后用自来水填充超声波水箱。将电极阵列浸没在干净的塑料容器中的清洁溶液中，然后将其放入超声波罐中。
   注意: 表1总结了每个步骤使用的清洁溶液和超声处理时间。每个步骤都使用干净的容器。
2. 使用干净的镊子将超声处理的电极阵列放入灭菌袋中，在蒸馏水中用0.5%液体清洁溶液超声处理并用蒸馏水冲洗。将电极阵列高压灭菌45分钟，最高温度为130°C，并在干净的工作台上干燥。

2. 在腹迷走神经上植入电极阵列

注意:在这项研究中，我们使用了雌性深色刺豚鼠（8-9周龄）¹⁵。我们还成功地使用该协议长期植入成年雄性Sprague-Dawley大鼠（10-14周龄）^10,16。手术在无菌条件下进行，所有器械、电极阵列和耗材（如纱布和棉尖）均通过高压灭菌进行灭菌。

1. 使用3%异氟醚和1L / min氧气在诱导室中麻醉大鼠。一旦脚趾捏没有踏板反射，将大鼠移到手术台上带有恒温器的热垫上，并在鼻子上放置异氟烷面罩。
2. 在整个手术过程中监测呼吸频率和直肠温度，并将异氟烷水平调整在 1.5% 至 2.5% 之间，以将呼吸频率保持在每分钟 40 至 62 次呼吸之间。如果需要，调整热垫设置，以将直肠温度范围保持在 35.9 - 37.5 °C 之间。
3. 在手术开始前，使用 1 mL 注射器和 25G 针头（卡洛芬 5 mg/kg 和丁丙诺啡 0.03 mg/kg，皮下注射）皮下注射镇痛。
4. 在切口部位周围大量剃须，包括从木突到肋骨末端的腹侧中线区域、背部沿背中线的腰部以及前肢和后肢之间的身体左侧，以允许阵列的皮下隧道。
5. 用甜菜碱和酒精交替轮次以圆周运动清洁手术部位三次，并在动物身上放置手术罩。使用带有 25G 针头的 1 mL 注射器在背侧和腹侧切口部位皮下注射布比卡因 （1-2 mg/kg）。
6. 将动物腹侧卧位，并在背部做一个 2 厘米长的切口，使用手术刀刀片固定经皮基座。
7. 将大鼠转向背卧，并使用手术刀刀片沿中线在皮肤上切开3厘米的切口，就在木突下方。举起切口部位附近的皮肤，用解剖剪刀，从切口周围的肌肉层钝解剖皮肤层。
8. 为了允许阵列从基座到植入部位的皮下隧道，将动物放在其右侧，从腹侧切口插入止血钳，然后向背侧切口部位钝解剖。切断针帽的边缘并插入电极阵列以在运输过程中保护它（图1B）。用手（戴上无菌手套），将电极阵列在皮肤下朝向腹侧切口。
9. 为了进入食道和迷走神经，再次将动物置于背卧位。沿着木突下方的中线在肌肉层上做一个 3 厘米的切口，大到足以暴露肝脏的整个长度。在此步骤中避免损害肝脏。
10. 在肌肉层（动物左侧）的侧向（动物左侧）上做一个较小的切口（小于 1 厘米），以到达主腹侧切口。使用步骤 2.8 中使用的针帽将电极阵列穿过这个小切口，将阵列插入腹腔。
    注意:此步骤可减少施加在主要切口部位的张力，并降低缝合线破裂的风险。
11. 缩回皮肤和肌肉层以保持腹腔张开。使用浸泡在无菌盐水中的棉尖和纱布处理纸巾，确保保持纸巾湿润。
12. 用Vannas剪刀剪开肝脏周围的结缔组织，将牵开器放在一小块浸泡在生理盐水中的纱布上，以轻轻缩回肝脏。在食道和胃之间放置一个牵开器，轻轻缩回胃，使食道和上覆迷走神经伸直。
    注意: 牵开器是通过将鱼钩的尖头变圆制成的。
13. 暴露食管腹面后，识别腹部迷走神经及其亚分支，包括肝神经、腹腔神经和两个胃支（图1D）。
14. 使用细镊子和 Vannas 剪刀切割将腹部迷走神经固定到食道的结缔组织，并解剖从肝和腹腔分支上方到横膈膜的神经长度。确保不要撕裂、拉伸或捏伤神经。在神经旁边放置一个电极阵列，以确认神经与结缔组织分离出足够长的长度以适合阵列。
15. 一旦神经周围的结缔组织被清除，将丝缝线 （7-0） 穿过神经下方阵列袖带的电极侧。打开阵列的袖带，小心地将神经放入阵列通道中。
16. 确保神经的整个长度都位于阵列通道内。将袖带周围的缝合线绑在一起，牢固地闭合袖带，以确保神经不会滑出通道。修剪缝合线。
17. 使用 7-0 真丝缝合线，将阵列的标签缝合到食道上，以将阵列固定到位并防止其扭曲。避免损伤迷走神经的其他分支或将针头插入食管平滑肌太深。
18. 轻轻取下牵开器，并确保所有纱布都已从腹腔中取出。使用 1 mL 注射器在腹腔内给予 1-2 mL 温热无菌盐水，并将肝脏重新定位到正确的位置。
19. 使用简单的跑步缝合技术用 3-0 丝缝合线闭合肌肉层，两端至少打 3 次，形成牢固的方形结。空间缝合紧密（相距约 3 毫米），以防止并发症，例如疝气/木突突出。
20. 使用缝合线将腹膜切口与肌肉层切口一起闭合，以减少组织粘连的机会。
21. 使用可吸收的缝合材料（Vicryl 4-0），闭合皮肤切口。使用埋藏缝合技术，例如运行埋入式垂直床垫缝合线或运行埋入式真皮缝合线，以防止动物移除缝合线。
22. 将动物转向腹侧卧位，用剪刀将背侧切口延长至 4-5 厘米，并进一步钝解剖肌肉和皮肤层之间的钝解剖，以便经皮连接器的连接器底部可以平放在肌肉层上。
23. 使用真丝 3-0 缝合线，在连接器底座周围进行 6 到 8 次简单的断续缝合，以将其固定到下面的肌肉层。使用水平床垫缝合技术，用丝绸 3-0 缝合线闭合皮肤切口，确保至少 3 次安全的方形结。
    注意:在此步骤中，与单丝缝合线相比，编织丝缝合线因其易于处理且能够创建更安全的结而成为首选。
24. 手术完成后，皮下注射 Hartmann 溶液 （1 mL/100 g/h）。关闭异氟醚，让动物在加热垫上恢复，同时运行氧气（1.5 L / min）。一旦大鼠有意识并完全活动，将大鼠放回其家庭笼子，放在热垫上，直到从麻醉中完全恢复。
25. 密切观察动物从异氟烷中恢复的情况，并确保动物能够获得食物和饮料。在接下来的两天内，皮下给予术后镇痛剂（卡洛芬 5 mg/kg，每日）以减轻疼痛。每天至少监测动物 2 次，检查排便的证据、皮毛的质量、活动水平以及手术伤口是否有任何肿胀或分泌物。
26. 记录动物的体重，在极少数情况下，动物减轻 10% 或更多，开始强化治疗。强化治疗包括每天皮下输液（Hartmann 溶液，2x 10 mL），提供额外的食物，如新鲜蔬菜和膳食凝胶补充剂，并将一半的笼子放在带有恒温器的加热垫上以获得额外的温暖。增加监测频率，直到动物康复。如果需要，根据 Grimace 量表继续给予镇痛剂（卡洛芬 5 mg/kg，SQ，每日）。

3.电生理试验

注意:记录诱发复合动作电位 （ECAP） 确认电极阵列在迷走神经上的正确位置。此外，使用上述电极阵列记录 ECAP 可能确认迷走神经 C 纤维和超阈值 VNS^10,15 的电激活。

1. 在记录ECAP之前，测量电极的公共接地阻抗以评估其完整性并检测导线的任何开路或短路。 体内 功能性腹部迷走神经电极的阻抗值应在 4 - 20 kΩ 之间。
2. 在麻醉时测试动物，即手术后立即，或清醒并自由移动。手术后至少 2-3 天进行清醒测试，以使手术皮肤伤口愈合和稳定。收集阻抗和电生理测试所需的设备，包括定制的刺激器、数据采集设备、隔离式差分放大器以及 材料表中列出的数据采集和分析软件。
3. 如果需要，用毛巾包裹动物，将电缆连接到背面经皮连接器，并将电缆的另一端连接到刺激器。要测试电极的公共接地阻抗，请在目标电极和阵列上的所有其他电极之间施加双相电流脉冲（每相 100 μs，电流为 107 μA）。
4. 测量电压波形第一相末期的峰值电压（V_总计），并使用欧姆定律（Z = 电压/电流）计算总阻抗（Z_总计）。
5. 将一对电极连接到刺激器，将一对电极连接到记录设备，并使用放置在皮肤下的 VNS 植入物的参比电极作为 ECAP 差异记录的参考，应用双极刺激以产生 ECAP。使用数据采集和分析软件从总共 50 次重复中平均制作两组记录。
6. 使用以下设置进行测量。
   电流:0 至 2 mA，增量为 0.1 mA;
   脉冲宽度:25 - 200 μs;
   相间隙:8 - 50 μs;
   刺激速率:10-30脉冲/秒;
   采样率:100 kHz;
   滤波器:高通 200 Hz，低通 2000 Hz，电压增益 1 x 10²。
7. 使用数据分析软件，通过测量分析窗口内波形的峰峰值电压来分析ECAP响应（激励后4-10 ms，如图3A，B中的阴影所示）。ECAP阈值定义为在两组平均电生理记录中产生至少0.1 μV_峰峰值响应幅度的最小激励电流强度。对于高于阈值的至少两个当前水平，将重复有效响应，并且对于低于阈值^10,15 的至少两个当前水平不存在。

4.清醒大鼠的慢性腹部VNS

注意:一旦经皮连接器周围的手术伤口愈合并稳定，腹部 VNS 即可应用于清醒的动物。为了减少任何应激反应并允许更好的数据收集，动物习惯于测试人员的处理和刺激环境，在植入手术和VNS治疗开始前的七天内每天一小时。

1. 在应用任何 VNS 之前，按照步骤 3.4 中的说明测量每个电极的阻抗。确保刺激电极的阻抗低于 20 kΩ。
2. 将电缆连接到背面经皮连接器，并将电缆的另一端连接到编程为施加适当刺激的刺激器（例如，27 Hz、1.6 mA、200 μs 脉宽和 50 μs 相间隙，30 秒开启，2.5 分钟关闭¹⁵），然后打开刺激器。
   注意:虽然如果适当习惯，经常观察到动物在刺激期间入睡，但请尽可能使用带有保护性外壳材料（如钢圈）的电缆，以防止其被咀嚼。
3. 在每次 VNS 治疗开始时观察动物，以确保没有不良反应，例如过度梳理或活动水平突然增加/减少与刺激时间同步。
4. 每 30 分钟监测一次，以检查电缆是否扭曲或断开。要长期应用 VNS（例如，每天 3 小时，持续 7 天¹⁵），请在每次会话开始时重复步骤 4.1-4.3。
   注意: 使用换向器可以减少电缆扭曲的机会，并且可能需要较少的监控频率。

结果

手术后立即记录诱发复合动作电位（ECAP，图3A，B）是一种技术，可用于帮助确认神经在阵列通道内的正确位置，并且刺激可有效激活迷走神经。

在图3中，雌性深色刺豚鼠（8-9周龄）被植入VNS电极阵列。在随机选择接受治疗刺激的大鼠中，在手术后（第0天，图3A）和VNS治疗结束时（第23天，

讨论

这种腹部 VNS 植入手术和迷走神经慢性刺激和记录 ECAP 的方法已在植入后的大鼠中成功使用并耐受性良好 5 周 10,15,16。缩回胃、肝和肠道以获得食道和迷走神经的良好视野是手术的关键步骤之一。一旦这些器官缩回，迷走神经就可以进入。胃的回缩可能会影响呼吸，在这种情况下，牵开器会松动。此外，在切割食道周围的结缔?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Briemarpak	SC3050
Baytril	Bayer
Betadine	Sanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (Buprenorphine)	Jurox
Data acquisition device	National Instruments	USB-6210
DietGel Boost (dietary gel supplement)	ClearH2O
Dumont tweezer, style 5	ProSciTech	T05-822
Dumont tweezer, style N7, self-closing	ProSciTech	EMS72864-D
Elmasonic P sonicator	Elma
Hartmann's solution	Baxter	AHB2323
Hemostat	ProSciTech	TS1322-140
HPMC/PAA Moisturising Eye Gel	Alcon
Igor Pro-8 software	Wavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)	Zoetis
Isolated differential amplifier	World Precision Instruments	ISO-80
Liquid pyroneg	Diversey	HH12291	cleaning solution
Marcaine (Bupivacaine)	Aspen
Plastic drape	Multigate	22-203
Rat vagus nerve implant	Neo-Bionica
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis
Silk suture 3-0	Ethicon
Silk suture 7-0	Ethicon
SteriClave autoclave	Cominox	24S
Sterile disposable surgical gown	Zebravet	DSG-S
Suicide Nickel hooks	Jarvis Walker
Ultrapure water	Merck Millipre	Milli-Q Direct
Underpads	Zebravet	UP10SM
Vannas scissors	ProSciTech	EMS72933-01
Vicryl suture 4-0	Ethicon