식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

요약

이 프로토콜은 식물에서 트리아졸 살충제의 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하는 새로운 방법을 설명합니다.

초록

다양한 유기 오염 물질이 인위적인 활동으로 인해 환경으로 방출되었습니다. 이러한 오염 물질은 작물에 흡수되어 먹이 사슬 전반에 걸쳐 생태계와 인간의 건강에 잠재적인 위협을 가할 수 있습니다. 식물에서 오염 물질의 생물 변형은 부모 화합물보다 더 독성이 있을 수 있는 여러 대사 산물을 생성하며, 이는 독성 평가 중에 대사 산물을 고려해야 함을 의미합니다. 그러나 식물 내 오염물질의 대사산물은 매우 복잡하여 모든 대사산물의 독성 정보를 종합적으로 얻기가 어렵습니다. 이 연구는 독성 시험에서 식물의 오염 물질 대사 산물을 전체적으로 처리하여 통합 세포 독성을 평가하는 전략을 제안했습니다. 광범위한 살균제의 일종인 Triazole 살충제는 농업 생산에 널리 적용되어 왔습니다. 농지에 있는 그들의 잔류물 오염은 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다. 따라서 플루시라졸(flusilazole), 디니코나졸(diniconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 프로피코나졸(propiconazole)을 포함한 4가지 트리아졸 살충제가 테스트 오염물질로 선정되었습니다. 대사 산물은 테스트된 트리아졸 살충제로 당근 굳은살이를 처리하여 생성되었습니다. 72시간 처리 후 당근 캘러스에서 살충제의 대사 산물을 추출한 후 Caco-2 세포주를 사용한 독성 테스트를 수행했습니다. 그 결과, 당근 캘러스에서 시험된 살충제의 대사 산물이 Caco-2 세포의 생존력을 유의하게 억제하지 않았으며(P>0.05), 이는 살충제 대사 산물의 세포 독성이 없음을 입증했습니다. 이 제안된 방법은 식물에서 오염 물질 대사 산물의 세포 독성을 평가할 수 있는 새로운 길을 열어주며, 이는 정확한 독성 평가를 위한 귀중한 데이터를 제공할 것으로 기대됩니다.

서문

농지에서 자라는 작물 식물은 인위적 활동으로 인해 발생하는 다양한 유기 오염 물질에 노출될 수 있다 ^1,2. 오염 물질은 식물에 의해 흡수 될 수 있으며, 먹이 사슬을 통해 생태계와 인간의 건강에 위협을 가할 수 있습니다 ^3,4. 식물의 생체 이물(xenobiotics)은 아마도 I단계 및 II단계 대사(Phase I and II metabolisms⁾⁵와 같은 일련의 생물변형(biotransformation)을 겪어 많은 대사산물을 생성한다. 식물의 녹색 간 개념에 따르면 식물 대사는 생체 이물의 독성을 줄일 수 있습니다 ^6,7. 그러나 일부 대사 산물의 독성은 부모의 독성보다 높을 수 있음이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 테트라브로모비스페놀 A(TBBPA)의 탈브롬화 산물과 비스페놀 A(BPA)의 O-메틸화^{제품은 모체}보다 훨씬 더 독성이 있는 것으로 입증되었으며^8,9, 탈브롬화 및 O-메틸화는 식물의 주요 I단계 대사 경로를 구성합니다. 따라서 식물의 오염 물질 부모만을 기반으로 한 독성 평가는 정확하지 않지만 해당 대사 산물을 고려해야 합니다.

식물에서 이종 생물의 대사 산물은 매우 복잡합니다^10,11, 이를 종합적으로 식별하고 분리하는 것은 어렵습니다. 또한, 확인된 대사 산물의 몇 가지 표준물질만 얻을 수 있습니다. 따라서 모든 대사 산물의 독성 데이터를 사용할 수 없어 포괄적인 독성 평가를 방해합니다. 본 연구는 식물 내 오염물질 대사산물을 독성시험 시 전체적으로 처리하여 통합독성을 평가하는 전략을 제시하고, 식물 내 오염물질의 정확한 독성 평가를 위한 새로운 데이터를 제공하였다. 우리의 이전 연구는 식물 굳은살 배양이 식물¹²에서 이종 생물의 대사 산물을 얻을 수 있는 간단하고 효과적인 길을 열어준다는 것을 밝혔습니다. 이에 본 연구에서는 식물 캘러스 배양을 이용하여 식물 내 오염물질의 대사산물을 생성하고, 인간 세포주를 이용하여 화학적 추출 및 독성 시험을 진행하였다. 장(腸)은 동물과 인간에게 노출되는 생체 이물(xenobiotics)의 직접적인 표적 기관 중 하나입니다. Caco-2 세포주는 in vitro 13,14,15 생체 이물의 장 거동 및 독성을 조사하기 위한 최상의 모델임이 입증되었습니다. 따라서 본 연구에서는 Caco-2 세포 모델을 선정하였다.

광범위한 살균제의 일종인 트리아졸 살충제는 농업 생산에 널리 적용되어 왔다¹⁶. 농지의 잔류 오염은 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다^17,18. 여기에서는 플루실라졸(flusilazole), 디니코나졸(diniconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 프로피코나졸(propiconazole) 등 일반적으로 사용되는 4가지 트리아졸 살충제를 대표적인 오염물질로 선정하였다. 이 연구에서 당근은 신선하고 바로 먹을 수 있는 채소의 대표 식물로 선정되었습니다. 당근 굳은살은 처음에 100mg/L 농도로 테스트된 살충제에 노출되었습니다. 72시간 노출 후, Caco-2 세포주를 사용하여 세포독성을 평가하기 위해 대사산물을 추출하였다. 이 방법은 식물에서 다른 유형의 오염 물질의 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하기 위해 쉽게 확장 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 당근 굳은살의 분화

참고: 당근 굳은살의 감별을 위한 자세한 프로토콜은 이전 연구¹²에 설명되어 있습니다. 다음은 간단한 설명입니다.

1. vernalized 종자의 표면을 75 % 에탄올로 20 분 동안 살균 한 다음 20 분 동안 20 % H₂O₂ 로 살균합니다. 증류수로 3 번 이상 씻으십시오.
2. 호르몬이 없는 한천 겔화(1% w/v) Murashige 및 Skoog(MS) 배지(pH = 5.8, 121°C에서 고압멸균)에 씨앗을 파종하고 26°C에서 15일 동안 16시간 광주기(350μmol/m^2s) 미만으로 배양하여 묘목을 형성합니다.
3. 묘목의 자엽과 자엽을 작은 조각(0.5cm)으로 잘라 외식물을 수확하고 1mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산의 옥시몬과 0.5mg/L의 피토키닌을 함유한 MS 배지에 외식물을 배양하고 26°C의 어두운 곳에서 3-4주 동안 굳은살을 유발합니다.
4. 굳은살(직경 약 1cm, 컴팩트)을 메스와 집게로 채취합니다.

2. 농약에 의한 당근 굳은살 처리

1. 플루실라졸, 디니코나졸, 테부코나졸, 프로피코나졸 각각 10mg을 최종 농도 100mg/L(pH 5.6-7.0)의 멸균 MS 배지 100mL에 용해시킵니다.
   참고: 테스트된 살충제의 처리 농도는 Caco-2 세포에 대한 최대 50% 세포 성장 억제 농도(IC₅₀)로 선택되었습니다.
2. 멸균 상태에서 유리 플라스크에 당근 굳은살이버섯 3g(1.4단계)과 준비된 살충제 용액 10mL(2.1단계)를 혼합합니다.
3. 멸균 상태에서 유리 플라스크에 당근 굳은살(단계 1.4에서) 3g을 무균 MS 배지 10mL와 혼합합니다.
   참고: 모든 유리 플라스크는 고압멸균되었습니다.
4. 당근 굳은살(2.2단계 및 2.3단계)을 130rpm 및 26°C의 어두운 곳에서 72시간 동안 배양합니다.
   모든 처리를 삼중으로 설정합니다.
5. 72시간 배양 후 유리 섬유 필터(0.45μm)를 사용하여 여과하여 배지에서 당근 굳은살을 수집합니다. 굳은살은 초순수로 3번 씻어냅니다.
6. -55°C에서 동결 건조기를 사용하여 굳은살을 동결 건조한 다음 70Hz에서 고처리량 조직 분쇄기를 사용하여 3분 동안 균질화합니다.

3. 당근 굳은살의 화학적 추출

1. 동결 건조 굳은살의 분쇄 분말 0.2g과 아세토니트릴 3mL를 원심분리 튜브(10mL)에 섞습니다.
2. 원심 분리기 튜브를 8 분 동안 소용돌이 친 다음 5 분 (150W, 40kHz) 동안 초음파 처리합니다.
3. 원심분리 후 4°C에서 8,000 x g 에서 10분 동안 피펫팅하여 상층액을 수집합니다.
4. 추출 절차를 3회 반복하고 깨끗한 원심분리기 튜브(10mL)에 추출물을 합칩니다.
5. 40°C에서 질소 분사 농축기를 사용하여 풀링된 추출물을 농축하여 건조시킵니다.
6. 추출물의 잔류물(3.5단계에서)을 Dulbecco의 변형된 Eagle's Medium(DMEM) 1mL와 0.3% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 재용해시킵니다.
   참고: 3.6단계의 잔류물은 살충제 처리된 굳은살이의 추출물에서 얻었습니다(2.2단계에서).
7. 추출물의 잔류물(3.5단계에서)을 0.3% DMSO가 있는 1mL의 DMEM으로 재용해시키고 1mg의 플루실라졸, 디니코나졸, 테부코나졸 및 프로피코나졸을 각각 4개의 다른 튜브에 용해시킵니다.
   알림: 3.7단계의 잔류물은 빈 굳은살(2.3단계)의 추출물에서 얻은 것입니다.
   참고: DMEM은 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)로 제조되었습니다.

4. Caco-2 세포의 소생

참고: Caco-2 세포 테스트에 관련된 모든 시약 및 재료를 20분 동안 고압멸균하고 2시간 동안 자외선으로 멸균했습니다.

1. 액체 질소 탱크에서 동결 보존 튜브(냉동 세포 저장)를 제거하고 37°C의 수조로 빠르게 옮깁니다. 얼린 용액을 해동하기 위해 계속 흔듭니다.
   알림: 흔들 때 동결 보존 튜브의 덮개 위로 물이 흐르지 않도록 하십시오.
2. 냉동 용액이 해동된 후 75% 알코올로 동결 보존 튜브의 표면을 소독합니다. 피펫팅을 통해 세포 용액을 멸균 원심분리기 튜브로 빠르게 옮깁니다.
3. 4°C에서 1,000 x g 으로 3분 동안 원심분리한 후 동결 보존 튜브의 상층액을 제거합니다. DMEM 1mL를 넣고 가볍게 두드리거나 흔들어 세포를 현탁시킵니다.
4. 피펫팅을 통해 세포 현탁액(4.3단계에서)을 유리 플라스크에 옮깁니다. 유리 플라스크에 DMEM 5mL를 넣고 유리 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.
5. 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % CO 2로 세포를 배양_합니다.
   참고 : 4.2-4.4 단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행되었습니다.

5. Caco-2 세포의 통로

1. 인큐베이터에서 유리 플라스크를 제거하고 세포 밀도가 80% 이상에 도달하면 배양 배지를 버립니다. PBS 3x로 세포를 세척합니다.
2. trypsin-EDTA 용액 1mL를 넣고 세포와 완전히 접촉하도록 균일하게 펴 바릅니다.
3. 세포가 부착 된 모양에서 작은 둥근 점으로 수축하고 현미경 (100x 배율)으로 관찰 할 때 부유하지 않은 경우 소화 용액을 제거하십시오. 플라스크 벽을 가볍게 두드려 세포를 제거합니다.
4. 2mL의 DMEM을 추가하고, 플라스크 벽을 10번 반복하고, 플라스크 벽을 가볍게 두드린 다음 1mL의 세포 현탁액을 다른 유리 플라스크에 옮깁니다.
5. 유리 플라스크에 DMEM 5mL를 추가합니다. 플라스크 벽을 가볍게 두드려 세포를 균일하게 분포시킵니다.
6. 인큐베이터에서 37 ° C의 5 % CO 2로 세포를 배양_합니다. 세포 밀도가 80% 이상에 도달할 때까지 24시간마다 배양 배지를 새로운 DMEM으로 교체합니다.
7. 다음 노출 테스트를 위해 충분한 세포(약 2 x 10⁶)가 수확될 때까지 세포 통로 절차를 반복합니다.
   알림: 5.1-5.5단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행되었습니다. 세포의 수는 혈구측정기⁽¹⁹)에 의해 결정되었다.

6. Caco-2 세포의 노출

1. 인큐베이터에서 유리 플라스크(5.7단계에서)를 제거하고 5.1-5.4단계를 반복하여 세포를 수집합니다.
2. 플라스크 벽을 가볍게 두드려 세포를 균일하게 분포시키고 세포 현탁액을 원심분리 튜브(15mL)로 옮깁니다.
3. 세포 현탁액(6.2단계에서)을 세포분석법과 함께 DMEM으로 희석하여 약 1 x 10⁵ cells/mL의 세포 밀도에 도달합니다. 플라스크 벽을 가볍게 두드려 세포를 균일하게 분포시킵니다.
4. 96-well plate의 외부 well에 100 μL의 PBS를 추가하여 edge 효과로 인한 배양 배지의 증발을 방지합니다.
   알림: 셀 현탁액을 균일하게 유지하기 위해 원심분리기 튜브의 벽을 계속 두드립니다.
5. 100웰 플레이트의 왼쪽 웰에 6.3μL의 셀 현탁액(96μL)을 추가하고 10분 동안 휴지시킵니다.
6. 인큐베이터의 세포를 37°C에서 5% CO₂ 로 48시간 동안 배양합니다.
7. 48시간 배양 후 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 배양 배지를 폐기합니다.
8. 각 웰에 100μL의 용액(3.6단계에서)을 추가하여 살충제 대사 산물 그룹을 설정합니다.
   참고: 6.8단계의 각 웰에는 0.1mg 부모로부터 생성된 살충제 대사 산물이 있었습니다.
9. 비교를 위해 각 웰에 100μL의 용액(3.7단계에서)을 추가하여 살충제 상위 그룹을 설정합니다.
   참고: 6.9단계의 각 우물에는 0.1mg의 살충제 부모가 있었습니다.
10. 각 웰에 0.3% DMSO와 함께 100μL의 DMEM을 추가하여 빈 대조군을 설정합니다. 각 그룹에 대해 6개의 웰을 사용합니다(단계 6.8-6.9).
11. 인큐베이터의 세포를 37°C에서 5% CO₂ 로 24시간 동안 배양합니다.
    참고: 6.1-6.5 및 6.7-6.10 단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행되었습니다.

7. 세포 생존율 평가

1. 인큐베이터에서 96웰 플레이트(6.11부터)를 제거하고 24시간 노출 후 배양 배지를 폐기합니다. PBS 2x로 세포를 세척합니다.
2. 각 웰에 100μL의 DMEM을 추가한 다음 10μL의 CCK-8 시약을 추가합니다. 세포가 균일하게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다.
3. 인큐베이터의 세포를 37°C에서 5% CO₂ 로 4시간 동안 배양합니다.
4. 4시간 배양 후 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 형광 분광 광도계로 450nm에서 광학 흡광도(OD)를 측정합니다.
5. 다음 방정식으로 세포 생존율을 계산합니다.
   세포 생존율(%) = (OD_실험군 - OD_DMEM) / (OD_대조 군 - OD_DMEM)×100%.
   알림: 7.1-7.2단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행되었습니다.

결과

그림 1 은 당근 캘러스에서 살충제 대사 산물의 생성, 추출 및 세포 독성 평가를 위해 제안된 방법의 개략도를 나타냅니다. 그림 2에서 테스트된 살충제의 흡수 및 대사 역학 곡선을 보면 배양 배지의 살충제 농도가 기하급수적으로 감소한 반면 당근 굳은살이의 농도는 증가하기 시작하여 4시간 또는 8시간에 최고조에 달한 후 ?...

토론

이 프로토콜은 식물 굳은살이와 인간 세포 모델을 결합하여 식물의 트리아졸 살충제 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하기 위해 개발되었습니다. 이 제안된 프로토콜의 중요한 단계는 식물 캘러스와 Caco-2 세포의 배양입니다. 식물 굳은살 배양에 대한 가장 어려운 부분과 상대적인 조언은 이전 연구¹²에서 제공되었습니다. 여기서 Caco-2 세포 배양은 세?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010