Implantationschirurgie zur Stimulation des abdominalen Vagusnervs und Aufzeichnungsstudien an wachen Ratten

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die chirurgische Technik zur Implantation eines Elektrodenarrays auf den abdominalen Vagusnerv bei Ratten, zusammen mit Verfahren für chronische elektrophysiologische Tests und Stimulation unter Verwendung der implantierten Vorrichtung.

Zusammenfassung

Die abdominale Vagusnervstimulation (VNS) kann auf den subdiaphragmatischen Ast des Vagusnervs von Ratten angewendet werden. Aufgrund seiner anatomischen Lage hat es keine respiratorischen und kardialen Off-Target-Effekte, die üblicherweise mit zervikalem VNS in Verbindung gebracht werden. Das Fehlen von respiratorischen und kardialen Off-Target-Effekten bedeutet, dass die Intensität der Stimulation nicht verringert werden muss, um Nebenwirkungen zu reduzieren, die häufig bei zervikalem VNS auftreten. Nur wenige neuere Studien zeigen die entzündungshemmende Wirkung von abdominalem VNS in Rattenmodellen für entzündliche Darmerkrankungen, rheumatoide Arthritis und Glykämiereduktion in einem Rattenmodell für Typ-2-Diabetes. Die Ratte ist ein großartiges Modell, um das Potenzial dieser Technologie zu erforschen, da die Anatomie des Vagusnervs gut etabliert ist, die Größe des Nervs eine einfache Handhabung ermöglicht und viele Krankheitsmodelle verfügbar sind. Hier beschreiben wir die Methoden zur Reinigung und Sterilisation des abdominalen VNS-Elektrodenarrays und des chirurgischen Protokolls bei Ratten. Wir beschreiben auch die Technologie, die zur Bestätigung einer überschwelligen Stimulation erforderlich ist, indem evozierte zusammengesetzte Aktionspotentiale aufgezeichnet werden. Die abdominale VNS hat das Potenzial, eine selektive, wirksame Behandlung für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich entzündlicher Erkrankungen, zu bieten, und es wird erwartet, dass sich die Anwendung ähnlich wie die zervikale VNS ausweiten wird.

Einleitung

Die Vagusnervstimulation (VNS), die an der zervikalen Stelle im Hals verabreicht wird, ist von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von refraktärer Epilepsie, refraktärer Depression und postischämischer Schlaganfallrehabilitation^{zugelassen 1} und von der Europäischen Kommission für Herzinsuffizienz in Europa^{zugelassen 2}. Die nicht-invasive zervikale VNS ist von der FDA für Migräne und Kopfschmerzen zugelassen¹. Es wird erwartet, dass sich die Anwendung ausweiten wird, da jüngste klinische Studien die Wirksamkeit von VNS bei anderen Indikationen wie Morbus Crohn³, rheumatoider Arthritis ^4,5 und beeinträchtigter Glukosetoleranz und Typ-2-Diabetes ^6,7 zeigen. Obwohl vielversprechend, kann zervikale VNS Bradykardie und Apnoe verursachen, da die Nervenfasern, die die Lunge und das Herz innervieren, nicht zielgerichtet aktiviert werden ^8,9,10. Nebenwirkungen wie Husten, Schmerzen, Stimmveränderungen, Kopfschmerzen und Anstieg des Apnoe-Hypopnoe-Index werden häufig bei Patienten berichtet, die zervikale VNS^11,12 erhalten. Die Verringerung der Stimulationsstärke ist eine gängige Strategie zur Verringerung dieser Nebenwirkungen, jedoch kann eine reduzierte Ladung die Wirksamkeit der VNS-Therapie einschränken, da die therapeutischen Fasern nicht aktiviert werden¹¹. Zur Unterstützung dieser Hypothese war die Ansprechrate von Patienten, die eine hochintensive Stimulation zur Behandlung von Epilepsie erhielten, höher als die von Patienten, die eine Stimulation niedriger Intensität erhielten¹³.

Die abdominale VNS wird am subdiaphragmatischen Vagusnerv oberhalb der Leber- und Zöliakieäste¹⁴ angelegt (Abbildung 1). Unsere vorherige Studie zeigte, dass VNS bei Ratten keine kardialen oder respiratorischen Nebenwirkungen verursacht, die mit zervikalem VNS¹⁰ verbunden sind. Frühere Studien zeigen auch entzündungshemmende Wirkungen von abdominalen VNS in einem Rattenmodell für entzündliche Darmerkrankungen und rheumatoide Arthritis^10,15 sowie eine Verringerung der Glykämie in einem Rattenmodell für Typ-2-Diabetes¹⁶. Kürzlich wurde die abdominale VNS-Technologie für eine erste klinische Studie am Menschen zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen (NCT05469607) übersetzt.

Das periphere Nervenelektrodenarray, das zur Stimulation des abdominalen Vagusnervs (WO2019095020¹⁷) verwendet wird, wurde speziell für den Einsatz bei Ratten entwickelt und besteht aus zwei bis drei Platinelektrodenpaaren im Abstand von 4,7 mm, die von einer medizinischen Silikonelastomermanschette, einer Nahtlasche zur Verankerung des Arrays an der Speiseröhre, einem Elektrodendraht und einem perkutanen Konnektor zur Befestigung an der Lendenwirbelsäule getragen werden (Abbildung 2). Der Bleidraht wird auf der linken Seite des Tieres unter die Haut getunnelt. Das Design mehrerer Elektrodenpaare ermöglicht die elektrische Stimulation des Nervs sowie die Aufzeichnung elektrisch evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs), die die korrekte Platzierung des Implantats auf dem Nerv und die überschwelligen Stimulationsintensitäten bestätigen. Abdominales VNS wird bei frei beweglichen Ratten für die Monate 10,15,16 gut vertragen. Dies ermöglicht die Bewertung seiner Wirksamkeit auf Krankheitsmodelle.

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für die Elektrodenarray-Sterilisation, die Implantation des abdominalen Vagusnervs und die chronische Stimulation und Aufzeichnung von ECAPs bei wachen Ratten zur Untersuchung der Wirksamkeit von abdominalen VNS in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen. Diese Methoden wurden ursprünglich für die Untersuchung der Wirksamkeit von abdominalen VNS im Rattenmodell für entzündliche Darmerkrankungen¹⁰ entwickelt und wurden auch erfolgreich für ein Rattenmodell für rheumatoide Arthritis¹⁵ und Diabetes¹⁶ eingesetzt.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden von der Tierethikkommission des St. Vincent's Hospital (Melbourne) genehmigt und entsprachen dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (National Health and Medical Research Council of Australia) und dem Gesetz zur Verhinderung von Tierquälerei (1986). Insgesamt wurden 24 weibliche Dark Agouti-Ratten (8-9 Wochen alt) für diese Studie verwendet. Die Versuchsgruppen bestanden aus: einer normalen Kohorte (n = 8), die keine Kollageninjektion oder VNS-Implantation erhielt; eine nicht stimulierte Krankheitskohorte (n = 8), die ein Implantat und eine Kollageninjektion erhielt (keine elektrophysiologischen Tests durchgeführt); und eine Kohorte stimulierter Krankheiten (n = 8), die ein Implantat, eine Kollageninjektion, elektrophysiologische Tests und eine VNS-Therapie erhielt. Die Implantationsoperation erfolgte 5 Tage vor der Kollageninjektion, und die Gewöhnung an die VNS-Therapie begann 4 Tage nach der Kollageninjektion und erfolgte über 7 Tage. Die VNS-Therapie wurde von Tag 11 bis einschließlich 17 nach Kollageninjektion^{angewendet 15}. Für die Kohorte der stimulierten Krankheit wurden elektrophysiologische Tests unmittelbar nach der Implantation unter Narkose, am Tag der Kollageninjektion, 10 Tage nach der Kollageninjektion und am Tag des Abbruchs (17 Tage nach der Kollageninjektion) durchgeführt.

1. Beschallung und Sterilisation des Elektrodenarrays

1. Stellen Sie den Ultraschallreiniger auf eine Frequenz von 80 kHz ein und füllen Sie den Ultraschalltank mit Leitungswasser. Tauchen Sie das Elektrodenarray in die Reinigungslösung in einen sauberen Kunststoffbehälter und legen Sie es in den Ultraschalltank.
   HINWEIS: Die Reinigungslösung und die für jeden Schritt zu verwendende Beschallungszeit sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Verwenden Sie für jeden Schritt einen sauberen Behälter.
2. Legen Sie das beschallte Elektrodenarray mit einer sauberen Pinzette, die mit 0,5% flüssiger Reinigungslösung in destilliertem Wasser beschallt und in destilliertem Wasser gespült wurde, in einen Sterilisationsbeutel. Autoklavieren Sie das Elektrodenarray 45 Minuten lang bei einer maximalen Temperatur von 130 °C und lassen Sie es auf einer sauberen Bank trocknen.

2. Implantation des Elektrodenarrays am abdominalen Vagusnerv

HINWEIS: In dieser Studie haben wir weibliche dunkle Agouti-Ratten (im Alter von 8-9 Wochen)¹⁵ verwendet. Wir haben dieses Protokoll auch erfolgreich zur chronischen Implantation erwachsener männlicher Sprague-Dawley-Ratten (im Alter von 10-14 Wochen) ^{eingesetzt10,16}. Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, und alle Instrumente, Elektrodenträger und Verbrauchsmaterialien wie Gaze und Wattestäbchen werden durch Autoklavieren sterilisiert.

1. Betäuben Sie die Ratte in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff. Sobald kein Pedalreflex auf Zehenklemmen vorhanden ist, bewegen Sie die Ratte mit einem Thermostat auf dem Operationstisch auf die Heizmatte und legen Sie eine Isofluranmaske über die Nase.
2. Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Rektaltemperatur während der gesamten Operation und stellen Sie den Isofluranspiegel zwischen 1,5 % und 2,5 % ein, um die Atemfrequenz zwischen 40 und 62 Atemzügen pro Minute zu halten. Passen Sie bei Bedarf die Einstellung der Heizmatte an, um den rektalen Temperaturbereich zwischen 35,9 - 37,5 °C aufrechtzuerhalten.
3. Analgesie-Prämedikation vor Beginn der Operation subkutan mit 1-ml-Spritzen mit 25-G-Nadeln (Carprofen 5 mg/kg und Buprenorphin 0,03 mg/kg subkutan) verabreichen.
4. Rasieren Sie sich großzügig um die Inzisionsstelle herum, einschließlich des Bereichs entlang der ventralen Mittellinie vom Xyphoidfortsatz bis zum Ende des Brustkorbs, der Lendenwirbelsäule des Rückens entlang der dorsalen Mittellinie und der linken Körperseite zwischen Vorder- und Hintergliedmaße, um ein subkutanes Tunneln des Arrays zu ermöglichen.
5. Reinigen Sie die Operationsstellen dreimal in kreisenden Bewegungen mit abwechselnden Runden Betadin und Alkohol und legen Sie ein OP-Tuch über das Tier. Verabreichen Sie Bupivacain (1-2 mg/kg) subkutan mit einer 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel an den dorsalen und ventralen Inzisionsstellen.
6. Legen Sie das Tier in die Bauchlage und machen Sie einen 2 cm langen Schnitt auf dem Rücken, wo der perkutane Sockel mit einer Skalpellklinge verankert wird.
7. Drehen Sie die Ratte in die Rückenlage und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen 3 cm langen Schnitt auf der Haut entlang der Mittellinie direkt unter dem Xyphoidprozess. Halten Sie die Haut in der Nähe der Inzisionsstelle hoch und stauchen Sie mit einer Präparierschere die Hautschicht von der Muskelschicht um den Einschnitt herum stumpf ab.
8. Um ein subkutanes Tunneln des Arrays vom Sockel bis zur Implantationsstelle zu ermöglichen, legen Sie das Tier auf die rechte Seite, führen Sie einen Hämostaten aus dem ventralen Schnitt ein und präparieren Sie stumpf in Richtung der dorsalen Inzisionsstelle. Schneiden Sie den Rand einer Nadelkappe ab und setzen Sie das Elektrodenarray ein, um es während des Transports zu schützen (Abbildung 1B). Tunneln Sie das Elektrodenarray mit den Händen (sterile Handschuhe tragen) unter der Haut in Richtung des ventralen Schnitts.
9. Um Zugang zur Speiseröhre und zum Vagusnerv zu erhalten, legen Sie das Tier wieder in Rückenlage. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in der Muskelschicht entlang der Mittellinie unterhalb des Xyphoidfortsatzes, der groß genug ist, um die gesamte Länge der Leber freizulegen. Vermeiden Sie bei diesem Schritt eine Schädigung der Leber.
10. Machen Sie einen kleineren Schnitt (weniger als 1 cm) an der Muskelschicht seitlich (die linke Seite des Tieres) zum ventralen Hauptschnitt. Tunneln Sie das Elektrodenarray durch diesen kleinen Schnitt mit der in Schritt 2.8 verwendeten Nadelkappe, um das Array in die Bauchhöhle einzuführen.
    HINWEIS: Dieser Schritt reduziert die Spannung, die auf die Hauptinzisionsstelle ausgeübt wird, und verringert das Risiko, dass die Nähte platzen.
11. Ziehen Sie die Haut- und Muskelschichten zurück, um die Bauchhöhle offen zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe feucht bleibt, indem Sie Wattestäbchen und in steriler Kochsalzlösung getränkte Gaze verwenden, um das Gewebe zu behandeln.
12. Ziehen Sie die Leber vorsichtig zurück, indem Sie das Bindegewebe um sie herum mit einer Vannas-Schere durchtrennen und einen Retraktor über ein kleines Stück Gaze legen, das zum Schutz in Kochsalzlösung getränkt ist. Ziehen Sie den Magen vorsichtig zurück, um die Begradigung der Speiseröhre und des darüber liegenden Vagusnervs zu ermöglichen, indem Sie einen Retraktor zwischen Speiseröhre und Magen platzieren.
    HINWEIS: Retraktoren werden durch Abrunden des spitzen Endes von Angelhaken hergestellt.
13. Identifizieren Sie nach Freilegung der ventralen Oberfläche der Speiseröhre den abdominalen Vagusnerv und seine Unteräste, einschließlich des Lebernervs, des Zöliakienervs und zweier Magenäste (Abbildung 1D).
14. Schneiden Sie das Bindegewebe, das den abdominalen Vagusnerv mit der Speiseröhre verbindet, mit einer feinen Pinzette und einer Vannas-Schere und präparieren Sie die Länge des Nervs von knapp über dem Leber- und Zöliakieast in Richtung Zwerchfell. Achten Sie darauf, den Nerv nicht zu reißen, zu dehnen oder einzuklemmen. Platzieren Sie ein Elektrodenarray neben dem Nerv, um zu bestätigen, dass die Länge des Nervs vom Bindegewebe ausreichend entfernt ist, um in das Array zu passen.
15. Sobald das Bindegewebe um den Nerv herum entfernt wurde, führen Sie die Seidennähte (7-0) auf der Elektrodenseite der Array-Manschette unter den Nerv hindurch. Öffnen Sie die Manschette des Arrays und platzieren Sie den Nerv vorsichtig in den Array-Kanal.
16. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge des Nervs innerhalb des Array-Kanals sitzt. Binden Sie die Nähte um die Manschette zusammen, um die Manschette sicher zu schließen und sicherzustellen, dass der Nerv nicht aus dem Kanal rutscht. Schneiden Sie die Nähte.
17. Nähen Sie die Lasche des Arrays mit einer 7-0-Seidennaht auf die Speiseröhre, um das Array an Ort und Stelle zu sichern und ein Verdrehen zu verhindern. Vermeiden Sie es, die anderen Äste des Vagusnervs zu beschädigen oder die Nadel zu tief in die glatte Muskulatur der Speiseröhre einzuführen.
18. Entfernen Sie vorsichtig die Retraktoren und stellen Sie sicher, dass die gesamte Gaze aus der Bauchhöhle entfernt wurde. Verabreichen Sie 1-2 ml warme sterile Kochsalzlösung mit einer 1-ml-Spritze in die Bauchhöhle und positionieren Sie die Leber wieder in die richtige Position.
19. Schließen Sie die Muskelschicht mit 3-0 Seidennaht in der einfachen Laufnahttechnik und machen Sie sichere quadratische Knoten mit mindestens 3 Würfen an beiden Enden. Platzieren Sie die Nähte eng beieinander (ca. 3 mm Abstand), um Komplikationen wie Hernie/Vorwölbung des Xyphoidfortsatzes zu vermeiden.
20. Verwenden Sie eine Naht, um den Einschnitt des Peritoneums zusammen mit dem Einschnitt der Muskelschicht zu schließen, um die Wahrscheinlichkeit einer Gewebeadhäsion zu verringern.
21. Schließen Sie den Hautschnitt mit einem resorbierbaren Nahtmaterial (Vicryl 4-0). Verwenden Sie eine vergrabene Nahttechnik wie die vergrabene vertikale Matratzennaht oder die vergrabene Hautnaht, um zu verhindern, dass das Tier die Naht entfernt.
22. Drehen Sie das Tier in die Bauchlage und verlängern Sie den dorsalen Schnitt mit einer Schere auf 4-5 cm und stumpf zwischen Muskel und Hautschicht weiter, damit die Verbindungsbasis des perkutanen Verbindungsstücks flach auf der Muskelschicht sitzen kann.
23. Machen Sie mit Seide 3-0-Naht 6 bis 8 einfache unterbrochene Nähte um die Verbindungsbasis, um sie an der darunter liegenden Muskelschicht zu befestigen. Schließen Sie den Hautschnitt mit Silk 3-0 Naht unter Verwendung der horizontalen Matratzennahttechnik und sorgen Sie für sichere quadratische Knoten mit mindestens 3 Würfen.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden geflochtene Seidennähte aufgrund ihrer einfachen Handhabung und ihrer Fähigkeit, im Vergleich zu monofilen Nähten sicherere Knoten zu erzeugen, bevorzugt.
24. Nach Abschluss der Operation ist die Hartmann-Lösung subkutan (1 ml/100 g/h) zu verabreichen. Schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie das Tier auf einer Heizmatte unter Sauerstoffzufuhr (1,5 l/min) erholen. Sobald die Ratte bei Bewusstsein und vollständig mobil ist, bringen Sie die Ratte in ihren Heimatkäfig zurück, der auf ein Wärmekissen gelegt wird, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
25. Beobachten Sie genau, wie sich das Tier von Isofluran erholt, und stellen Sie sicher, dass das Tier Zugang zu Futter und Getränken hat. Verabreichen Sie in den nächsten zwei Tagen eine postoperative Analgesie (Carprofen 5 mg/kg, täglich) subkutan, um die Schmerzen zu lindern. Überwachen Sie das Tier mindestens 2x pro Tag und überprüfen Sie es auf Anzeichen von Stuhlgang, Qualität des Fells, Aktivitätsniveau und Vorhandensein von Schwellungen oder Ausfluss aus den Operationswunden.
26. Nehmen Sie das Gewicht des Tieres auf und beginnen Sie in dem seltenen Fall, dass das Tier 10 % oder mehr verliert, mit einer intensiven Behandlung. Die Intensivbehandlung umfasst die subkutane Verabreichung von Flüssigkeiten (Hartmann-Lösung, 2x 10 ml) pro Tag, die Bereitstellung zusätzlicher Nahrung wie frisches Gemüse und Nahrungsergänzungsmittel sowie das Aufstellen der Hälfte des Käfigs auf ein Wärmekissen mit Thermostat für zusätzliche Wärme. Erhöhen Sie die Häufigkeit der Überwachung, bis sich das Tier erholt hat. Fahren Sie mit der Verabreichung von Analgesie (Carprofen 5 mg/kg, SQ, täglich) fort, falls erforderlich, basierend auf einer Grimace-Skala.

3. Elektrophysiologische Tests

HINWEIS: Die Aufzeichnung evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs) bestätigt die ordnungsgemäße Platzierung des Elektrodenarrays auf dem Vagusnerv. Darüber hinaus liefert die Aufzeichnung von ECAPs unter Verwendung des oben beschriebenen Elektrodenarrays eine wahrscheinliche Bestätigung der elektrischen Aktivierung vagaler C-Fasern und der überschwelligen VNS^10,15.

1. Messen Sie die gemeinsame Erdungsimpedanz von Elektroden, um ihre Integrität zu beurteilen und Unterbrechungen oder Kurzschlüsse von Drähten vor der Aufzeichnung von ECAPs zu erkennen. Funktionierende abdominale Vagusnervelektroden in vivo sollten Impedanzwerte zwischen 4 - 20 kΩ haben.
2. Versuchstiere in Narkose, d.h. unmittelbar nach der Operation, oder wach und frei beweglich. Führen Sie mindestens 2-3 Tage nach der Operation einen Wachtest durch, damit die chirurgischen Hautwunden heilen und stabilisieren können. Stellen Sie die für die Impedanz- und elektrophysiologische Prüfung erforderliche Ausrüstung zusammen, die einen maßgeschneiderten Stimulator, ein Datenerfassungsgerät, einen isolierten Differenzverstärker und eine Datenerfassungs- und Analysesoftware umfasst, wie in der Materialtabelle aufgeführt.
3. Wickeln Sie das Tier bei Bedarf in ein Handtuch, schließen Sie ein Kabel an den hinteren perkutanen Anschluss an und verbinden Sie das andere Ende des Kabels mit einem Stimulator. Um die gemeinsame Erdungsimpedanz von Elektroden zu testen, legen Sie zweiphasige Stromimpulse (100 μs pro Phase und Strom von 107 μA) zwischen der interessierenden Elektrode und allen anderen Elektroden auf dem Array an.
4. Messen Sie die Spitzenspannung am Ende der ersten Phase der Spannungswellenform (_{V gesamt}) und berechnen Sie die Gesamtimpedanz (Z_gesamt) nach dem Ohmschen Gesetz (Z = Spannung/Strom).
5. Schließen Sie ein Elektrodenpaar an den Stimulator und ein Elektrodenpaar an das Kontrollgerät an und wenden Sie eine bipolare Stimulation an, um ECAPs zu erzeugen, wobei die Referenzelektrode des VNS-Implantats, das unter der Haut platziert wird, als Referenz für die differentielle Aufzeichnung von ECAPs verwendet wird. Erstellen Sie zwei Sätze von Aufnahmen, die aus insgesamt 50 Wiederholungen gemittelt werden, mit der Datenerfassungs- und Analysesoftware.
6. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für Messungen.
   Ströme: 0 bis 2 mA in Schritten von 0,1 mA;
   Pulsbreite: 25 - 200 μs;
   Interphasenabstand: 8 - 50 μs;
   Stimulationsrate: 10 - 30 Impulse/s;
   Abtastrate: 100 kHz;
   Filter: Hochpass 200 Hz, Tiefpass 2000 Hz, Spannungsverstärkung 1 x 10².
7. Analysieren Sie mit der Datenanalysesoftware die ECAP-Antwort, indem Sie die Spitze-Spitze-Spannung der Wellenformen innerhalb des Analysefensters messen (4 - 10 ms nach dem Stimulus, angezeigt durch Schattierung in Abbildung 3A,B). Der ECAP-Schwellenwert ist definiert als die minimale Stimulusstromintensität, die in beiden Sätzen von durchschnittlichen elektrophysiologischen Aufzeichnungen eine Antwortamplitude von mindestens 0,1 μV_{Spitze-Spitze} erzeugt. Eine gültige Antwort wird für mindestens zwei aktuelle Pegel oberhalb des Schwellenwerts wiederholt und für mindestens zwei aktuelle Pegel unterhalb des Schwellenwerts^10,15 nicht vorhanden.

4. Chronisches abdominales VNS bei wachen Ratten

HINWEIS: Die abdominale VNS kann bei wachen Tieren angewendet werden, sobald die Operationswunde um den perkutanen Konnektor verheilt und stabilisiert ist. Um Stressreaktionen zu reduzieren und eine bessere Datenerfassung zu ermöglichen, werden die Tiere sieben Tage vor der Implantationsoperation und dem Beginn der VNS-Therapie eine Stunde täglich an die Handhabungs- und Stimulationsumgebung der Tester gewöhnt.

1. Messen Sie die Impedanz jeder Elektrode wie in Schritt 3.4 beschrieben, bevor Sie VNS anwenden. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz der Stimulationselektroden unter 20 kΩ liegt.
2. Schließen Sie ein Kabel an den hinteren perkutanen Anschluss an und verbinden Sie das andere Ende des Kabels mit einem Stimulator, der für eine geeignete Stimulation programmiert ist (z. B. 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs Pulsbreite mit 50 μs Interphasenabstand, 30 s EIN, 2,5 min aus¹⁵), und schalten Sie den Stimulator ein.
   Anmerkungen: Obwohl Tiere oft beobachtet werden, dass sie während der Stimulation einschlafen, wenn sie entsprechend gewöhnt sind, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Kabel mit schützendem Außenmaterial wie Stahlspulen, um zu verhindern, dass es gekaut wird.
3. Beobachten Sie das Tier zu Beginn jeder VNS-Therapiesitzung, um sicherzustellen, dass keine Nebenwirkungen wie übermäßige Fellpflege oder plötzliche Erhöhung/Abnahme des Aktivitätsniveaus synchron zum Zeitpunkt der Stimulation auftreten.
4. Überwachen Sie alle 30 Minuten, um zu überprüfen, ob das Kabel verdreht oder getrennt wird. Um VNS chronisch anzuwenden (z. B. 3 Stunden pro Tag über 7 Tage¹⁵), wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 zu Beginn jeder Sitzung.
   HINWEIS: Die Verwendung eines Kommutators kann die Wahrscheinlichkeit verringern, dass Kabel verdrillt werden, und erfordert möglicherweise eine weniger häufige Überwachung.

Ergebnisse

Die Aufzeichnung evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs, Abbildung 3A,B) unmittelbar nach der Operation ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die korrekte Platzierung des Nervs innerhalb des Array-Kanals zu bestätigen, und diese Stimulation ist wirksam bei der Aktivierung des Vagusnervs.

In Abbildung 3 wurde weiblichen dunklen Agouti-Ratten (8-9 Wochen alt) das VNS-Elektrodenarray implantiert...

Diskussion

Diese Methode der abdominalen VNS-Implantation und der chronischen Stimulation des Vagusnervs und der Aufzeichnung von ECAPs wurde bei Ratten nach der Implantation 5 Wochen lang erfolgreich angewendet und gut vertragen 10,15,16. Das Zurückziehen von Magen, Leber und Darm, um eine gute Sicht auf die Speiseröhre und den Vagusnerv zu erhalten, ist einer der wichtigsten Schritte bei der Operation. Sobald diese Organe zurückgezoge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Briemarpak	SC3050
Baytril	Bayer
Betadine	Sanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (Buprenorphine)	Jurox
Data acquisition device	National Instruments	USB-6210
DietGel Boost (dietary gel supplement)	ClearH2O
Dumont tweezer, style 5	ProSciTech	T05-822
Dumont tweezer, style N7, self-closing	ProSciTech	EMS72864-D
Elmasonic P sonicator	Elma
Hartmann's solution	Baxter	AHB2323
Hemostat	ProSciTech	TS1322-140
HPMC/PAA Moisturising Eye Gel	Alcon
Igor Pro-8 software	Wavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)	Zoetis
Isolated differential amplifier	World Precision Instruments	ISO-80
Liquid pyroneg	Diversey	HH12291	cleaning solution
Marcaine (Bupivacaine)	Aspen
Plastic drape	Multigate	22-203
Rat vagus nerve implant	Neo-Bionica
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis
Silk suture 3-0	Ethicon
Silk suture 7-0	Ethicon
SteriClave autoclave	Cominox	24S
Sterile disposable surgical gown	Zebravet	DSG-S
Suicide Nickel hooks	Jarvis Walker
Ultrapure water	Merck Millipre	Milli-Q Direct
Underpads	Zebravet	UP10SM
Vannas scissors	ProSciTech	EMS72933-01
Vicryl suture 4-0	Ethicon