覚醒ラットにおける腹部迷走神経刺激および記録研究のための移植手術

要約

本プロトコルは、ラットの腹部迷走神経に電極アレイを埋め込むための外科的技術と、埋め込まれたデバイスを使用した慢性電気生理学的検査および刺激の方法を説明する。

要約

腹部迷走神経刺激(VNS)は、ラットの迷走神経の横隔膜下枝に適用できます。その解剖学的位置により、子宮頸部VNSに一般的に関連する呼吸器および心臓のオフターゲット効果はありません。呼吸器および心臓のオフターゲット効果がないため、子宮頸部VNS中に一般的に経験される副作用を軽減するために刺激の強度を下げる必要はありません。炎症性腸疾患、関節リウマチ、および2型糖尿病のラットモデルにおける血糖低下のラットモデルにおける腹部VNSの抗炎症効果を示す最近の研究はほとんどありません。ラットは、迷走神経の解剖学的構造が確立されていること、神経のサイズが大きいため取り扱いが容易であること、および多くの疾患モデルが利用できるため、この技術の可能性を探るのに最適なモデルです。ここでは、ラットにおける腹部VNS電極アレイの洗浄および滅菌方法と手術プロトコルについて説明します。また、誘発された化合物活動電位を記録することにより、閾値超刺激を確認するために必要な技術についても説明します。腹部VNSは、炎症性疾患を含む様々な疾患に対して選択的かつ効果的な治療を提供する可能性を秘めており、子宮頸部VNSと同様に用途拡大が期待されています。

概要

頸部の頸部に照射する迷走神経刺激療法(VNS)は、難治性てんかん、難治性うつ病、虚血性脳卒中後のリハビリテーション1に対して米国食品医薬品局(FDA)が承認した治療薬^であり、欧州では心不全に対して欧州委員会が承認した^治療薬2です。非侵襲的頸部VNSは、片頭痛と頭痛に対してFDA承認^{されています1。}その用途は拡大すると予想され、最近の臨床試験では、クローン病³、関節リウマチ^4,5、耐糖能障害、2型糖尿病^6,7などの他の適応症でのVNSの有効性が示されています。有望ではあるが、頸部VNSは、肺と心臓を神経支配する神経線維のオフターゲット活性化により、徐脈や無呼吸を引き起こす可能性がある^8,9,10。咳、痛み、声の変化、頭痛、無呼吸低呼吸指数の増加などの副作用は、子宮頸部^VNS11,12を受けている患者で一般的に報告されています。刺激強度の低下は、これらの副作用を軽減するための一般的な戦略ですが、電荷の減少は、治療用繊維を活性化できないことにより、VNS療法の有効性を制限する可能性があります¹¹。この仮説を裏付けるように、てんかんの治療のために高強度の刺激を受けた患者のレスポンダー率は、低強度の刺激を受けた患者のレスポンダー率よりも高かった¹³。

腹部VNSは、肝臓および腹腔枝の上にある横隔膜下迷走神経に適用されます¹⁴(図1)。私たちの以前の研究は、ラットで腹部VNSが子宮頸部VNSに関連する心臓または呼吸器の副作用を引き起こさないことを実証しました¹⁰。以前の研究では、炎症性腸疾患と関節リウマチのラットモデルにおける腹部VNSの抗炎症効果も実証されています^10,15、および2型糖尿病のラットモデルにおける血糖の減少¹⁶。最近、腹部VNS技術は、炎症性腸疾患(NCT05469607)の治療のためのファースト・イン・ヒューマン臨床試験に転用されました。

腹部迷走神経(WO2019095020¹⁷)に刺激を与えるために使用される末梢神経電極アレイは、ラットで使用するためにカスタム開発されたもので、4.7mm間隔で配置された2〜3組の白金電極ペアで構成され、医療グレードのシリコンエラストマーカフ、アレイを食道に固定するための縫合タブ、リード線、および腰部に取り付けられる経皮的コネクタによって支えられています(図2).リード線は動物の左側の皮膚の下にトンネルを掘っています。複数の電極ペア設計により、神経の電気刺激が可能になるだけでなく、電気的に誘発された複合活動電位(ECAP)を記録し、神経へのインプラントの正しい配置と閾値超刺激強度を確認できます。腹部VNSは、^10,15,16か月間、自由に動くラットで忍容性が良好です。これにより、疾患モデルに対する有効性を評価することができます。

この原稿では、さまざまな疾患モデルにおける腹部VNSの有効性を研究するために、電極アレイ滅菌、腹部迷走神経移植手術、および覚醒ラットにおけるECAPの慢性刺激と記録の方法について説明します。これらの方法は、もともと炎症性腸疾患¹⁰ のラットモデルにおける腹部VNSの有効性を研究するために開発され、関節リウマチ¹⁵ および糖尿病¹⁶のラットモデルにも成功裏に使用されています。

プロトコル

動物に関するすべての処置は、セントビンセント病院(メルボルン)の動物倫理委員会によって承認され、科学的目的のための動物のケアと使用に関するオーストラリア法(オーストラリア国立保健医療研究評議会)および動物虐待防止法(1986年)に準拠しています。合計で、24匹の雌のダークアグーチラット(8〜9週齢)がこの研究に使用されました。実験グループは以下で構成されていました:コラーゲン注射またはVNSインプラントを受けていない正常なコホート(n = 8)。インプラントとコラーゲン注射を受けた刺激されていない疾患コホート(n = 8)(電気生理学的検査は実施されていない)。インプラント、コラーゲン注射、電気生理学的検査、およびVNS療法を受けた刺激疾患コホート(n = 8)。コラーゲン注入の5日前に移植手術を行い、コラーゲン注入の4日後にVNS療法の馴化を開始し、7日間にわたって行われました。VNS療法は、コラーゲン注射後11日目から17日目まで適用されました¹⁵。刺激性疾患コホートでは、麻酔下での着床手術直後、コラーゲン注入日、コラーゲン注入10日後、および終了日(コラーゲン注入17日後)に電気生理学的検査を実施した。

1.電極アレイの超音波処理と滅菌

1. 超音波洗浄機の周波数を80kHzに設定し、超音波タンクに水道水を入れます。電極アレイを清潔なプラスチック容器の洗浄液に浸し、超音波タンクに入れます。
   注:各ステップに使用する洗浄液と超音波処理時間を 表1にまとめます。各ステップに清潔な容器を使用してください。
2. 超音波処理された電極アレイを、蒸留水中の0.5%液体洗浄液で超音波処理し、蒸留水ですすいだ清潔な鉗子を使用して滅菌バッグに入れます。電極アレイを最高温度130°Cで45分間オートクレーブし、クリーンベンチで乾燥させます。

2. 腹部迷走神経への電極アレイの埋め込み

注:この研究では、雌の暗アグーチラット(8〜9週齢)を使用しました¹⁵。また、このプロトコルを使用して、成体のオスのSprague-Dawleyラット(10〜14週齢)を慢性的に移植することにも成功しました^10,16。手術は無菌状態で行われ、すべての器具、電極アレイ、ガーゼや綿先などの消耗品はオートクレーブ滅菌されます。

1. 誘導チャンバー内で、3%イソフルランと1L/minの酸素を使用してラットを麻酔します。つま先をつまむためのペダル反射がなくなったら、手術台の上のサーモスタットでラットをヒートマットに移動し、イソフルランマスクを鼻の上に置きます。
2. 手術中は呼吸数と直腸温を監視し、イソフルランレベルを1.5%から2.5%の間で調整して、呼吸数を毎分40〜62回に維持します。.直腸の温度範囲を35.9〜37.5°Cに維持するために、必要に応じてヒートマットの設定を調整します。
3. 手術開始前に、25Gの針(カルプロフェン5 mg / kgおよびブプレノルフィン0.03 mg / kg皮下)を備えた1 mLシリンジを使用して、鎮痛前投薬を皮下投与します。.
4. 切開部位の周囲をたっぷりと剃り、甲状突起から胸郭の端までの腹側正中線に沿った領域、背側正中線に沿った背中の腰部、前肢と後肢の間の体の左側など、アレイの皮下トンネルを可能にします。
5. ベタジンとアルコールを交互に浴びて手術部位を円を描くように3回洗浄し、動物の上に外科用ドレープを置きます。ブピバカイン(1〜2 mg / kg)を皮下投与します 背側と腹側の切開部位に25Gの針が付いた1 mLの注射器を使用します。.
6. 動物を腹側横臥に置き、メスの刃を使用して経皮的台座を固定する背中に長さ2cmの切開を行います。
7. ラットを背側横臥に向け、メスの刃を使用して、xyphoid突起のすぐ下の正中線に沿って皮膚を3cm切開します。切開部位付近の皮膚を持ち上げ、解剖ハサミを使用して、切開部の周りの筋肉層から皮膚層を鈍く解剖します。
8. 台座から着床部位までのアレイの皮下トンネリングを可能にするには、動物を右側に置き、腹側切開部位から止血を挿入し、背側切開部位に向かって鈍く解剖します。ニードルキャップの縁を切り取り、電極アレイを挿入して輸送中に保護します(図1B)。手(滅菌手袋を着用)を使用して、皮膚の下の電極アレイを腹側切開部に向かってトンネルします。
9. 食道と迷走神経にアクセスするには、動物を再び背臥位に横たえます。キシフィス突起の下の正中線に沿って筋肉層を3cm切開し、肝臓の全長を露出させるのに十分な大きさにします。このステップ中に肝臓を傷つけないようにしてください。
10. 主腹側切開部までの筋肉層(動物の左側)を横方向に小さく(1cm未満)切開します。ステップ2.8で使用したニードルキャップを使用して、この小さな切開部に電極アレイをトンネルし、アレイを腹腔に挿入します。
    注:このステップは、主要な切開部位に加えられる張力を軽減し、縫合糸が破裂するリスクを軽減します。
11. 皮膚と筋肉の層を引っ込めて、腹腔を開いたままにします。滅菌生理食塩水に浸した綿の先端とガーゼを使用して組織を湿らせてください。
12. バンナハサミを使用して肝臓の周りの結合組織を切断し、保護のために生理食塩水に浸したガーゼの小片の上にリトラクターを置くことにより、肝臓を静かに引っ込めます。食道と胃の間にリトラクターを配置して、食道とその上にある迷走神経をまっすぐにするために、胃を静かに引っ込めます。
    注:リトラクターは、釣り針の先のとがった端を丸めることによって作られます。
13. 食道の腹面を露出させた後、腹部迷走神経とその副枝(肝神経、腹腔神経、2つの胃枝を含む)を特定します(図1D)。
14. 腹部迷走神経を食道に固定している結合組織を細い鉗子とバンナハサミで切断し、肝枝と腹腔枝のすぐ上から横隔膜に向かって神経の長さを解剖します。神経を引き裂いたり、伸ばしたり、挟んだりしないように注意してください。神経の隣に電極アレイを配置して、アレイに収まるように十分な長さの神経が結合組織から分離されていることを確認します。
15. 神経の周りの結合組織が取り除かれたら、神経の下のアレイカフの電極側にシルク縫合糸(7-0)を通します。アレイのカフを開き、神経をアレイチャネルに慎重に配置します。
16. 神経の全長がアレイチャネル内にあることを確認してください。カフの周りの縫合糸を結び、カフをしっかりと閉じて、神経がチャネルから滑り落ちないようにします。縫合糸をトリミングします。
17. 7-0シルク縫合糸を使用して、アレイのタブを食道に縫合し、アレイを所定の位置に固定し、ねじれを防ぎます。迷走神経の他の枝を傷つけたり、食道平滑筋に針を深く刺しすぎたりしないでください。
18. リトラクターをそっと取り外し、すべてのガーゼが腹腔から取り除かれていることを確認します。腹腔内に1 mLのシリンジを使用して1〜2 mLの温かい滅菌生理食塩水を投与し、肝臓を正しい位置に再配置します。.
19. 簡単なランニング縫合法を使用して3-0シルク縫合糸で筋肉層を閉じ、両端に少なくとも3回投げて安全な正方形の結び目を作ります。スペースステッチを密着(約3mm間隔)して、ヘルニア/キシフィス突起の突出などの合併症を防ぎます。
20. 縫合糸を使用して腹膜の切開を筋肉層の切開と一緒に閉じ、組織癒着の可能性を減らします。
21. 吸収性縫合材料(Vicryl 4-0)を使用して、皮膚切開部を閉じます。動物が縫合糸を抜くのを防ぐために、ランニング埋設垂直マットレス縫合糸やランニング埋設皮膚縫合糸などの埋設縫合技術を使用してください。
22. 動物を腹側横臥に向け、ハサミを使用して背側切開を4〜5 cmに伸ばし、経皮的コネクタのコネクタベースが筋肉層に平らに収まるように、筋肉と皮膚層の間をさらに鈍く解剖します。
23. シルク3-0縫合糸を使用して、コネクタベースの周りに6〜8本の簡単な断続縫合糸を作成し、下の筋肉層に固定します。水平マットレス縫合技術を使用して、シルク3-0縫合糸で皮膚切開を閉じ、少なくとも3回のスローでしっかりとした正方形の結び目を確保します。
    注:このステップでは、編組シルク縫合糸は、モノフィラメント縫合糸と比較して、取り扱いが容易で、より安全な結び目を作成する能力があるため、好まれます。
24. 手術終了時に、ハルトマン溶液を皮下投与します(1 mL / 100 g / h)。イソフルランをオフにし、酸素(1.5 L / min)を流しながらヒートマットの上で動物を回復させます。ラットが意識を取り戻し、完全に動けるようになったら、麻酔薬から完全に回復するまで、ラットをホームケージに戻し、ヒートパッドの上に置きます。
25. イソフルランからの動物の回復を注意深く観察し、動物が食べ物や飲み物にアクセスできることを確認してください。次の2日間で、痛みを和らげるために、術後鎮痛剤(カルプロフェン5 mg / kg、毎日)の皮下投与を行います。.1日2回以上動物を観察し、排便の痕跡、被毛の質、活動レベル、手術創からの腫れや分泌物の有無を確認します。
26. 動物の体重を記録し、まれに動物が10%以上減少した場合は、集中治療を開始します。集中治療には、毎日の水分(ハルトマン溶液、2x 10 mL)の皮下投与、新鮮な野菜や栄養ジェルサプリメントなどの追加の餌の提供、ケージの半分をサーモスタット付きのヒートパッドの上に置いてさらに暖かくすることが含まれます。動物が回復するまで、モニタリングの頻度を増やします。必要に応じて、Grimaceスケールに基づいて鎮痛剤(カルプロフェン5 mg / kg、SQ、毎日)の投与を続けます。.

3. 電気生理学的検査

注:誘発化合物活動電位(ECAP)を記録することで、迷走神経上の電極アレイの適切な配置を確認できます。さらに、上記の電極アレイを使用したECAPの記録により、迷走神経C線維および閾値超VNSの電気的活性化が確認できる可能性があります^10,15。

1. ECAPを記録する前に、電極の共通接地インピーダンスを測定して完全性を評価し、ワイヤの開回路または短絡を検出します。 in vivo で機能する腹部迷走神経電極は、4〜20kΩのインピーダンス値を持つ必要があります。
2. 麻酔をかけている間、すなわち手術直後、または覚醒して自由に動いている状態で動物を試験する。手術後少なくとも2〜3日後に覚醒検査を行い、手術後の皮膚の傷が治癒して安定するのを待ちます。インピーダンスおよび電気生理学的試験に必要な機器(カスタムメイドの刺激装置、データ収集デバイス、絶縁差動アンプ、データ収集および解析ソフトウェアなど)を材料 表に記載のとおりに集めます。
3. 必要に応じて動物をタオルで包み、ケーブルを背面経皮コネクタに接続し、ケーブルのもう一方の端を刺激装置に接続します。電極の共通接地インピーダンスをテストするには、対象の電極とアレイ上の他のすべての電極の間に二相性電流パルス(位相あたり100μs、電流107μA)を印加します。
4. 電圧波形の第1相終了時のピーク電圧(V_合計)を測定し、オームの法則(Z=電圧/電流)を使用して全インピーダンス(Z_合計)を計算します。
5. 一対の電極を刺激装置に、一対の電極を記録装置に接続し、皮膚下に配置したVNSインプラントの参照電極をECAPの差動記録の基準として、バイポーラ刺激を印加してECAPを生成します。データ収集および解析ソフトウェアを使用して、合計 50 回の繰り返しから平均した 2 セットの記録を行います。
6. 測定には次の設定を使用します。
   電流:0.1mA刻みで0〜2mA。
   パルス幅:25 - 200 μs;
   間相ギャップ:8〜50μs;
   刺激速度:10〜30パルス/秒。
   サンプリングレート:100 kHz;
   フィルター:ハイパス200Hz、ローパス2000Hz、電圧ゲイン1 x 10²。
7. データ解析ソフトウェアを使用して、解析ウィンドウ内の波形のピークtoピーク電圧(刺激後4〜10ms、図3A、Bの網掛けで表示)を測定してECAP応答を解析します。ECAP閾値は、平均電気生理学的記録の両方のセットで少なくとも0.1μVの_{ピーク-ピークの}応答振幅を生成する最小刺激電流強度として定義されます。有効な応答は、閾値を超える少なくとも2つの電流レベルに対して繰り返され、閾値^10,15を下回る少なくとも2つの電流レベルに対しては存在しません。

4. 覚醒ラットにおける慢性腹部VNS

注:腹部VNSは、経皮的コネクターの周りの外科的創傷が治癒して安定すると、覚醒している動物に適用できます。ストレス反応を軽減し、より良いデータ収集を可能にするために、動物は、移植手術とVNS療法の開始前に、7日間にわたって1日1時間、テスターの取り扱いと刺激の環境に慣れています。

1. VNSを適用する前に、ステップ3.4の説明に従って各電極のインピーダンスを測定します。刺激電極のインピーダンスが20kΩ未満であることを確認してください。
2. ケーブルを背面の経皮コネクタに接続し、ケーブルのもう一方の端を、適切な刺激(例:27 Hz、1.6 mA、200 μsのパルス幅、50 μsの相間ギャップ、30秒オン、2.5分オフ¹⁵)を適用するようにプログラムされた刺激装置に接続し、刺激装置をオンにします。
   注意: 動物は、適切に慣れていれば、刺激中に眠りに落ちるのがよく観察されますが、噛まれないように、可能な限りスチールコイルなどの保護外装材を備えたケーブルを使用してください。
3. 各VNS療法セッションの開始時に動物を観察し、過度のグルーミングや刺激のタイミングに同期した活動レベルの急激な増減などの副作用がないことを確認します。
4. 30分ごとに監視して、ケーブルのねじれや断線がないか確認します。VNSを慢性的に適用するには(例:7日間¹⁵で1日3時間)、各セッションの開始時に手順4.1〜4.3を繰り返します。
   注意: 整流子を使用すると、ケーブルがねじれる可能性が低くなり、監視の頻度が少なくて済む場合があります。

結果

手術直後に誘発された複合活動電位(ECAP、 図3A、B)を記録することは、アレイチャネル内の神経の正しい配置を確認するために使用できる技術であり、その刺激は迷走神経の活性化に効果的です。

図3では、雌の暗色アグーチラット(8〜9週齢)にVNS電極アレイを移植しました。治療刺激を受けるように無作為に選択さ...

ディスカッション

腹部VNSインプラント手術と迷走神経の慢性刺激およびECAPの記録のこの方法は、移植後のラットで5週間使用され、忍容性が良好です10,15,16。胃、肝臓、腸を引っ込めて食道と迷走神経をよく見ることは、手術の重要なステップの1つです。これらの臓器が引っ込められると、迷走神経にアクセスできるようになります。胃を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Briemarpak	SC3050
Baytril	Bayer
Betadine	Sanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (Buprenorphine)	Jurox
Data acquisition device	National Instruments	USB-6210
DietGel Boost (dietary gel supplement)	ClearH2O
Dumont tweezer, style 5	ProSciTech	T05-822
Dumont tweezer, style N7, self-closing	ProSciTech	EMS72864-D
Elmasonic P sonicator	Elma
Hartmann's solution	Baxter	AHB2323
Hemostat	ProSciTech	TS1322-140
HPMC/PAA Moisturising Eye Gel	Alcon
Igor Pro-8 software	Wavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)	Zoetis
Isolated differential amplifier	World Precision Instruments	ISO-80
Liquid pyroneg	Diversey	HH12291	cleaning solution
Marcaine (Bupivacaine)	Aspen
Plastic drape	Multigate	22-203
Rat vagus nerve implant	Neo-Bionica
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis
Silk suture 3-0	Ethicon
Silk suture 7-0	Ethicon
SteriClave autoclave	Cominox	24S
Sterile disposable surgical gown	Zebravet	DSG-S
Suicide Nickel hooks	Jarvis Walker
Ultrapure water	Merck Millipre	Milli-Q Direct
Underpads	Zebravet	UP10SM
Vannas scissors	ProSciTech	EMS72933-01
Vicryl suture 4-0	Ethicon