Avaliação da citotoxicidade de metabólitos de pesticidas triazólicos típicos em plantas

Resumo

O protocolo descreve um novo método para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas.

Resumo

Vários poluentes orgânicos foram liberados no meio ambiente devido a atividades antrópicas. Esses poluentes podem ser absorvidos pelas plantas cultivadas, causando ameaças potenciais ao ecossistema e à saúde humana em toda a cadeia alimentar. A biotransformação de poluentes em plantas gera uma série de metabólitos que podem ser mais tóxicos do que seus compostos originais, o que implica que os metabólitos devem ser levados em consideração durante a avaliação da toxicidade. No entanto, os metabólitos dos poluentes nas plantas são extremamente complexos, dificultando a obtenção abrangente das informações toxicológicas de todos os metabólitos. Este estudo propôs uma estratégia para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos poluentes em plantas, tratando-os como um todo durante testes toxicológicos. Os pesticidas triazólicos, uma classe de fungicidas de amplo espectro, têm sido amplamente aplicados na produção agrícola. Sua poluição de resíduos em terras agrícolas tem atraído cada vez mais atenção. Assim, quatro pesticidas triazólicos, incluindo flusilazol, diniconazol, tebuconazol e propiconazol, foram selecionados como poluentes testados. Os metabólitos foram gerados pelo tratamento do calo de cenoura com pesticidas triazólicos testados. Após tratamento de 72 h, foram extraídos os metabólitos dos agrotóxicos no calo da cenoura, seguidos de testes toxicológicos utilizando a linhagem celular Caco-2. Os resultados mostraram que os metabólitos dos agrotóxicos testados no calo da cenoura não inibiram significativamente a viabilidade das células Caco-2 (P>0,05), demonstrando não haver citotoxicidade dos metabólitos dos pesticidas. Este método proposto abre um novo caminho para avaliar a citotoxicidade de metabólitos poluentes em plantas, o que deve fornecer dados valiosos para uma avaliação precisa da toxicidade.

Introdução

As plantas cultivadas que crescem em terras agrícolas podem estar expostas a vários poluentes orgânicos provenientes de atividades antrópicas ^1,2. Os poluentes podem ser absorvidos pelas plantas, causando ainda mais ameaças ao ecossistema e à saúde humana por meio das cadeias alimentares ^3,4. Os xenobióticos em plantas provavelmente passam por uma série de biotransformações, como os metabolismos das Fases I e II⁵, gerando uma série de metabólitos. De acordo com o conceito de fígado verde em plan....

Protocolo

1. Diferenciação do calo de cenoura

NOTA: O protocolo detalhado para diferenciação do calo de cenoura foi descrito em um estudo anterior¹². Aqui está uma breve descrição.

1. Esterilize a superfície das sementes vernalizadas com etanol a 75% por 20 min seguido de 20% H₂O₂ por 20 min. Lave o com água destilada pelo menos 3x.
2. Semeie as sementes em meio Murashige e Skoog (MS) gelificado com ágar (1% p/v) sem hormônios (pH = 5,8, autoclavado a 121 ° C) e incube-as sob fotoperíodo de 16 h (350 μmol / m²s) a 26 ° C por 15 di....

Discussão

Este protocolo foi desenvolvido para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas, combinando calos vegetais e modelos de células humanas. As etapas críticas para este protocolo proposto são o cultivo de calos de plantas e células Caco-2. A parte mais difícil e o conselho relativo para a cultura de calos de plantas foram fornecidos em nosso estudo anterior¹². Aqui, deve-se notar que a manutenção celular é a parte .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010