评估植物中典型三唑类农药代谢物的细胞毒性

摘要

该方案描述了一种评估植物中三唑类农药代谢物的整体细胞毒性的新方法。

摘要

由于人为活动，各种有机污染物已释放到环境中。这些污染物可被农作物吸收，对整个食物链中的生态系统和人类健康造成潜在威胁。植物中污染物的生物转化会产生许多代谢物，这些代谢物可能比其母体化合物更具毒性，这意味着在毒性评估过程中应考虑这些代谢物。然而，植物中污染物的代谢产物极其复杂，难以全面获取所有代谢产物的毒理信息。本研究提出了一种策略，通过在毒理学试验中将植物污染物代谢物作为一个整体进行处理来评估植物中污染物代谢物的整体细胞毒性。三唑类杀虫剂是一类广谱杀菌剂，在农业生产中得到了广泛的应用。它们在农田中的残留物污染引起了越来越多的关注。因此，选择氟西拉唑、二氯唑、戊唑醇和丙环唑 4 种三唑类农药作为供试污染物。代谢物是通过用测试的三唑类杀虫剂处理胡萝卜愈伤组织产生的。处理 72 小时后，提取胡萝卜愈伤组织中农药的代谢物，然后使用 Caco-2 细胞系进行毒理学测试。结果显示，供试农药在胡萝卜愈伤组织中的代谢物对Caco-2细胞的活力没有显著抑制作用（P>0.05），表明农药代谢物没有细胞毒性。这种提出的方法为评估植物中污染物代谢物的细胞毒性开辟了一条新途径，有望为精确毒性评估提供有价值的数据。

引言

生长在农田中的农作物可能会接触到源自人为活动的各种有机污染物 ^1,2。污染物可被植物吸收，通过食物链进一步对生态系统和人类健康构成威胁 ^3,4。植物中的外源性物质可能经历了一系列生物转化，例如 I 期和 II 期代谢⁵，产生许多代谢物。根据植物中的绿肝概念，植物代谢可以降低外源性物质的毒性 ^6,7。然而，已经揭示一些代谢物的毒性可能高于其父母的毒性。例如，四溴双酚 A 的脱溴产物 （TBBPA） 和双酚 A 的 O 甲基化产物 （BPA） 已被证明比它们的亲本毒性大得多 ^8,9，^脱溴和 O 甲基化构成了植物中主要的 I 期代谢途径。因此，仅基于植物中污染物母体的毒性评估并不准确，而应考虑相应的代谢物。

植物中外源性物质的代谢产物极其复杂^10,11

研究方案

1. 胡萝卜愈伤组织的区分

注意：胡萝卜愈伤组织分化的详细方案已在之前的研究中描述^{过 12}。下面是一个简短的描述。

1. 用 75% 乙醇对春化种子的表面消毒 20 分钟，然后用 20% H₂O₂ 消毒 20 分钟。用蒸馏水洗涤至少 3 次。
2. 将种子播种在无激素琼脂凝胶（1%w / v）Murashige和Skoog（MS）培养基（pH = 5.8，在121°C高压灭菌）上，并在26°C下在16小时光周期（350μmol/m^2s）下孵育15天以形成幼苗。
3. 通过将幼苗的下胚轴和子叶切成小块（0.5 cm）来收获外植体，并将外植体在含有 1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸的生长酮和 0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤的植物激肽的 MS 培养基中在 26°C 下在黑暗中孵育 3-4 周以诱导愈伤组织。
4. 用手术刀和镊子收集愈伤组织（直径约 1 厘米，紧凑）。

2. 用农药处理胡萝卜愈伤组织

1. 将氟西拉唑、二康唑、戊唑醇和丙环唑各 10 mg 溶解在 100 mL 终浓度为 100 m....

讨论

该方案旨在通过结合植物愈伤组织和人类细胞模型来评估植物中三唑类农药代谢物的整体细胞毒性。该拟议方案的关键步骤是植物愈伤组织和 Caco-2 细胞的培养。我们之前的研究¹² 中提供了植物愈伤组织培养最困难的部分和相关建议。这里需要注意的是，细胞维持是 Caco-2 细胞培养最困难的部分，因为细胞很容易感染。因此，重要的是要确保细胞测试中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010