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要約

このプロトコルは、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の総合的な細胞毒性を評価する新しい方法を説明しています。

要約

人為的な活動により、さまざまな有機汚染物質が環境に放出されています。これらの汚染物質は作物に取り込まれ、食物連鎖全体の生態系と人間の健康に潜在的な脅威を引き起こす可能性があります。植物内の汚染物質の生体内変化は、親化合物よりも毒性が高い可能性のある多くの代謝物を生成するため、毒性評価では代謝物を考慮に入れる必要があります。しかし、植物中の汚染物質の代謝物は非常に複雑であり、すべての代謝物の毒性情報を網羅的に取得することは困難です。この研究では、毒物学的試験中に植物全体の汚染物質代謝物を処理することにより、植物中の汚染物質代謝物の総合的な細胞毒性を評価する戦略を提案しました。広域スペクトル殺菌剤の一種であるトリアゾール系農薬は、農業生産に広く適用されています。農地での残留物汚染がますます注目を集めています。したがって、フルシラゾール、ジニコナゾール、テブコナゾール、プロピコナゾールの4つのトリアゾール農薬が試験された汚染物質として選択されました。代謝産物は、試験済みのトリアゾール農薬によるニンジンカルスの処理によって生成されました。.72時間処理した後、ニンジンカルス中の農薬の代謝産物を抽出し、続いてCaco-2細胞株を用いた毒物学的試験を行った。その結果、ニンジンカルス中の試験済み農薬の代謝産物は、Caco-2細胞(P>0.05)の生存率を有意に阻害せず、農薬代謝産物の細胞毒性を示さなかったことが示されました。この提案された方法は、植物中の汚染物質代謝物の細胞毒性を評価するための新しい道を開き、正確な毒性評価のための貴重なデータを提供することが期待されます。

概要

農地で生育する作物は、人為的な活動に由来するさまざまな有機汚染物質にさらされる可能性があります1,2。汚染物質は植物に取り込まれ、食物連鎖を通じて生態系と人間の健康にさらに脅威を与える可能性があります3,4。植物の生体異物は、おそらくフェーズIおよびII代謝5などの一連の生体内変化を経験し、多数の代謝産物を生成します。植物の緑の肝臓の概念によれば、植物の代謝は生体異物の毒性を減らすことができます6,7。しかし、一部の代謝産物の毒性は親よりも高い可能性があることが明らかになっています。例えば、テトラブロモビスフェノールAの脱臭素化生成物(TBBPA)とビスフェノールAのO-メチル化生成物(BPA)は、それらの親よりもはるかに毒性が高いことが証明されています8,9、そして脱臭素化とO-メチル化は、植物の主要な第I相代謝経路を構成しています。したがって、植物の汚染物質の親のみに基づく毒性評価は正確ではありませんが、対応する代謝物を考慮に入れる必要があります。

植物中の生体異物の代謝物は非常に複雑であり10,11、それらを包括的に同定して分離することは困難です。さらに、同定された代謝産物のいくつかの基準しか得られません。したがって、すべての代謝産物の毒物学的データは入手できず、包括的な毒性評価が妨げられています。この研究は、毒物学的試験中にそれらを全体として処理することにより、植物中の汚染物質代謝物の総合毒性を評価する戦略を提案し、植物内の汚染物質の正確な毒性評価のための新しいデータを提供しました。私たちの以前の研究では、植物のカルス培養が植物中の生体異物の代謝物を得るためのシンプルで効果的な道を開くことが明らかになりました12。したがって、この研究では、植物カルス培養を使用して植物内の汚染物質の代謝物を生成し、続いてヒト細胞株を使用した化学的抽出と毒物学的試験を行いました。腸管は、動物や人間にさらされる生体異物の直接の標的臓器の1つです。Caco-2細胞株は、in vitro 13,14,15で生体異物の腸内挙動と毒性を調査するための最良のモデルであることが証明されています。したがって、この研究ではCaco-2細胞モデルが選択されました。

広域スペクトル殺菌剤の一種であるトリアゾール系農薬は、農業生産に広く適用されてきた16。農地での彼らの残留汚染は、ますます注目を集めています17,18。ここでは、フルシラゾール、ジニコナゾール、テブコナゾール、プロピコナゾールの4つの一般的に使用されるトリアゾール系農薬を代表的な汚染物質として選択しました。この研究では、ニンジンは新鮮ですぐに食べられる野菜の代表的な植物として選ばれました。ニンジンカルスは、最初に100 mg / Lの濃度で試験された農薬に曝露されました。72時間のばく露後、代謝物を抽出し、Caco-2細胞株を用いて細胞毒性を評価しました。この方法は、植物中の他の種類の汚染物質の代謝産物の総合的な細胞毒性を評価するために容易に拡張できます。

プロトコル

1.にんじんカルスの鑑別

注:ニンジンカルスの分化のための詳細なプロトコルは、以前の研究12で説明されています。ここでは、その簡単な説明を示します。

  1. 春化した種子の表面を75%エタノールで20分間滅菌し、続いて20%H2O2 で20分間滅菌します。蒸留水で少なくとも3回洗います。
  2. ホルモンフリーの寒天培地(1% w/v)およびSkoog(MS)培地(pH = 5.8、121°Cでオートクレーブ保存)に播種し、26°Cで16時間の光周期(350 μmol/m2s)で15日間インキュベートして苗を作製します。
  3. 実生の胚軸と子葉を小片(0.5cm)に切開して外植片を収穫し、1 mg/L 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸のオーキシモンと0.5 mg/L 6-ベンジルアミノプリンのフィトキニンを含むMS培地で26°Cの暗所で3〜4週間インキュベートし、カルスを誘導します。
  4. カルス(直径約1cm、コンパクト)をメスと鉗子で集めます。

2.ニンジンカルスの農薬による治療

  1. フルシラゾール、ジニコナゾール、テブコナゾール、プロピコナゾールをそれぞれ10 mgを、最終濃度100 mg / L(pH 5.6〜7.0)の滅菌MS培地100 mLに溶解します。.
    注:試験した農薬の処理濃度は、Caco-2細胞に対する最大50%の細胞増殖阻害濃度(IC50)として選択されました。
  2. にんじんカルス3g(ステップ1.4から)と調製した農薬溶液10mL(ステップ2.1から)をガラスフラスコに入れて無菌条件下で混合します。
  3. にんじんカルス 3 g (ステップ 1.4 以降) をガラスフラスコ中の無菌 MS 培地 10 mL と混合し、滅菌条件下で行います。
    注:すべてのガラスフラスコはオートクレーブ滅菌済みです。
  4. ニンジンのカルス(ステップ2.2および2.3)を130rpmおよび26°Cで暗所で72時間インキュベートします。
    すべての処理を三重に設定します。
  5. にんじんのカルスを、72時間のインキュベーション後、ガラス繊維フィルター(0.45μm)を用いて濾過することにより、培地から回収します。カルスを超純水で3回洗います。
  6. 凍結乾燥機を使用して-55°Cでカルスを凍結乾燥し、70 Hzのハイスループットティッシュグラインダーを使用して3分間均質化します。

3.ニンジンカルスの化学的抽出

  1. 凍結乾燥カルスの粉砕粉末0.2gを遠心チューブ(10mL)で3mLのアセトニトリルと混合します。
  2. 遠心分離管を8分間ボルテックスし、次に5分間(150 W、40 kHz)超音波処理します。
  3. 8,000 x g 、4°C、10分間遠心分離後、ピペッティングして上清を回収します。
  4. 抽出手順を3回繰り返し、抽出物を清潔な遠心分離チューブ(10 mL)にプールします。
  5. プールした抽出物を、窒素ブロー濃縮器を使用して40°Cで濃縮して乾燥させます。
  6. 抽出物の残渣(ステップ3.5)を、0.3%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むダルベッコ修飾イーグルス培地(DMEM)1 mLで再溶解します。
    注:ステップ3.6の残留物は、農薬処理カルスの抽出物から得られた(ステップ2.2から)。
  7. 抽出物の残渣(ステップ3.5から)を0.3%DMSOを含むDMEM1 mLに再溶解し、フルシラゾール、ジニコナゾール、テブコナゾール、プロピコナゾール1 mgをそれぞれ4つの異なるチューブに溶解します。
    注:ステップ3.7の残留物は、ブランクカルスの抽出物(ステップ2.3から)から得られた。
    注:DMEMは、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質(ペニシリンとストレプトマイシン)で調製しました。

4. Caco-2細胞の蘇生

注:Caco-2細胞試験に関与するすべての試薬および材料を20分間オートクレーブし、紫外線下で2時間滅菌しました。

  1. 凍結保存チューブ(凍結細胞を保管)を液体窒素タンクから取り出し、37°Cのウォーターバスに迅速に移します。 それを絶えず振って凍結溶液を解凍します。
    注意: 振とうするときは、凍結保存チューブのカバーに水が流れないようにしてください。
  2. 凍結溶液が解凍された後、凍結保存チューブの表面を75%アルコールで消毒します。ピペッティングにより、細胞溶液を滅菌遠心チューブに素早く移します。
  3. 1,000 x g 、4°C、3分間遠心分離した後、凍結保存チューブ内の上清を除去します。DMEMを1mL加え、軽くたたいて振とうして細胞を懸濁します。
  4. ピペッティングにより、細胞懸濁液(ステップ4.3)をガラスフラスコに移します。ガラスフラスコに5mLのDMEMを加え、ガラスフラスコを静かに振って細胞を均一に分配します。
  5. インキュベーター内で細胞を37°Cで5%CO2とインキュベートします。
    注:ステップ4.2〜4.4は、スーパークリーンベンチで実行しました。

5. Caco-2細胞の継代

  1. インキュベーターからガラスフラスコを取り外し、細胞密度が80%を超えたら培地を廃棄します。細胞をPBS 3xで洗浄します。
  2. 1 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞と完全に接触するように均一に広げます。
  3. 細胞が付着した形状から小さな丸い点に収縮し、顕微鏡による観察下(100倍倍)で懸濁していないときに、消化液を取り出します。フラスコの壁を軽くたたいて、細胞を取り出します。
  4. 2 mLのDMEMを加え、フラスコ壁のすすぎを10回繰り返し、フラスコ壁を軽くたたいて、1 mLの細胞懸濁液を別のガラスフラスコに移します。
  5. 5 mLのDMEMをガラスフラスコに加えます。.フラスコの壁を軽くたたいて、細胞を均一に分散させます。
  6. インキュベーター内で細胞を37°Cで5%CO2とインキュベートします。細胞密度が80%を超えるまで、24時間ごとに培地を新鮮なDMEMと交換します。
  7. 次の曝露試験のために十分な細胞(約2 x 106)が採取されるまで、細胞継代手順を繰り返します。
    注:ステップ5.1〜5.5は、スーパークリーンベンチで実行しました。細胞数は、血球計算盤19によって決定された。

6. Caco-2細胞の曝露

  1. インキュベーターからガラスフラスコ(ステップ5.7)を取り外し、ステップ5.1〜5.4を繰り返して細胞を回収します。
  2. フラスコの壁を軽くたたいて細胞を均一に分布させ、細胞懸濁液を遠心チューブ(15mL)に移します。
  3. 細胞懸濁液(ステップ6.2以降)をDMEMとサイトメトリーと組み合わせて希釈し、細胞密度が約1 x 105 細胞/mLになるようにします。フラスコの壁を軽くたたいて、細胞を均一に分散させます。
  4. 96ウェルプレートの外側のウェルにPBSを100μL添加し、エッジ効果による培地の蒸発を防ぎます。
    注:遠心分離管の壁を連続的に叩いて、細胞懸濁液を均一に保ちます。
  5. 96ウェルプレートの左ウェルに100 μLの細胞懸濁液(ステップ6.3)を加え、10分間休ませます。
  6. インキュベーター内で細胞を37°Cで5%CO2 とともに48時間インキュベートします。
  7. 48時間のインキュベーション後、96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、培地を廃棄します。
  8. 各ウェルに100 μLの溶液(ステップ3.6から)を添加して、農薬代謝物グループを設定します。
    注:ステップ6.8の各ウェルには、0.1 mgの親から生成された農薬代謝物が含まれていました。
  9. 比較のために各ウェルに100 μLの溶液(ステップ3.7から)を添加して、農薬の親グループを設定します。
    注:ステップ6.9の各ウェルには、0.1 mgの農薬の親がいました。
  10. 各ウェルに 100 μL の DMEM と 0.3% DMSO を添加して、ブランクコントロールを設定します。各グループに 6 つのウェルを使用します (ステップ 6.8-6.9)。
  11. インキュベーター内の細胞を37°Cで5%CO2 と24時間インキュベートします。
    注:ステップ6.1〜6.5および6.7〜6.10は、スーパークリーンベンチで実行しました。

7. 細胞生存率の評価

  1. 96ウェルプレート(6.11から)をインキュベーターから取り外し、24時間の曝露後に培地を廃棄します。細胞をPBS 2xで洗浄します。
  2. 各ウェルに100 μLのDMEMを添加し、次に10 μLのCCK-8試薬を添加します。プレートを静かに振って、細胞を均一に分散させます。
  3. インキュベーター内で細胞を37°Cで5%CO2 とともに4時間インキュベートします。
  4. 4時間のインキュベーション後に96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、蛍光分光光度計で450nmの光吸光度(OD)を測定します。
  5. 細胞生存率を次の式で計算します。
    細胞生存率 (%) = (OD実験群 - ODDMEM) / (ODコントロール - ODDMEM)×100%。
    注:手順7.1〜7.2は、スーパークリーンベンチで実行しました。

結果

図1 は、ニンジンカルス中の農薬代謝産物の生成、抽出、および細胞毒性評価のための提案方法の概略図を示しています。 図2では、試験した農薬の取り込みと代謝の動態曲線から、培養培地中の農薬の濃度が指数関数的に減少したのに対し、ニンジンカルスの農薬の濃度は増加し始め、4時間または8時間でピークに達し、...

ディスカッション

このプロトコルは、植物のカルスとヒト細胞モデルを組み合わせることにより、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の不可欠な細胞毒性を評価するために開発されました。この提案されたプロトコルの重要なステップは、植物のカルスとCaco-2細胞の培養です。植物のカルス培養に関する最も難しい部分と相対的なアドバイスは、以前の研究12で?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(21976160)と浙江省公共福祉技術応用研究プロジェクト(LGF21B070006)の支援を受けて行われました。

     

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dichlorophenoxyacetic acidWAKO1 mg/L
20% H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
6-benzylaminopurineWAKO0.5 mg/L
75% ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500 mL
96-well plateThermo Fisher
AcetonitrileSigma-Aldrich
Artificial climate incubatorNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LtdRDN-1000A-4
AutoclavesSTIKMJ-Series
Caco-2 cellsNuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagentsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute, ChinaG021-1-3
CentrifugeThermo Fisher
CO2 incubatorLabtripHWJ-3-160
Dimethyl sulfoxideSolarbio Life SciencesD8371
Diniconazole, 98.7%J&K Scientific83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's mediumSolarbio Life Sciences11965-500 mL
electronic balanceShanghai Precision Instrument Co., LtdFA1004B
Fetal bovine serumCellmax
Fluorescence spectrophotometerTecanInfinite M200
Flusilazole, 98.5%J&K Scientific85509-19-9  
Freeze dryerSCIENTZ
High-throughput tissue grinderSCIENTZ
Inverted microscopeLeica BiosystemsDMi1
Milli-Q systemMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Skoog mediumHOPEBIOHB8469-7
Nitrogen blowing concentratorAOSHENGMD200-2
PBSSolarbio Life SciencesP1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin LiquidSolarbio Life SciencesP1400-100 mL
Propiconazole, 100%J&K Scientific60207-90-1 
Research plusEppendorf10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking IncubatorsShanghai bluepard instruments Co.,Ltd.THZ-98AB
Tebuconazole, 100%J&K Scientific107534-96-3
Trypsin-EDTA solutionSolarbio Life SciencesT1300-100 mL
Ultrasound machineZKIUC-6
UV-sterilized super clean benchAIRTECH
Vortex instrumentWuxi Laipu Instrument Equipment Co., LtdBV-1010

参考文献

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