Avaliação da citotoxicidade de metabólitos de pesticidas triazólicos típicos em plantas

Resumo

O protocolo descreve um novo método para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas.

Resumo

Vários poluentes orgânicos foram liberados no meio ambiente devido a atividades antrópicas. Esses poluentes podem ser absorvidos pelas plantas cultivadas, causando ameaças potenciais ao ecossistema e à saúde humana em toda a cadeia alimentar. A biotransformação de poluentes em plantas gera uma série de metabólitos que podem ser mais tóxicos do que seus compostos originais, o que implica que os metabólitos devem ser levados em consideração durante a avaliação da toxicidade. No entanto, os metabólitos dos poluentes nas plantas são extremamente complexos, dificultando a obtenção abrangente das informações toxicológicas de todos os metabólitos. Este estudo propôs uma estratégia para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos poluentes em plantas, tratando-os como um todo durante testes toxicológicos. Os pesticidas triazólicos, uma classe de fungicidas de amplo espectro, têm sido amplamente aplicados na produção agrícola. Sua poluição de resíduos em terras agrícolas tem atraído cada vez mais atenção. Assim, quatro pesticidas triazólicos, incluindo flusilazol, diniconazol, tebuconazol e propiconazol, foram selecionados como poluentes testados. Os metabólitos foram gerados pelo tratamento do calo de cenoura com pesticidas triazólicos testados. Após tratamento de 72 h, foram extraídos os metabólitos dos agrotóxicos no calo da cenoura, seguidos de testes toxicológicos utilizando a linhagem celular Caco-2. Os resultados mostraram que os metabólitos dos agrotóxicos testados no calo da cenoura não inibiram significativamente a viabilidade das células Caco-2 (P>0,05), demonstrando não haver citotoxicidade dos metabólitos dos pesticidas. Este método proposto abre um novo caminho para avaliar a citotoxicidade de metabólitos poluentes em plantas, o que deve fornecer dados valiosos para uma avaliação precisa da toxicidade.

Introdução

As plantas cultivadas que crescem em terras agrícolas podem estar expostas a vários poluentes orgânicos provenientes de atividades antrópicas ^1,2. Os poluentes podem ser absorvidos pelas plantas, causando ainda mais ameaças ao ecossistema e à saúde humana por meio das cadeias alimentares ^3,4. Os xenobióticos em plantas provavelmente passam por uma série de biotransformações, como os metabolismos das Fases I e II⁵, gerando uma série de metabólitos. De acordo com o conceito de fígado verde em plantas, o metabolismo vegetal pode reduzir a toxicidade dos xenobióticos ^6,7. No entanto, foi revelado que a toxicidade de alguns metabólitos pode ser maior do que a de seus pais. Por exemplo, o produto desbromado do tetrabromobisfenol A (TBBPA) e o produto O-metilado do bisfenol A (BPA) provaram ser muito mais tóxicos do que seus pais ^8,9, e a desbromação e a O-metilação compreendem as principais vias metabólicas da Fase I nas plantas. Assim, a avaliação da toxicidade baseada apenas nos progenitores poluentes nas plantas não é precisa, devendo ser tidos em conta os metabolitos correspondentes.

Os metabólitos dos xenobióticos em plantas são extremamente complexos^10,11, dificultando sua identificação e separação abrangentes. Além disso, apenas alguns padrões de metabólitos identificados podem ser obtidos. Por conseguinte, não estão disponíveis dados toxicológicos de todos os metabolitos, o que dificulta uma avaliação exaustiva da toxicidade. Este estudo propôs uma estratégia para avaliar a toxicidade integral de metabólitos poluentes em plantas, tratando-os como um todo durante testes toxicológicos, fornecendo novos dados para avaliação precisa da toxicidade de poluentes em plantas. Nosso estudo anterior revelou que a cultura de calos de plantas abre um caminho simples e eficaz para a obtenção de metabólitos de xenobióticos em plantas¹². Nesse sentido, a cultura de calos vegetais foi empregada neste estudo para gerar os metabólitos dos poluentes nas plantas, seguida de extração química e testes toxicológicos usando uma linhagem celular humana. O trato intestinal é um dos órgãos-alvo diretos dos xenobióticos expostos a animais e humanos. A linhagem Caco-2 tem se mostrado o melhor modelo para investigar os comportamentos intestinais e a toxicidade de xenobióticos in vitro 13,14,15. Assim, o modelo de célula Caco-2 foi selecionado neste estudo.

Os pesticidas triazólicos, uma classe de fungicidas de amplo espectro, têm sido amplamente aplicados na produção agrícola¹⁶. A poluição de resíduos em terras agrícolas tem atraído cada vez mais atenção^17,18. Aqui, quatro pesticidas triazólicos comumente usados, incluindo flusilazol, diniconazol, tebuconazol e propiconazol, foram selecionados como poluentes típicos. A cenoura foi selecionada neste estudo como a planta representativa de vegetais frescos e prontos para consumo. O calo de cenoura foi inicialmente exposto aos pesticidas testados na concentração de 100 mg/L. Após exposição de 72 h, os metabólitos foram extraídos para avaliar a citotoxicidade usando a linhagem Caco-2. Este método pode ser facilmente estendido para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de outros tipos de poluentes em plantas.

Protocolo

1. Diferenciação do calo de cenoura

NOTA: O protocolo detalhado para diferenciação do calo de cenoura foi descrito em um estudo anterior¹². Aqui está uma breve descrição.

1. Esterilize a superfície das sementes vernalizadas com etanol a 75% por 20 min seguido de 20% H₂O₂ por 20 min. Lave o com água destilada pelo menos 3x.
2. Semeie as sementes em meio Murashige e Skoog (MS) gelificado com ágar (1% p/v) sem hormônios (pH = 5,8, autoclavado a 121 ° C) e incube-as sob fotoperíodo de 16 h (350 μmol / m²s) a 26 ° C por 15 dias para formar as mudas.
3. Colha os explantes cortando o hipocótilo e o cotilédone das plântulas em pequenos pedaços (0,5 cm) e incube os explantes em meio MS contendo auximona de 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e fitocinina de 0,5 mg/L de 6-benzilaminopurina a 26 °C no escuro durante 3-4 semanas para induzir o calo.
4. Colete o calo (cerca de 1 cm de diâmetro, compacto) com bisturis e pinças.

2. Tratamento de calos de cenoura com pesticidas

1. Dissolva 10 mg de flusilazol, diniconazol, tebuconazol e propiconazol em 100 mL de meio MS estéril com concentrações finais de 100 mg / L (pH de 5,6-7,0).
   NOTA: A concentração de tratamento dos pesticidas testados foi escolhida como o máximo de 50% de concentração de inibição do crescimento celular (IC₅₀) para a célula Caco-2.
2. Misturar 3 g de calo de cenoura (do passo 1.4) com 10 ml de soluções de pesticidas preparadas (do passo 2.1) em frascos de vidro em condições estéreis.
3. Misturar 3 g de calo de cenoura (a partir do passo 1.4) com 10 ml de meio MS asséptico em frascos de vidro em condições estéreis.
   NOTA: Todos os frascos de vidro foram autoclavados.
4. Incubar o calo de cenoura (dos passos 2.2 e 2.3) a 130 rpm e 26 °C na obscuridade durante 72 h.
   Defina todos os tratamentos em triplicado.
5. Coletar o calo de cenoura do meio por filtração usando filtros de fibra de vidro (0,45 μm) após incubação de 72 h. Lave o calo com água ultrapura 3x.
6. Liofilize o calo usando um liofilizador a -55 °C e, em seguida, homogeneize-o usando um moedor de lenços de papel de alto rendimento a 70 Hz por 3 min.

3. Extração química do calo da cenoura

1. Misture 0,2 g de pó moído do calo liofilizado com 3 mL de acetonitrila em um tubo de centrífuga (10 mL).
2. Vortex o tubo da centrífuga por 8 min e, em seguida, sonicá-lo por 5 min (150 W, 40 kHz).
3. Colete os sobrenadantes por pipetagem após centrifugação a 8.000 x g a 4 ° C por 10 min.
4. Repita os procedimentos de extração 3x e agrupe os extratos em um tubo de centrífuga limpo (10 mL).
5. Concentrar os extractos agrupados até à secura utilizando um concentrador de sopro de azoto a 40 °C.
6. Dissolver novamente os resíduos de extractos (do passo 3.5) com 1 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 0,3% de dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: Os resíduos da etapa 3.6 foram obtidos a partir dos extratos de calos tratados com pesticidas (da etapa 2.2).
7. Dissolva novamente os resíduos de extratos (da etapa 3.5) com 1 mL de DMEM com 0,3% de DMSO e dissolva 1 mg de flusilazol, diniconazol, tebuconazol e propiconazol em 4 tubos diferentes, respectivamente.
   NOTA: Os resíduos da etapa 3.7 foram obtidos a partir dos extratos de calos em branco (da etapa 2.3).
   NOTA: O DEM foi preparado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).

4. Ressuscitação da célula Caco-2

NOTA: Todos os reagentes e materiais envolvidos nos testes de células Caco-2 foram autoclavados por 20 min e esterilizados sob luz ultravioleta por 2 h.

1. Remova o tubo de criopreservação (armazenamento de células congeladas) do tanque de nitrogênio líquido e transfira-o rapidamente para um banho-maria a 37 °C. Agite-o continuamente para descongelar a solução congelada.
   NOTA: Evite que a água flua sobre a tampa do tubo de criopreservação ao agitar.
2. Desinfete a superfície do tubo de criopreservação com álcool 75% após o descongelamento da solução congelada. Transfira rapidamente a solução celular para um tubo de centrífuga estéril por pipetagem.
3. Remover os sobrenadantes no tubo de criopreservação após centrifugação a 1.000 x g a 4 °C durante 3 min. Adicione 1 mL de DMEM e suspenda as células batendo e agitando suavemente.
4. Transferir a suspensão celular (do passo 4.3) para um balão de vidro por pipetagem. Adicione 5 mL de DMEM no frasco de vidro e agite suavemente o frasco de vidro para distribuir uniformemente as células.
5. Incubar as células numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: As etapas 4.2-4.4 foram executadas em uma bancada super limpa.

5. Passagem da célula Caco-2

1. Remova o frasco de vidro da incubadora e descarte o meio de cultura quando a densidade celular atingir mais de 80%. Lave as células com PBS 3x.
2. Adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA e espalhe-a uniformemente para garantir o contato total com as células.
3. Remova a solução digestiva quando as células encolherem da forma aderente para uma pequena ponta redonda e não estiverem suspensas sob a observação ao microscópio (ampliação de 100x). Bata suavemente na parede do frasco para causar a remoção das células.
4. Adicione 2 mL de DMEM, repita o enxágue da parede do frasco 10x, bata suavemente na parede do frasco e transfira 1 mL de suspensão celular para outro frasco de vidro.
5. Adicionar 5 ml de DMEM aos balões de vidro. Bata suavemente na parede do frasco para distribuir uniformemente as células.
6. Incubar as células na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. Substitua o meio de cultura por DMEM fresco a cada 24 h até que a densidade celular atinja mais de 80%.
7. Repetir os procedimentos de passagem celular até que haja células suficientes (aproximadamente 2 x 10⁶) colhidas para os testes de exposição seguintes.
   NOTA: As etapas 5.1-5.5 foram executadas na bancada super limpa. O número de células foi determinado por um hemocitômetro¹⁹.

6. Exposição da célula Caco-2

1. Remova os frascos de vidro (da etapa 5.7) da incubadora e repita as etapas 5.1-5.4 para coletar as células.
2. Bata suavemente na parede do frasco para distribuir uniformemente as células e transfira as suspensões celulares para um tubo de centrífuga (15 mL).
3. Diluir a suspensão celular (a partir do passo 6.2) com DMEM em combinação com citometria para atingir uma densidade celular de aproximadamente 1 x 10⁵ células/ml. Bata suavemente na parede do frasco para distribuir uniformemente as células.
4. Adicione 100 μL de PBS nos poços externos da placa de 96 poços para evitar a evaporação do meio de cultura devido ao efeito de borda.
   NOTA: Bata continuamente na parede do tubo da centrífuga para manter a suspensão da célula uniforme.
5. Adicione 100 μL de suspensão celular (da etapa 6.3) nos poços esquerdos da placa de 96 poços e deixe descansar por 10 min.
6. Incubar as células na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 48 h.
7. Retirar a placa de 96 poços da incubadora após 48 h de incubação e eliminar o meio de cultura.
8. Defina um grupo de metabólitos de pesticidas adicionando 100 μL de soluções (da etapa 3.6) em cada poço.
   NOTA: Em cada poço na Etapa 6.8, havia metabólitos de pesticidas gerados a partir de pais de 0,1 mg.
9. Defina um grupo de pais de pesticidas adicionando 100 μL de soluções (da etapa 3.7) em cada poço para comparação.
   NOTA: Em cada poço na Etapa 6.9, havia 0,1 mg de pais de pesticidas.
10. Defina um controle em branco adicionando 100 μL de DMEM com 0,3% de DMSO em cada poço. Use seis poços para cada grupo (etapa 6.8-6.9).
11. Incubar as células na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.
    NOTA: As etapas 6.1-6.5 e 6.7-6.10 foram executadas na bancada super limpa.

7. Avaliação da viabilidade celular

1. Retirar a placa de 96 poços (de 6.11) da incubadora e rejeitar o meio de cultura após exposição de 24 h. Lave as células com PBS 2x.
2. Adicione 100 μL de DMEM em cada poço e, em seguida, adicione 10 μL de reagentes CCK-8. Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente as células.
3. Incubar as células na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 4 h.
4. Retirar a placa de 96 poços da incubadora após 4 h de incubação e medir a absorvância óptica (DO) a 450 nm com um espectrofotómetro de fluorescência.
5. Calcule a viabilidade celular pela seguinte equação:
   viabilidade celular (%) = (_{grupo experimental} OD - OD_DMEM) / (_controle OD - OD_DMEM)×100%.
   NOTA: As etapas 7.1-7.2 foram executadas na bancada super limpa.

Resultados

A Figura 1 representa o esquema do método proposto para geração, extração e avaliação da citotoxicidade de metabólitos de pesticidas em calos de cenoura. Na Figura 2, as curvas de cinética de absorção e metabolismo dos agrotóxicos testados, a partir das quais podemos constatar que as concentrações de agrotóxicos nos meios de cultura diminuíram exponencialmente, enquanto as dos calos de cenoura começaram a aument...

Discussão

Este protocolo foi desenvolvido para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas, combinando calos vegetais e modelos de células humanas. As etapas críticas para este protocolo proposto são o cultivo de calos de plantas e células Caco-2. A parte mais difícil e o conselho relativo para a cultura de calos de plantas foram fornecidos em nosso estudo anterior¹². Aqui, deve-se notar que a manutenção celular é a parte ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010