Évaluation de la cytotoxicité des métabolites des pesticides triazoles typiques dans les plantes

Résumé

Le protocole décrit une nouvelle méthode pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites des pesticides triazolés dans les plantes.

Résumé

Divers polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques. Ces polluants peuvent être absorbés par les plantes cultivées, ce qui constitue une menace potentielle pour l’écosystème et la santé humaine tout au long de la chaîne alimentaire. La biotransformation des polluants dans les plantes génère un certain nombre de métabolites qui peuvent être plus toxiques que leurs composés parents, ce qui implique que ces métabolites doivent être pris en compte lors de l’évaluation de la toxicité. Cependant, les métabolites des polluants dans les plantes sont extrêmement complexes, ce qui rend difficile l’obtention complète d’informations toxicologiques sur tous les métabolites. Cette étude a proposé une stratégie pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites polluants dans les plantes en les traitant dans leur ensemble lors d’essais toxicologiques. Les pesticides à base de triazole, une classe de fongicides à large spectre, ont été largement utilisés dans la production agricole. La pollution par les résidus dans les terres agricoles attire de plus en plus l’attention. Par conséquent, quatre pesticides à base de triazole, à savoir le flusilazole, le diniconazole, le tébuconazole et le propiconazole, ont été sélectionnés comme polluants testés. Les métabolites ont été générés par le traitement des callosités de la carotte avec des pesticides triazoles testés. Après un traitement de 72 h, les métabolites des pesticides dans le cal de carotte ont été extraits, suivis de tests toxicologiques utilisant la lignée cellulaire Caco-2. Les résultats ont montré que les métabolites des pesticides testés dans les callosités de carotte n’inhibaient pas significativement la viabilité des cellules Caco-2 (P>0,05), démontrant l’absence de cytotoxicité des métabolites des pesticides. Cette méthode proposée ouvre une nouvelle voie pour évaluer la cytotoxicité des métabolites polluants dans les plantes, ce qui devrait fournir des données précieuses pour une évaluation précise de la toxicité.

Introduction

Les plantes cultivées qui poussent dans les terres agricoles peuvent être exposées à divers polluants organiques provenant des activités anthropiques ^1,2. Les polluants peuvent être absorbés par les plantes, ce qui constitue une menace supplémentaire pour l’écosystème et la santé humaine par le biais des chaînes alimentaires ^3,4. Les xénobiotiques des plantes subissent probablement une série de biotransformations, telles que les métabolismes de phase I et II⁵, générant un certain nombre de métabolites. Selon le concept de foie vert chez les plantes, le métabolisme des plantes peut réduire la toxicité des xénobiotiques ^6,7. Cependant, il a été révélé que la toxicité de certains métabolites pourrait être supérieure à celle de leurs parents. Par exemple, il a été prouvé que le produit débromé du tétrabromobisphénol A (TBBPA) et le produit O-méthylé du bisphénol A (BPA) sont beaucoup plus toxiques que leurs parents ^8,9, et la débromation et l’O-méthylation constituent les principales voies métaboliques de phase I chez les plantes. Ainsi, l’évaluation de la toxicité basée uniquement sur les parents polluants dans les plantes n’est pas précise, alors que les métabolites correspondants doivent être pris en compte.

Les métabolites des xénobiotiques chez les plantes sont extrêmement complexes ^10,11, ce qui rend difficile leur identification et leur séparation complètes. De plus, seuls quelques étalons de métabolites identifiés peuvent être obtenus. Par conséquent, les données toxicologiques de tous les métabolites ne sont pas disponibles, ce qui entrave une évaluation complète de la toxicité. Cette étude a proposé une stratégie pour évaluer la toxicité intégrale des métabolites polluants dans les plantes en les traitant dans leur ensemble lors d’essais toxicologiques, fournissant de nouvelles données pour une évaluation précise de la toxicité des polluants dans les plantes. Notre précédente étude a révélé que la culture de callosités végétales ouvre une voie simple et efficace pour obtenir des métabolites de xénobiotiques dans les plantes¹². En conséquence, la culture de callosités végétales a été utilisée dans cette étude pour générer les métabolites des polluants dans les plantes, suivie d’une extraction chimique et de tests toxicologiques utilisant une lignée cellulaire humaine. Le tractus intestinal est l’un des organes cibles directs des xénobiotiques exposés aux animaux et aux humains. La lignée cellulaire Caco-2 s’est avérée être le meilleur modèle pour étudier les comportements intestinaux et la toxicité des xénobiotiques in vitro 13,14,15. Ainsi, le modèle de cellule Caco-2 a été sélectionné dans cette étude.

Les pesticides à base de triazole, une classe de fongicides à large spectre, ont été largement utilisés dans la production agricole¹⁶. La pollution par les résidus dans les terres agricoles a attiré de plus en plus d’attention^17,18. Ici, quatre pesticides triazolés couramment utilisés, à savoir le flusilazole, le diniconazole, le tébuconazole et le propiconazole, ont été sélectionnés comme polluants typiques. La carotte a été sélectionnée dans cette étude comme plante représentative des légumes frais et prêts à consommer. Le cal de carotte a d’abord été exposé aux pesticides testés à une concentration de 100 mg/L. Après une exposition de 72 h, les métabolites ont été extraits afin d’évaluer la cytotoxicité à l’aide de la lignée cellulaire Caco-2. Cette méthode peut être facilement étendue pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites d’autres types de polluants dans les plantes.

Protocole

1. Différenciation du cal de la carotte

REMARQUE : Le protocole détaillé de différenciation du cal de la carotte a été décrit dans une étude précédente¹². En voici une brève description.

1. Stériliser la surface des graines vernalisées avec de l’éthanol à 75% pendant 20 min puis à 20% de_H2O2 pendant 20 min. Lavez-le avec de l’eau distillée au moins 3 fois.
2. Semez les graines dans un milieu Murashige et Skoog (MS) gélifié à l’agar-gélisé sans hormones (pH = 5,8, autoclavé à 121 °C), et incubez-les sous une photopériode de 16 h (350 μmol/m²s) à 26 °C pendant 15 jours pour former les plantules.
3. Récoltez les explants en coupant l’hypocotyle et le cotylédon des plantules en petits morceaux (0,5 cm) et incubez les explants dans un milieu MS contenant de l’auximone de 1 mg/L d’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et de la phytokinine de 0,5 mg/L de 6-benzylaminopurine à 26 °C dans l’obscurité pendant 3-4 semaines pour induire le durillon.
4. Prélevez le cal (environ 1 cm de diamètre, compact) à l’aide de scalpels et de pinces.

2. Traitement du cal de la carotte avec des pesticides

1. Dissoudre 10 mg chacun de flusilazole, de diniconazole, de tébuconazole et de propiconazole dans 100 mL de milieu MS stérile à des concentrations finales de 100 mg/L (pH de 5,6 à 7,0).
   REMARQUE : La concentration de traitement des pesticides testés a été choisie comme étant la concentration maximale de 50 % d’inhibition de la croissance cellulaire (CI₅₀) à la cellule Caco-2.
2. Mélanger 3 g de cal de carotte (de l’étape 1.4) avec 10 mL de solutions de pesticides préparées (de l’étape 2.1) dans des flacons de verre dans des conditions stériles.
3. Mélanger 3 g de cal de carotte (de l’étape 1.4) avec 10 mL de milieu MS aseptique dans des flacons en verre dans des conditions stériles.
   REMARQUE : Tous les flacons en verre ont été autoclavés.
4. Incuber la callosité de la carotte (à partir des étapes 2.2 et 2.3) à 130 tr/min et 26 °C dans l’obscurité pendant 72 h.
   Réglez tous les traitements en trois exemplaires.
5. Recueillir le cal de carotte du milieu par filtration à l’aide de filtres en fibre de verre (0,45 μm) après une incubation de 72 h. Lavez le cal avec de l’eau ultrapure 3x.
6. Lyophiliser les callosités à l’aide d’un lyophilisateur à -55 °C, puis les homogénéiser à l’aide d’un broyeur de tissus à haut débit à 70 Hz pendant 3 min.

3. Extraction chimique du cal de la carotte

1. Mélangez 0,2 g de poudre moulue de cal lyophilisé avec 3 ml d’acétonitrile dans un tube à centrifuger (10 ml).
2. Faites vortex le tube de centrifugation pendant 8 min, puis sonicez-le pendant 5 min (150 W, 40 kHz).
3. Prélever les surnageants par pipetage après centrifugation à 8 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
4. Répétez les procédures d’extraction 3 fois et regroupez les extraits dans un tube à centrifuger propre (10 ml).
5. Concentrez les extraits mélangés jusqu’à ce qu’ils soient secs à l’aide d’un concentrateur de soufflage d’azote à 40 °C.
6. Redissolvez les résidus d’extraits (à partir de l’étape 3.5) avec 1 mL de milieu Eagle’s modifié (DMEM) de Dulbecco avec 0,3 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   REMARQUE : Les résidus de l’étape 3.6 ont été obtenus à partir d’extraits de cal traités au pesticide (à partir de l’étape 2.2).
7. Dissoudre à nouveau les résidus d’extraits (à partir de l’étape 3.5) avec 1 mL de DMEM avec 0,3 % de DMSO, et dissoudre 1 mg de flusilazole, de diniconazole, de tébuconazole et de propiconazole dans 4 tubes différents, respectivement.
   REMARQUE : Les résidus de l’étape 3.7 ont été obtenus à partir d’extraits de cal à blanc (à partir de l’étape 2.3).
   REMARQUE : Le DMEM a été préparé avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine).

4. Réanimation de la cellule Caco-2

REMARQUE : Tous les réactifs et matériaux utilisés dans les tests sur cellules Caco-2 ont été autoclavés pendant 20 minutes et stérilisés sous lumière ultraviolette pendant 2 h.

1. Retirez le tube de cryoconservation (stockage des cellules congelées) du réservoir d’azote liquide et transférez-le rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Secouez-le continuellement pour décongeler la solution congelée.
   REMARQUE : Évitez que l’eau ne coule sur le couvercle du tube de cryoconservation lors de l’agitation.
2. Désinfectez la surface du tube de cryoconservation avec de l’alcool à 75 % après la décongélation de la solution congelée. Transférez rapidement la solution cellulaire dans un tube à centrifuger stérile par pipetage.
3. Retirer les surnageants dans le tube de cryoconservation après centrifugation à 1 000 x g à 4 °C pendant 3 min. Ajoutez 1 ml de DMEM et suspendez les cellules en tapotant et en secouant doucement.
4. Transvaser la suspension cellulaire (à partir de l’étape 4.3) dans une fiole en verre par pipetage. Ajoutez 5 ml de DMEM dans la fiole de verre et secouez doucement la fiole de verre pour répartir uniformément les cellules.
5. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
   REMARQUE : Les étapes 4.2-4.4 ont été effectuées sur un banc super propre.

5. Passage de la cellule Caco-2

1. Retirez la fiole en verre de l’incubateur et jetez le milieu de culture lorsque la densité cellulaire atteint plus de 80 %. Lavez les cellules avec du PBS 3x.
2. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA et l’étaler uniformément pour assurer un contact complet avec les cellules.
3. Retirer la solution digestive lorsque les cellules passent de la forme adhérente à un petit point rond et n’ont pas été suspendues sous l’observation au microscope (grossissement de 100x). Tapotez doucement la paroi du ballon pour provoquer l’élimination des cellules.
4. Ajouter 2 ml de DMEM, rincer 10 fois la paroi du ballon, tapoter doucement la paroi du ballon et transférer 1 ml de suspension cellulaire dans un autre flacon en verre.
5. Ajouter 5 ml de DMEM dans des flacons en verre. Tapotez doucement la paroi du ballon pour répartir uniformément les cellules.
6. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂. Remplacez le milieu de culture par du DMEM frais toutes les 24 h jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne plus de 80 %.
7. Répéter les procédures de passage cellulaire jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de cellules (environ 2 x 10⁶) récoltées pour les essais d’exposition suivants.
   REMARQUE : Les étapes 5.1 à 5.5 ont été effectuées dans le banc super propre. Le nombre de cellules a été déterminé par un hémocytomètre¹⁹.

6. Exposition de la cellule Caco-2

1. Retirez les flacons en verre (de l’étape 5.7) de l’incubateur et répétez les étapes 5.1 à 5.4 pour recueillir les cellules.
2. Tapotez doucement la paroi du ballon pour répartir uniformément les cellules et transférez les suspensions cellulaires dans un tube à centrifuger (15 ml).
3. Diluer la suspension cellulaire (à partir de l’étape 6.2) avec du DMEM en combinaison avec la cytométrie pour atteindre une densité cellulaire d’environ 1 x 10⁵ cellules/mL. Tapotez doucement la paroi du ballon pour répartir uniformément les cellules.
4. Ajouter 100 μL de PBS dans les puits extérieurs de la plaque à 96 puits pour éviter l’évaporation du milieu de culture en raison de l’effet de bord.
   REMARQUE : Tapotez continuellement la paroi du tube de centrifugation pour maintenir la suspension de la cellule uniforme.
5. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire (à partir de l’étape 6.3) dans les puits gauches de la plaque à 96 puits et laisser reposer pendant 10 min.
6. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 48 h.
7. Retirer la plaque à 96 puits de l’incubateur après une incubation de 48 h et jeter le milieu de culture.
8. Déterminez un groupe de métabolites de pesticide en ajoutant 100 μL de solutions (de l’étape 3.6) dans chaque puits.
   REMARQUE : Dans chaque puits de l’étape 6.8, des métabolites de pesticides ont été générés par les parents ayant reçu 0,1 mg.
9. Établissez un groupe de parents de pesticides en ajoutant 100 μL de solutions (à l’étape 3.7) dans chaque puits à des fins de comparaison.
   REMARQUE : Dans chaque puits de l’étape 6.9, il y avait 0,1 mg de parents de pesticides.
10. Définissez un contrôle à blanc en ajoutant 100 μL de DMEM avec 0,3 % de DMSO dans chaque puits. Utilisez six puits pour chaque groupe (étapes 6.8-6.9).
11. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 24 h.
    REMARQUE : Les étapes 6.1-6.5 et 6.7-6.10 ont été effectuées dans le banc super propre.

7. Évaluation de la viabilité cellulaire

1. Retirer la plaque à 96 puits (à partir de 6.11) de l’incubateur et jeter le milieu de culture après une exposition de 24 h. Lavez les cellules avec du PBS 2x.
2. Ajoutez 100 μL de DMEM dans chaque puits, puis ajoutez 10 μL de réactifs CCK-8. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules.
3. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 4 h.
4. Retirer la plaque à 96 puits de l’incubateur après une incubation de 4 h et mesurer l’absorbance optique (DO) à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à fluorescence.
5. Calculez la viabilité cellulaire à l’aide de l’équation suivante :
   viabilité cellulaire (%) = (_{groupe expérimental} DO -_{OD DEM)} /_(contrôle DO - OD_DMEM)×100%.
   REMARQUE : Les étapes 7.1-7.2 ont été effectuées dans le banc super propre.

Résultats

La figure 1 représente le schéma de la méthode proposée pour la production, l’extraction et l’évaluation de la cytotoxicité des métabolites de pesticides dans les callosités de la carotte. Dans la figure 2, les courbes cinétiques d’absorption et de métabolisme des pesticides testés, à partir desquelles nous pouvons constater que les concentrations de pesticides dans les milieux de culture ont diminué de façon...

Discussion

Ce protocole a été développé pour évaluer la cytotoxicité intégrale des métabolites des pesticides triazolés dans les plantes en combinant des cals végétaux et des modèles de cellules humaines. Les étapes critiques de ce protocole proposé sont la culture de cal végétal et de cellules Caco-2. La partie la plus difficile et les conseils relatifs à la culture des callosités végétales ont été fournis dans notre étude précédente¹². Ici, il conv...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010