植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

要約

このプロトコルは、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の総合的な細胞毒性を評価する新しい方法を説明しています。

要約

人為的な活動により、さまざまな有機汚染物質が環境に放出されています。これらの汚染物質は作物に取り込まれ、食物連鎖全体の生態系と人間の健康に潜在的な脅威を引き起こす可能性があります。植物内の汚染物質の生体内変化は、親化合物よりも毒性が高い可能性のある多くの代謝物を生成するため、毒性評価では代謝物を考慮に入れる必要があります。しかし、植物中の汚染物質の代謝物は非常に複雑であり、すべての代謝物の毒性情報を網羅的に取得することは困難です。この研究では、毒物学的試験中に植物全体の汚染物質代謝物を処理することにより、植物中の汚染物質代謝物の総合的な細胞毒性を評価する戦略を提案しました。広域スペクトル殺菌剤の一種であるトリアゾール系農薬は、農業生産に広く適用されています。農地での残留物汚染がますます注目を集めています。したがって、フルシラゾール、ジニコナゾール、テブコナゾール、プロピコナゾールの4つのトリアゾール農薬が試験された汚染物質として選択されました。代謝産物は、試験済みのトリアゾール農薬によるニンジンカルスの処理によって生成されました。.72時間処理した後、ニンジンカルス中の農薬の代謝産物を抽出し、続いてCaco-2細胞株を用いた毒物学的試験を行った。その結果、ニンジンカルス中の試験済み農薬の代謝産物は、Caco-2細胞(P>0.05)の生存率を有意に阻害せず、農薬代謝産物の細胞毒性を示さなかったことが示されました。この提案された方法は、植物中の汚染物質代謝物の細胞毒性を評価するための新しい道を開き、正確な毒性評価のための貴重なデータを提供することが期待されます。

概要

農地で生育する作物は、人為的な活動に由来するさまざまな有機汚染物質にさらされる可能性があります^1,2。汚染物質は植物に取り込まれ、食物連鎖を通じて生態系と人間の健康にさらに脅威を与える可能性があります^3,4。植物の生体異物は、おそらくフェーズIおよびII代謝⁵などの一連の生体内変化を経験し、多数の代謝産物を生成します。植物の緑の肝臓の概念によれば、植物の代謝は生体異物の毒性を減らすことができます^6,7。しかし、一部の代謝産物の毒性は親よりも高い可能性があることが明らかになっています。例えば、テトラブロモビスフェノールAの脱臭素化生成物(TBBPA)とビスフェノールAのO-メチル化生成物(BPA)は、それらの親よりもはるかに毒性が高いことが証明されています^8,9、そして脱臭素化とO-メチル化は、植物の主要な第I相代謝経路を構成しています。したがって、植物の....

プロトコル

1.にんじんカルスの鑑別

注:ニンジンカルスの分化のための詳細なプロトコルは、以前の研究¹²で説明されています。ここでは、その簡単な説明を示します。

1. 春化した種子の表面を75%エタノールで20分間滅菌し、続いて20%H₂O₂ で20分間滅菌します。蒸留水で少なくとも3回洗います。
2. ホルモンフリーの寒天培地(1% w/v)およびSkoog(MS)培地(pH = 5.8、121°Cでオートクレーブ保存)に播種し、26°Cで16時間の光周期(350 μmol/m²s)で15日間インキュベートして苗を作製します。
3. 実生の胚軸と子葉を小片(0.5cm)に切開して外植片を収穫し、1 mg/L 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸のオーキシモンと0.5 mg/L 6-ベンジルアミノプリンのフィトキニンを含むMS培地で26°Cの暗所で3〜4週間インキュベートし、カルスを誘導します。
4. カルス(直径約1cm、コンパクト)をメスと鉗子で集めます。

2.ニンジンカルスの農薬による治療

1. フルシラゾ....

結果

図1 は、ニンジンカルス中の農薬代謝産物の生成、抽出、および細胞毒性評価のための提案方法の概略図を示しています。 図2では、試験した農薬の取り込みと代謝の動態曲線から、培養培地中の農薬の濃度が指数関数的に減少したのに対し、ニンジンカルスの農薬の濃度は増加し始め、4時間または8時間でピークに達し、.......

ディスカッション

このプロトコルは、植物のカルスとヒト細胞モデルを組み合わせることにより、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の不可欠な細胞毒性を評価するために開発されました。この提案されたプロトコルの重要なステップは、植物のカルスとCaco-2細胞の培養です。植物のカルス培養に関する最も難しい部分と相対的なアドバイスは、以前の研究¹²で?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010