Cirurgia de Implante para Estimulação do Nervo Vago Abdominal e Estudos de Gravação em Ratos Acordados

Resumo

O presente protocolo descreve a técnica cirúrgica para implantação de um arranjo de eletrodos no nervo vago abdominal em ratos, juntamente com métodos para testes eletrofisiológicos crônicos e estimulação com o dispositivo implantado.

Resumo

A estimulação do nervo vago abdominal (ENV) pode ser aplicada ao ramo subdiafragmático do nervo vago de ratos. Devido à sua localização anatômica, não apresenta efeitos respiratórios e cardíacos fora do alvo comumente associados à ENV cervical. A ausência de efeitos respiratórios e cardíacos fora do alvo significa que a intensidade da estimulação não precisa ser reduzida para reduzir os efeitos colaterais comumente experimentados durante a ENV cervical. Poucos estudos recentes demonstram os efeitos anti-inflamatórios da ENV abdominal em modelos de doença inflamatória intestinal em ratos, artrite reumatoide e redução da glicemia em um modelo de diabetes tipo 2 em ratos. O rato é um ótimo modelo para explorar o potencial dessa tecnologia devido à anatomia bem estabelecida do nervo vago, ao grande tamanho do nervo que permite fácil manuseio e à disponibilidade de muitos modelos de doenças. Aqui, descrevemos os métodos de limpeza e esterilização do arranjo de eletrodos da ENV abdominal e o protocolo cirúrgico em ratos. Descrevemos também a tecnologia necessária para a confirmação da estimulação supralimiar por meio do registro dos potenciais de ação compostos evocados. A ENV abdominal tem o potencial de oferecer tratamento seletivo e eficaz para uma variedade de condições, incluindo doenças inflamatórias, e espera-se que a aplicação se expanda de forma semelhante à ENV cervical.

Introdução

A estimulação do nervo vago (ENV) administrada no local cervical no pescoço é o tratamento aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para epilepsia refratária, depressão refratária e reabilitação pós-acidente vascular cerebral isquêmico¹, e aprovado pela Comissão Europeia para insuficiência cardíaca na Europa². A ENV cervical não invasiva é aprovada pela FDA para enxaqueca e cefaleia¹. Espera-se que sua aplicação se expanda, com ensaios clínicos recentes mostrando eficácia da ENV em outras indicações, como doença de Crohn³, artrite reumatoide ^4,5 e intolerância à glicose e diabetes tipo 2 ^6,7. Apesar de promissora, a ENV cervical pode causar bradicardia e apneia devido à ativação fora do alvo das fibras nervosas que inervam os pulmões e o coração ^8,9,10. Efeitos colaterais como tosse, dor, alteração vocal, cefaleia e aumento do índice de apnéia-hipopnéia são comumente relatados em pacientes recebendo ENV cervical^11,12. A redução da força de estimulação é uma estratégia comum para reduzir esses efeitos colaterais, porém a redução da carga pode limitar a eficácia da terapia com ENV por não ativar as fibras terapêuticas¹¹. Em apoio a essa hipótese, a taxa de resposta de pacientes que receberam estimulação de alta intensidade para o tratamento da epilepsia foi maior do que a de pacientes que receberam estimulação de baixa intensidade¹³.

A ENV abdominal é aplicada sobre o nervo vago subdiafragmático, acima dos ramos hepático e celíaco¹⁴ (Figura 1). Nosso estudo prévio demonstrou que a ENV abdominal de ratos não causa efeitos colaterais cardíacos ou respiratórios associados à ENV cervical¹⁰. Estudos anteriores também demonstram efeitos anti-inflamatórios da ENV abdominal em um modelo de doença inflamatória intestinal e artrite reumatoide^{em ratos10,15}, bem como redução da glicemia em um modelo de diabetes tipo 2 em^ratos16. Recentemente, a tecnologia VNS abdominal foi traduzida para um ensaio clínico inédito em humanos para o tratamento da doença inflamatória intestinal (NCT05469607).

O arranjo de eletrodos de nervo periférico usado para fornecer estimulação ao nervo vago abdominal (WO2019095020¹⁷) foi desenvolvido sob medida para uso em ratos e é composto por dois a três pares de eletrodos de platina colocados a 4,7 mm de distância, apoiados por um manguito de elastômero de silicone de grau médico, uma aba de sutura para ancorar a matriz ao esôfago, um fio de chumbo e um conector percutâneo a ser montado na região lombar (Figura 2). O fio de chumbo é tunelizado sob a pele do lado esquerdo do animal. O design de múltiplos pares de eletrodos permite a estimulação elétrica do nervo, bem como o registro de potenciais de ação compostos evocados eletricamente (ECAPs), o que confirma a colocação correta do implante no nervo e as intensidades de estimulação supralimiares. A ENV abdominal é bem tolerada em ratos que se movem livremente por meses 10,15,16. Isso permite avaliar sua eficácia em modelos de doenças.

Este manuscrito descreve os métodos de esterilização por arranjo de eletrodos, cirurgia de implante do nervo vago abdominal e estimulação crônica e registro de ECAPs em ratos acordados para estudar a eficácia da ENV abdominal em uma variedade de modelos de doenças. Esses métodos foram originalmente desenvolvidos para estudar a eficácia da ENV abdominal em modelo de doença inflamatória intestinal em^ratos10 e também foram usados com sucesso para um modelo de artrite reumatoide em^ratos15 e^diabetes16.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do St. Vincent's Hospital (Melbourne) e seguiram o Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (National Health and Medical Research Council of Australia) e o Prevention of Cruelty to Animals (1986) Act. No total, 24 ratas da raça Dark Agouti (8-9 semanas de idade) foram utilizadas para este estudo. Os grupos experimentais consistiram de: uma coorte normal (n = 8) que não recebeu injeção de colágeno ou implante de ENV; uma coorte de doenças não estimuladas (n = 8) que recebeu implante e injeção de colágeno (não foram realizados testes eletrofisiológicos); e uma coorte de doença estimulada (n = 8) que recebeu implante, injeção de colágeno, testes eletrofisiológicos e terapia com ENV. A cirurgia de implante ocorreu 5 dias antes da injeção de colágeno, e a habituação à terapia com ENV iniciou-se 4 dias após a injeção de colágeno e ocorreu ao longo de 7 dias. A terapia com ENV foi aplicada do dia 11 ao 17 (inclusive) após a injeção de colágeno¹⁵. Para a coorte de doença estimulada, o teste eletrofisiológico foi realizado imediatamente após a cirurgia de implante sob anestesia, no dia da injeção de colágeno, 10 dias após a injeção de colágeno e no dia do término (17 dias após a injeção de colágeno).

1. Sonicação e esterilização de arranjo de eletrodos

1. Ajuste o limpador ultra-sônico para uma frequência de 80 kHz e encha o tanque ultra-sônico com água da torneira. Submergir o conjunto de eletrodos na solução de limpeza em um recipiente plástico limpo e colocá-lo no tanque ultrassônico.
   NOTA: A solução de limpeza e o tempo de sonicação a ser usado para cada etapa estão resumidos na Tabela 1. Use um recipiente limpo para cada etapa.
2. Coloque o conjunto de eletrodos sonicados, em um saco de esterilização, usando pinças limpas, sonicadas com solução de limpeza líquida a 0,5% em água destilada e enxaguadas em água destilada. Autoclave o conjunto de eletrodos por 45 min com temperatura máxima de 130 °C e deixe secar em uma bancada limpa.

2. Implante de arranjo de eletrodos no nervo vago abdominal

OBS: Neste estudo foram utilizadas ratas de cutia escura (8-9 semanas de idade)¹⁵. Também utilizamos com sucesso este protocolo para implantar cronicamente ratos machos adultos da raça Sprague-Dawley (10-14 semanas de idade)^10,16. A cirurgia é realizada em condições assépticas, e todos os instrumentos, arranjo de eletrodos e consumíveis como gazes e pontas de algodão são esterilizados por autoclavagem.

1. Anestesiar o rato em câmara de indução utilizando isoflurano a 3% e oxigênio a 1 L/min. Uma vez que não haja reflexo do pedal para pinçar os dedos, mova o rato para o tapete de calor com um termostato na mesa cirúrgica e coloque uma máscara de isoflurano sobre o nariz.
2. Monitorar a frequência respiratória e a temperatura retal durante toda a cirurgia e ajustar o nível de isoflurano entre 1,5% e 2,5% para manter a frequência respiratória entre 40 a 62 incursões respiratórias por minuto. Ajuste a configuração da esteira térmica, se necessário, para manter a faixa de temperatura retal entre 35,9 - 37,5 °C.
3. Administrar analgesia pré-medicação por via subcutânea com seringas de 1 mL com agulhas 25G (carprofeno 5 mg/kg e buprenorfina 0,03 mg/kg por via subcutânea) antes do início da cirurgia.
4. Faça a barba generosamente ao redor do local da incisão, incluindo a área ao longo da linha média ventral desde o processo xifoide até o final da caixa torácica, o aspecto lombar do dorso ao longo da linha média dorsal e o lado esquerdo do corpo entre o membro anterior e o membro posterior para permitir a tunelização subcutânea da matriz.
5. Limpar os locais cirúrgicos em movimento circular três vezes com rodadas alternadas de betadina e álcool e colocar um pano cirúrgico sobre o animal. Administrar bupivacaína (1-2 mg/kg) por via subcutânea com seringa de 1 mL com agulha 25G nos locais de incisão dorsal e ventral.
6. Colocar o animal em decúbito ventral e fazer uma incisão de 2 cm de comprimento no dorso onde o pedestal percutâneo será ancorado com lâmina de bisturi.
7. Vire o rato para decúbito dorsal e faça uma incisão de 3 cm na pele ao longo da linha média, logo abaixo do processo xifoide, usando uma lâmina de bisturi. Segure a pele perto do local da incisão e, usando uma tesoura dissecante, disseque a camada de pele da camada muscular ao redor da incisão.
8. Para permitir a tunelização subcutânea da matriz do pedestal até o local de implantação, colocar o animal do lado direito, inserir um hemostático da incisão ventral e dissecar rombo em direção ao local da incisão dorsal. Corte a borda de uma tampa de agulha e insira o arranjo de eletrodos para protegê-la durante o trânsito (Figura 1B). Usando as mãos (use luvas estéreis), tunelize o arranjo de eletrodos sob a pele em direção à incisão ventral.
9. Para acessar o esôfago e o nervo vago, coloque o animal em decúbito dorsal novamente. Faça uma incisão de 3 cm na camada muscular ao longo da linha média abaixo do processo xifoide, grande o suficiente para expor todo o comprimento do fígado. Evite danificar o fígado durante esta etapa.
10. Fazer uma incisão menor (menor que 1 cm) na camada muscular lateralmente (lado esquerdo do animal) à incisão ventral principal. Túnel do arranjo de eletrodos através desta pequena incisão usando a tampa da agulha usada no passo 2.8 para inserir o arranjo na cavidade abdominal.
    OBS: Este passo reduz a tensão aplicada no local principal da incisão e reduz o risco de ruptura das suturas.
11. Retraia a pele e as camadas musculares para manter a cavidade abdominal aberta. Certifique-se de manter os tecidos úmidos usando pontas de algodão e gaze embebida em soro fisiológico estéril para manipular o tecido.
12. Retraia suavemente o fígado cortando o tecido conjuntivo ao seu redor usando uma tesoura de Vannas e colocando um afastador sobre um pequeno pedaço de gaze embebido em soro fisiológico para proteção. Retrair suavemente o estômago, para permitir o endireitamento do esôfago e do nervo vago sobrejacente, colocando um afastador entre o esôfago e o estômago.
    OBS: Os afastadores são feitos arredondando a extremidade pontiaguda dos anzóis.
13. Após exposição da superfície ventral do esôfago, identificar o nervo vago abdominal e seus subramos, incluindo o nervo hepático, o nervo celíaco e dois ramos gástricos (Figura 1D).
14. Cortar o tecido conjuntivo que prende o nervo vago abdominal ao esôfago usando pinça fina e tesoura de Vannas e dissecar o comprimento do nervo logo acima dos ramos hepático e celíaco em direção ao diafragma. Certifique-se de não rasgar, esticar ou beliscar o nervo. Coloque um arranjo de eletrodos ao lado do nervo para confirmar que o comprimento suficiente do nervo está separado do tecido conjuntivo para se ajustar ao arranjo.
15. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido limpo ao redor do nervo, passe as suturas de seda (7-0) no lado do eletrodo do manguito sob o nervo. Abra o manguito da matriz e coloque o nervo cuidadosamente no canal da matriz.
16. Certifique-se de que todo o comprimento do nervo fique dentro do canal de matriz. Amarre as suturas ao redor do manguito para fechar firmemente o manguito para garantir que o nervo não escorrege para fora do canal. Aparar as suturas.
17. Usando sutura de seda 7-0, suture a aba da matriz no esôfago para fixar a matriz no lugar e evitar que ela torça. Evite danificar os outros ramos do nervo vago ou inserir agulha muito profunda no músculo liso do esôfago.
18. Remova suavemente os afastadores e certifique-se de que toda a gaze foi removida da cavidade abdominal. Administrar 1-2 mL de soro fisiológico estéril aquecido usando uma seringa de 1 mL na cavidade abdominal e reposicionar o fígado na posição correta.
19. Fechar a camada muscular com fio de seda 3-0 usando a técnica de sutura simples em execução, fazendo nós quadrados seguros com pelo menos 3 arremessos em ambas as extremidades. Os pontos espaciais estão intimamente unidos (aproximadamente 3 mm de distância) para evitar complicações como hérnia/protrusão do processo xifoide.
20. Use sutura para fechar a incisão do peritônio juntamente com a incisão da camada muscular, para reduzir a chance de adesão tecidual.
21. Com sutura absorvível (Vicryl 4-0), fechar a incisão na pele. Use uma técnica de sutura enterrada, como a sutura vertical enterrada em corrida ou a sutura dérmica enterrada em execução para evitar que o animal remova a sutura.
22. Virar o animal para decúbito ventral e, com tesoura, estender a incisão dorsal para 4-5 cm e dissecar rombo entre o músculo e a camada de pele ainda mais para que a base conectora do conector percutâneo possa ficar plana na camada muscular.
23. Usando fio de seda 3-0, faça 6 a 8 suturas simples interrompidas ao redor da base do conector para prendê-la à camada muscular inferior. Fechar a incisão da pele com fio de seda 3-0, utilizando a técnica de sutura horizontal do colchão, garantindo nós quadrados seguros com pelo menos 3 arremessos.
    NOTA: Nesta etapa, as suturas trançadas em seda são preferidas por sua facilidade de manuseio e sua capacidade de criar nós mais seguros em comparação com as suturas monofilamentares.
24. Ao término da cirurgia, administrar solução de Hartmann por via subcutânea (1 mL/100 g/h). Desligue o isoflurano e deixe o animal se recuperar em uma esteira térmica enquanto o oxigênio passa (1,5 L/min). Uma vez que o rato esteja consciente e totalmente móvel, devolva o rato à sua gaiola de origem, colocado em uma almofada térmica, até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
25. Observe atentamente a recuperação do animal do isoflurano e certifique-se de que ele tenha acesso a alimentos e bebidas. Nos próximos dois dias, administrar analgesia pós-cirúrgica por via subcutânea (carprofeno 5 mg/kg, diariamente) para aliviar a dor. Monitorar o animal pelo menos 2x por dia e verificar se há evidências de defecação, qualidade da pelagem, nível de atividade e presença de qualquer inchaço ou descarga das feridas cirúrgicas.
26. Registre o peso do animal e, no caso raro de o animal perder 10% ou mais, inicie o tratamento intensivo. O tratamento intensivo inclui a administração subcutânea de fluidos (solução de Hartmann, 2x 10 mL) por dia, fornecendo alimentos adicionais, como vegetais frescos e suplemento de gel dietético, e colocando metade da gaiola em uma almofada térmica com um termostato para calor extra. Aumente a frequência de monitoramento até que o animal se recupere. Continue com a administração de analgesia (carprofeno 5 mg/kg, SQ, diariamente), se necessário, com base em uma escala de Grimace.

3. Testes eletrofisiológicos

NOTA: O registro de potenciais de ação compostos evocados (ECAPs) confirma a colocação apropriada do arranjo de eletrodos no nervo vago. Além disso, o registro de ECAPs usando o arranjo de eletrodos descrito acima fornece provável confirmação da ativação elétrica das fibras C vagais e da ENV supralimiar^10,15.

1. Meça a impedância do solo comum dos eletrodos para avaliar sua integridade e detectar quaisquer circuitos abertos ou curtos de fios antes de gravar ECAPs. Os eletrodos do nervo vago abdominal funcionantes in vivo devem ter valores de impedância entre 4 - 20 kΩ.
2. Testar animais enquanto anestesiados, ou seja, imediatamente após a cirurgia, ou acordados e em movimento livre. Realizar testes acordados pelo menos 2-3 dias após a cirurgia para permitir que as feridas cirúrgicas da pele cicatrizem e estabilizem. Reunir os equipamentos necessários para testes de impedância e eletrofisiológicos, que incluem um estimulador personalizado, um dispositivo de aquisição de dados, um amplificador diferencial isolado e um software de aquisição e análise de dados, conforme listado na Tabela de Materiais.
3. Enrole o animal em uma toalha, se necessário, conecte um cabo ao conector percutâneo traseiro e conecte a outra extremidade do cabo a um estimulador. Para testar a impedância do solo comum dos eletrodos, aplique pulsos de corrente bifásica (100 μs por fase e corrente de 107 μA) entre o eletrodo de interesse e todos os outros eletrodos do conjunto.
4. Meça a tensão de pico no final da primeira fase da forma de onda de tensão (V_total) e calcule a impedância total (Z_total) usando a lei de Ohm (Z = tensão/corrente).
5. Conecte um par de eletrodos ao estimulador e um par de eletrodos ao equipamento de gravação e aplique estimulação bipolar para gerar ECAPs usando o eletrodo de referência do implante VNS colocado sob a pele como referência para o registro diferencial de ECAPs. Faça dois conjuntos de registros, em média, de um total de 50 repetições utilizando o software de aquisição e análise de dados.
6. Use as configurações a seguir para medições.
   Correntes: 0 a 2 mA em incrementos de 0,1 mA;
   Largura de pulso: 25 - 200 μs;
   Gap interfásico: 8 - 50 μs;
   Taxa de estimulação: 10 - 30 pulsos/s;
   Taxa de amostragem: 100 kHz;
   Filtro: Passa-alta 200 Hz, passa-baixa 2000 Hz, ganho de tensão 1 x 10².
7. Utilizando o software de análise de dados, analise a resposta do ECAP medindo a tensão pico-a-pico das formas de onda dentro da janela de análise (4 - 10 ms pós-estímulo, indicado pelo sombreamento na Figura 3A,B). O limiar do ECAP é definido como a intensidade mínima da corrente de estímulo que produz uma amplitude de resposta de pelo menos 0,1 μV_pico-pico em ambos os conjuntos de registros eletrofisiológicos médios. Uma resposta válida será repetida para pelo menos dois níveis de corrente acima do limiar, e não presente para pelo menos dois níveis de corrente abaixo do limiar^10,15.

4. ENV abdominal crônica em ratos acordados

NOTA: A ENV abdominal pode ser aplicada em animais acordados uma vez que a ferida cirúrgica ao redor do conector percutâneo tenha cicatrizado e estabilizado. Para reduzir qualquer resposta ao estresse e permitir uma melhor coleta de dados, os animais são habituados ao ambiente de manuseio e estimulação dos testadores, uma hora por dia durante sete dias antes da cirurgia de implante e início da terapia com ENV.

1. Medir a impedância de cada eléctrodo conforme descrito no passo 3.4, antes da aplicação de qualquer ENV. Certifique-se de que a impedância dos eletrodos estimuladores esteja abaixo de 20 kΩ.
2. Conecte um cabo ao conector percutâneo traseiro e conecte a outra extremidade do cabo a um estimulador programado para aplicar estimulação apropriada (por exemplo, 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs de largura de pulso com intervalo de interfase de 50 μs, 30 s ON, 2,5 min off¹⁵) e ligue o estimulador.
   NOTA: Embora os animais sejam frequentemente observados adormecendo durante a estimulação, se adequadamente habituados, use um cabo com material externo protetor, como bobinas de aço, sempre que possível, para evitar que ele seja mastigado.
3. Observe o animal no início de cada sessão de terapia com ENV para garantir que não haja nenhuma reação adversa, como tosa excessiva ou aumento/diminuição súbita do nível de atividade em sincronia com o momento da estimulação.
4. Monitore a cada 30 min para verificar se há torção ou desconexão do cabo. Para aplicar a ENV cronicamente (por exemplo, 3 h por dia durante 7 dias¹⁵), repita as etapas 4.1-4.3 no início de cada sessão.
   NOTA: O uso de um comutador pode reduzir a chance de os cabos ficarem trançados e pode exigir monitoramento menos frequente.

Resultados

O registro dos potenciais de ação compostos evocados (ECAPs, Figura 3A,B) imediatamente após a cirurgia é uma técnica que pode ser usada para ajudar a confirmar o posicionamento correto do nervo dentro do canal do array e que a estimulação é eficaz na ativação do nervo vago.

Na Figura 3, ratas de cutia escura (8-9 semanas de idade) foram implantadas com o arranjo de eletrodos VNS. Nos ratos selecionados alea...

Discussão

Este método de cirurgia de implante de ENV abdominal e estimulação crônica do nervo vago e registro de ECAPs tem sido usado com sucesso e bem tolerado por 5 semanas em ratos após o implante 10,15,16. A retração do estômago, fígado e intestino para obter uma boa visão do esôfago e do nervo vago é um dos principais passos na cirurgia. Uma vez que esses órgãos são retraídos, o nervo vago torna-se acessível. A retra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Briemarpak	SC3050
Baytril	Bayer
Betadine	Sanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (Buprenorphine)	Jurox
Data acquisition device	National Instruments	USB-6210
DietGel Boost (dietary gel supplement)	ClearH2O
Dumont tweezer, style 5	ProSciTech	T05-822
Dumont tweezer, style N7, self-closing	ProSciTech	EMS72864-D
Elmasonic P sonicator	Elma
Hartmann's solution	Baxter	AHB2323
Hemostat	ProSciTech	TS1322-140
HPMC/PAA Moisturising Eye Gel	Alcon
Igor Pro-8 software	Wavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)	Zoetis
Isolated differential amplifier	World Precision Instruments	ISO-80
Liquid pyroneg	Diversey	HH12291	cleaning solution
Marcaine (Bupivacaine)	Aspen
Plastic drape	Multigate	22-203
Rat vagus nerve implant	Neo-Bionica
Rimadyl (Carprofen)	Zoetis
Silk suture 3-0	Ethicon
Silk suture 7-0	Ethicon
SteriClave autoclave	Cominox	24S
Sterile disposable surgical gown	Zebravet	DSG-S
Suicide Nickel hooks	Jarvis Walker
Ultrapure water	Merck Millipre	Milli-Q Direct
Underpads	Zebravet	UP10SM
Vannas scissors	ProSciTech	EMS72933-01
Vicryl suture 4-0	Ethicon