评估植物中典型三唑类农药代谢物的细胞毒性

摘要

该方案描述了一种评估植物中三唑类农药代谢物的整体细胞毒性的新方法。

摘要

由于人为活动，各种有机污染物已释放到环境中。这些污染物可被农作物吸收，对整个食物链中的生态系统和人类健康造成潜在威胁。植物中污染物的生物转化会产生许多代谢物，这些代谢物可能比其母体化合物更具毒性，这意味着在毒性评估过程中应考虑这些代谢物。然而，植物中污染物的代谢产物极其复杂，难以全面获取所有代谢产物的毒理信息。本研究提出了一种策略，通过在毒理学试验中将植物污染物代谢物作为一个整体进行处理来评估植物中污染物代谢物的整体细胞毒性。三唑类杀虫剂是一类广谱杀菌剂，在农业生产中得到了广泛的应用。它们在农田中的残留物污染引起了越来越多的关注。因此，选择氟西拉唑、二氯唑、戊唑醇和丙环唑 4 种三唑类农药作为供试污染物。代谢物是通过用测试的三唑类杀虫剂处理胡萝卜愈伤组织产生的。处理 72 小时后，提取胡萝卜愈伤组织中农药的代谢物，然后使用 Caco-2 细胞系进行毒理学测试。结果显示，供试农药在胡萝卜愈伤组织中的代谢物对Caco-2细胞的活力没有显著抑制作用（P>0.05），表明农药代谢物没有细胞毒性。这种提出的方法为评估植物中污染物代谢物的细胞毒性开辟了一条新途径，有望为精确毒性评估提供有价值的数据。

引言

生长在农田中的农作物可能会接触到源自人为活动的各种有机污染物 ^1,2。污染物可被植物吸收，通过食物链进一步对生态系统和人类健康构成威胁 ^3,4。植物中的外源性物质可能经历了一系列生物转化，例如 I 期和 II 期代谢⁵，产生许多代谢物。根据植物中的绿肝概念，植物代谢可以降低外源性物质的毒性 ^6,7。然而，已经揭示一些代谢物的毒性可能高于其父母的毒性。例如，四溴双酚 A 的脱溴产物 （TBBPA） 和双酚 A 的 O 甲基化产物 （BPA） 已被证明比它们的亲本毒性大得多 ^8,9，^脱溴和 O 甲基化构成了植物中主要的 I 期代谢途径。因此，仅基于植物中污染物母体的毒性评估并不准确，而应考虑相应的代谢物。

植物中外源性物质的代谢产物极其复杂^10,11，因此难以全面识别和分离它们。此外，只能获得少数已鉴定代谢物的标准品。因此，无法获得所有代谢物的毒理学数据，这阻碍了全面的毒性评估。本研究提出了一种在毒理学试验中将植物污染物代谢物作为一个整体进行处理来评估植物中污染物综合毒性的策略，为植物中污染物的精确毒性评估提供了新的数据。我们以前的研究表明，植物愈伤组织培养为获得植物外源性代谢物开辟了一条简单有效的途径¹²。因此，本研究采用植物愈伤组织培养物产生植物中污染物的代谢物，然后使用人类细胞系进行化学提取和毒理学测试。肠道是暴露于动物和人类的外源性物质的直接靶器官之一。Caco-2 细胞系已被证明是体外研究外源性物质肠道行为和毒性的最佳模型 13,14,15。因此，本研究选择了 Caco-2 细胞模型。

三唑类杀虫剂是一类广谱杀菌剂，已在农业生产中得到广泛应用¹⁶。它们在农田中的残留物污染引起了越来越多的关注^17,18。这里选择了氟西拉唑、二氯唑、戊唑醇和丙环唑四种常用的三唑类农药作为典型污染物。在本研究中，胡萝卜被选为新鲜即食蔬菜的代表性植物。胡萝卜愈伤组织最初暴露于浓度为 100 mg/L 的测试农药中。暴露 72 小时后，提取代谢物，使用 Caco-2 细胞系评估细胞毒性。该方法可以很容易地扩展到评估植物中其他类型污染物的代谢物的整体细胞毒性。

研究方案

1. 胡萝卜愈伤组织的区分

注意:胡萝卜愈伤组织分化的详细方案已在之前的研究中描述^{过 12}。下面是一个简短的描述。

1. 用 75% 乙醇对春化种子的表面消毒 20 分钟，然后用 20% H₂O₂ 消毒 20 分钟。用蒸馏水洗涤至少 3 次。
2. 将种子播种在无激素琼脂凝胶（1%w / v）Murashige和Skoog（MS）培养基（pH = 5.8，在121°C高压灭菌）上，并在26°C下在16小时光周期（350μmol/m^2s）下孵育15天以形成幼苗。
3. 通过将幼苗的下胚轴和子叶切成小块（0.5 cm）来收获外植体，并将外植体在含有 1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸的生长酮和 0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤的植物激肽的 MS 培养基中在 26°C 下在黑暗中孵育 3-4 周以诱导愈伤组织。
4. 用手术刀和镊子收集愈伤组织（直径约 1 厘米，紧凑）。

2. 用农药处理胡萝卜愈伤组织

1. 将氟西拉唑、二康唑、戊唑醇和丙环唑各 10 mg 溶解在 100 mL 终浓度为 100 mg/L（pH 值为 5.6-7.0）的无菌 MS 培养基中。
   注:选择供试农药的处理浓度作为 Caco-2 细胞的 50% 细胞生长抑制浓度 （IC₅₀） 的最大值。
2. 在无菌条件下，在玻璃瓶中混合 3 g 胡萝卜愈伤组织（来自步骤 1.4）与 10 mL 准备好的农药溶液（来自步骤 2.1）。
3. 在无菌条件下，在玻璃瓶中将 3 g 胡萝卜愈伤组织（来自步骤 1.4）与 10 mL 无菌 MS 培养基混合。
   注意:所有玻璃瓶均经过高压灭菌。
4. 将胡萝卜愈伤组织（来自步骤 2.2 和 2.3）在黑暗中以 130 rpm 和 26 °C 孵育 72 小时。
   将所有处理一式三份。
5. 孵育 72 小时后，通过使用玻璃纤维过滤器 （0.45 μm） 过滤，从培养基中收集胡萝卜愈伤组织。用超纯水清洗愈伤组织 3 次。
6. 使用冷冻干燥机在 -55 °C 下冷冻干燥愈伤组织，然后使用 70 Hz 的高通量组织研磨机将其均质化 3 分钟。

3. 胡萝卜愈伤组织的化学提取

1. 在离心管 （10 mL） 中将 0.2 g 冻干愈伤组织研磨粉末与 3 mL 乙腈混合。
2. 涡旋离心管 8 分钟，然后超声处理 5 分钟（150 W，40 kHz）。
3. 在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 10 分钟后，通过移液收集上清液。
4. 重复提取程序 3 次，并将提取物混合在干净的离心管 （10 mL） 中。
5. 使用 40 °C 的氮气吹浓浓缩器将混合的提取物浓缩至干燥。
6. 用 1 mL 含 0.3% 二甲基亚砜 （DMSO） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 重新溶解提取物残留物（来自步骤 3.5）。
   注意:步骤 3.6 中的残留物是从经农药处理的愈伤组织提取物中获得的（来自步骤 2.2）。
7. 用 1 mL 含 0.3% DMSO 的 DMEM 重新溶解提取物残留物（来自步骤 3.5），并将 1 mg 氟西拉唑、二氯唑、戊唑醇和丙环唑分别溶解在 4 个不同的试管中。
   注意:步骤 3.7 中的残留物是从空白愈伤组织的提取物中获得的（来自步骤 2.3）。
   注:DMEM 由 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 抗生素（青霉素和链霉素）制备。

4. Caco-2 细胞复苏

注:将 Caco-2 细胞测试中涉及的所有试剂和材料高压灭菌 20 分钟，并在紫外光下灭菌 2 小时。

1. 从液氮罐中取出冻存管（储存冷冻细胞），并迅速将其转移到 37 °C 的水浴中。 不断摇晃以解冻冷冻溶液。
   注意:摇晃时，请避免水流过冻存管的盖子。
2. 冷冻溶液解冻后，用 75% 酒精对冻存管表面进行消毒。通过移液将细胞溶液快速转移到无菌离心管中。
3. 在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 3 分钟后，除去冷冻保存管中的上清液。加入 1 mL DMEM，轻轻敲击和摇动以悬浮细胞。
4. 通过移液将细胞悬液（来自步骤 4.3）转移到玻璃瓶中。在玻璃瓶中加入 5 mL DMEM，轻轻摇动玻璃瓶以均匀分布细胞。
5. 将细胞置于 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中孵育。
   注:步骤 4.2-4.4 在超级干净的工作台中执行。

5. Caco-2 细胞的传代

1. 从培养箱中取出玻璃瓶，当细胞密度达到 80% 以上时丢弃培养基。用 PBS 3x 洗涤细胞。
2. 加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液并均匀铺展，以确保与细胞完全接触。
3. 当细胞从粘附形状收缩到小圆点并且在显微镜观察下没有悬浮时（100 倍放大）去除消化液。轻轻敲击培养瓶壁以去除细胞。
4. 加入 2 mL DMEM，重复冲洗培养瓶壁 10 次，轻轻敲击培养瓶壁，然后将 1 mL 细胞悬液转移至另一个玻璃培养瓶中。
5. 将 5 mL DMEM 加入玻璃瓶中。轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分布。
6. 将细胞在培养箱中于 37 °C 和 5% CO₂ 孵育。每 24 小时用新鲜的 DMEM 更换培养基，直到细胞密度达到 80% 以上。
7. 重复细胞传代程序，直到收获足够的细胞（约 2 x 10⁶）用于以下暴露测试。
   注意:步骤 5.1-5.5 在超净工作台中执行。通过血细胞计数器测定细胞数¹⁹。

6. Caco-2 细胞的暴露

1. 从培养箱中取出玻璃瓶（来自步骤 5.7），然后重复步骤 5.1-5.4 以收集细胞。
2. 轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分布，并将细胞悬液转移至离心管 （15 mL） 中。
3. 用 DMEM 结合细胞术稀释细胞悬液（从步骤 6.2 开始），以达到大约 1 x 10⁵ 个细胞/mL 的细胞密度。轻轻敲击培养瓶壁，使细胞均匀分布。
4. 在 96 孔板的外孔中加入 100 μL PBS，以防止由于边缘效应而导致培养基蒸发。
   注:不断敲击离心管壁以保持细胞悬液均匀。
5. 在 96 孔板的左孔中加入 100 μL 细胞悬液（来自步骤 6.3），静置 10 分钟。
6. 将细胞在培养箱中于 37 °C 和 5% CO₂ 孵育 48 小时。
7. 孵育 48 小时后，从培养箱中取出 96 孔板，弃去培养基。
8. 通过在每个孔中加入 100 μL 溶液（来自步骤 3.6）来设置农药代谢物组。
   注意:在步骤 6.8 的每个孔中，都有来自 0.1 mg 父母的农药代谢物。
9. 通过在每个孔中加入 100 μL 溶液（来自步骤 3.7）来设置农药父组以进行比较。
   注意:在步骤 6.9 的每个孔中，有 0.1 mg 农药亲本。
10. 通过在每个孔中加入 100 μL 含 0.3% DMSO 的 DMEM 来设置空白对照。每组使用 6 个孔（步骤 6.8-6.9）。
11. 将细胞在培养箱中于 37 °C 和 5% CO₂ 孵育 24 小时。
    注意:步骤 6.1-6.5 和 6.7-6.10 在超级超净工作台中执行。

7. 细胞活力评估

1. 从培养箱中取出 96 孔板（来自 6.11），并在暴露 24 小时后弃去培养基。用 PBS 2x 洗涤细胞。
2. 在每个孔中加入 100 μL DMEM，然后加入 10 μL CCK-8 试剂。轻轻摇动板以均匀分布细胞。
3. 将细胞在培养箱中于 37 °C 和 5% CO₂ 孵育 4 小时。
4. 孵育 4 小时后从培养箱中取出 96 孔板，并通过荧光分光光度计测量 450 nm 处的吸光度 （OD）。
5. 通过以下公式计算细胞活力:
   细胞活力 （%） =（OD_实验组 - OD_DMEM）/（OD_对照 - OD_DMEM）×100%。
   注意:步骤 7.1-7.2 在超级超净工作台中执行。

结果

图 1 显示了胡萝卜愈伤组织中农药代谢物的生成、提取和细胞毒性评估的拟议方法示意图。 在图 2 中，测试农药的摄取和代谢动力学曲线，从中我们可以发现培养基中农药的浓度呈指数下降，而胡萝卜愈伤组织中的农药浓度开始增加，在 4 或 8 小时达到峰值，然后逐渐降低。这些结果表明，农药可以被胡萝卜愈伤组织快速吸?...

讨论

该方案旨在通过结合植物愈伤组织和人类细胞模型来评估植物中三唑类农药代谢物的整体细胞毒性。该拟议方案的关键步骤是植物愈伤组织和 Caco-2 细胞的培养。我们之前的研究¹² 中提供了植物愈伤组织培养最困难的部分和相关建议。这里需要注意的是，细胞维持是 Caco-2 细胞培养最困难的部分，因为细胞很容易感染。因此，重要的是要确保细胞测试中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010