식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

요약

이 프로토콜은 식물에서 트리아졸 살충제의 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하는 새로운 방법을 설명합니다.

초록

다양한 유기 오염 물질이 인위적인 활동으로 인해 환경으로 방출되었습니다. 이러한 오염 물질은 작물에 흡수되어 먹이 사슬 전반에 걸쳐 생태계와 인간의 건강에 잠재적인 위협을 가할 수 있습니다. 식물에서 오염 물질의 생물 변형은 부모 화합물보다 더 독성이 있을 수 있는 여러 대사 산물을 생성하며, 이는 독성 평가 중에 대사 산물을 고려해야 함을 의미합니다. 그러나 식물 내 오염물질의 대사산물은 매우 복잡하여 모든 대사산물의 독성 정보를 종합적으로 얻기가 어렵습니다. 이 연구는 독성 시험에서 식물의 오염 물질 대사 산물을 전체적으로 처리하여 통합 세포 독성을 평가하는 전략을 제안했습니다. 광범위한 살균제의 일종인 Triazole 살충제는 농업 생산에 널리 적용되어 왔습니다. 농지에 있는 그들의 잔류물 오염은 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다. 따라서 플루시라졸(flusilazole), 디니코나졸(diniconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 프로피코나졸(propiconazole)을 포함한 4가지 트리아졸 살충제가 테스트 오염물질로 선정되었습니다. 대사 산물은 테스트된 트리아졸 살충제로 당근 굳은살이를 처리하여 생성되었습니다. 72시간 처리 후 당근 캘러스에서 살충제의 대사 산물을 추출한 후 Caco-2 세포주를 사용한 독성 테스트를 수행했습니다. 그 결과, 당근 캘러스에서 시험된 살충제의 대사 산물이 Caco-2 세포의 생존력을 유의하게 억제하지 않았으며(P>0.05), 이는 살충제 대사 산물의 세포 독성이 없음을 입증했습니다. 이 제안된 방법은 식물에서 오염 물질 대사 산물의 세포 독성을 평가할 수 있는 새로운 길을 열어주며, 이는 정확한 독성 평가를 위한 귀중한 데이터를 제공할 것으로 기대됩니다.

서문

농지에서 자라는 작물 식물은 인위적 활동으로 인해 발생하는 다양한 유기 오염 물질에 노출될 수 있다 ^1,2. 오염 물질은 식물에 의해 흡수 될 수 있으며, 먹이 사슬을 통해 생태계와 인간의 건강에 위협을 가할 수 있습니다 ^3,4. 식물의 생체 이물(xenobiotics)은 아마도 I단계 및 II단계 대사(Phase I and II metabolisms⁾⁵와 같은 일련의 생물변형(biotransformation)을 겪어 많은 대사산물을 생성한다. 식물의 녹색 간 개념에 따르면 식물 대사는 생체 이물의 독성을 줄일 수 있습니다 ^6,7. 그러나 일부 대사 산물의 독성은 부모의 독성보다 높을 수 있음이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 테트라브로모비스페놀 A(TBBPA)의 탈브롬화 산물과 비스페놀 A(BPA)의 O-메틸화^{제품은 모체}보다 훨씬 더 독성이....

프로토콜

1. 당근 굳은살의 분화

참고: 당근 굳은살의 감별을 위한 자세한 프로토콜은 이전 연구¹²에 설명되어 있습니다. 다음은 간단한 설명입니다.

1. vernalized 종자의 표면을 75 % 에탄올로 20 분 동안 살균 한 다음 20 분 동안 20 % H₂O₂ 로 살균합니다. 증류수로 3 번 이상 씻으십시오.
2. 호르몬이 없는 한천 겔화(1% w/v) Murashige 및 Skoog(MS) 배지(pH = 5.8, 121°C에서 고압멸균)에 씨앗을 파종하고 26°C에서 15일 동안 16시간 광주기(350μmol/m^2s) 미만으로 배양하여 묘목을 형성합니다.
3. 묘목의 자엽과 자엽을 작은 조각(0.5cm)으로 잘라 외식물을 수확하고 1mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산의 옥시몬과 0.5mg/L의 피토키닌을 함유한 MS 배지에 외식물을 배양하고 26°C의 어두운 곳에서 3-4주 동안 굳은살을 유발합니다.
4. 굳은살(직경 약 1cm, 컴팩트)을 메스와 집게로 채취합니다.

토론

이 프로토콜은 식물 굳은살이와 인간 세포 모델을 결합하여 식물의 트리아졸 살충제 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하기 위해 개발되었습니다. 이 제안된 프로토콜의 중요한 단계는 식물 캘러스와 Caco-2 세포의 배양입니다. 식물 굳은살 배양에 대한 가장 어려운 부분과 상대적인 조언은 이전 연구¹²에서 제공되었습니다. 여기서 Caco-2 세포 배양은 세?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010