Оценка цитотоксичности метаболитов типичных триазоловых пестицидов в организме растений

Резюме

В протоколе описан новый метод оценки интегральной цитотоксичности метаболитов триазоловых пестицидов в растениях.

Аннотация

В результате антропогенной деятельности в окружающую среду попадают различные органические загрязнители. Эти загрязнители могут поглощаться сельскохозяйственными культурами, создавая потенциальные угрозы для экосистемы и здоровья человека на всех этапах пищевой цепи. Биотрансформация загрязняющих веществ в растениях приводит к образованию ряда метаболитов, которые могут быть более токсичными, чем их исходные соединения, что означает, что эти метаболиты следует учитывать при оценке токсичности. Тем не менее, метаболиты загрязняющих веществ в растениях чрезвычайно сложны, что затрудняет всестороннее получение токсикологической информации обо всех метаболитах. В этом исследовании была предложена стратегия оценки интегральной цитотоксичности метаболитов загрязнителей в растениях путем обработки их как целого во время токсикологических испытаний. Триазоловые пестициды, класс фунгицидов широкого спектра действия, широко применяются в сельскохозяйственном производстве. Загрязнение сельскохозяйственных угодий их остатками привлекает все большее внимание. Таким образом, в качестве исследуемых загрязнителей были выбраны четыре триазоловых пестицида, включая флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол. Метаболиты были получены в результате обработки морковной каллуса испытанными триазольными пестицидами. После обработки в течение 72 ч были экстрагированы метаболиты пестицидов в каллусе моркови, после чего были проведены токсикологические испытания с использованием клеточной линии Caco-2. Результаты показали, что метаболиты исследуемых пестицидов в каллусе моркови существенно не ингибировали жизнеспособность клеток Caco-2 (P>0,05), демонстрируя отсутствие цитотоксичности метаболитов пестицидов. Этот предлагаемый метод открывает новые возможности для оценки цитотоксичности метаболитов загрязнителей в растениях, что, как ожидается, предоставит ценные данные для точной оценки токсичности.

Введение

Сельскохозяйственные культуры, произрастающие на сельскохозяйственных угодьях, могут подвергаться воздействию различных органических загрязнителей, возникающих в результате антропогенной деятельности ^1,2. Загрязняющие вещества могут поглощаться растениями, создавая дальнейшую угрозу для экосистемы и здоровья человека через пищевые цепи ^3,4. Ксенобиотики в растениях, вероятно, претерпевают ряд биотрансформаций, таких как метаболизм фазы I и^II5, генерируя ряд метаболитов. Согласно концепции зеленой печени у растений, метаболизм растений может снизить токсичность ксенобиотиков ^6,7. Тем не менее, было выявлено, что токсичность некоторых метаболитов может быть выше, чем у их родителей. Например, доказано, что дебромированный продукт тетрабромбисфенола А (ТББПА) и О-метилированный продукт бисфенола А (БФА) гораздо более токсичны, чем их^{родители8,9}, а дебромирование и О-метилирование составляют основные пути метаболизма фазы I в растениях. Таким образом, оценка токсичности исключительно на основе родителей загрязнителей в растениях не является точной, в то время как следует учитывать соответствующие метаболиты.

Метаболиты ксенобиотиков в растениях чрезвычайно сложны10,11, что затрудняет их всестороннюю идентификацию и разделение. Кроме того, можно получить лишь несколько стандартов идентифицированных метаболитов. Следовательно, токсикологические данные по всем метаболитам недоступны, что затрудняет всестороннюю оценку токсичности. В этом исследовании была предложена стратегия оценки интегральной токсичности метаболитов загрязняющих веществ в растениях путем их обработки как единого целого во время токсикологических испытаний, что позволило получить новые данные для точной оценки токсичности загрязняющих веществ в растениях. Наше предыдущее исследование показало, что культура каллуса растений открывает простой и эффективный путь к получению метаболитов ксенобиотиков в растениях¹². Соответственно, культура каллуса растений была использована в этом исследовании для получения метаболитов загрязняющих веществ в растениях с последующей химической экстракцией и токсикологическими испытаниями с использованием клеточной линии человека. Кишечный тракт является одним из непосредственных органов-мишеней ксенобиотиков, подвергающихся воздействию животных и человека. Клеточная линия Caco-2 оказалась лучшей моделью для исследования кишечного поведения и токсичности ксенобиотиков in vitro 13,14,15. Таким образом, в данном исследовании была выбрана модель клеток Caco-2.

Триазоловые пестициды, класс фунгицидов широкого спектра действия, широко применяются в сельскохозяйственном производстве¹⁶. Загрязнение сельскохозяйственных угодий их остатками привлекает все большее внимание^17,18. Здесь в качестве типичных загрязнителей были выбраны четыре широко используемых триазоловых пестицида, включая флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол. Морковь была выбрана в этом исследовании в качестве репрезентативного растения для свежих, готовых к употреблению овощей. Морковная каллус первоначально подвергалась воздействию испытанных пестицидов в концентрации 100 мг/л. После экспозиции в течение 72 ч метаболиты экстрагировали для оценки цитотоксичности с использованием клеточной линии Caco-2. Этот метод может быть легко расширен для оценки интегральной цитотоксичности метаболитов других типов загрязнителей в растениях.

протокол

1. Дифференциация морковной каллуса

Примечание: Подробный протокол дифференциации мозоли моркови был описан в предыдущем исследовании¹². Вот краткое описание.

1. Стерилизовать поверхность яровизированных семян 75% этанолом в течение 20 минут, а затем 20% H₂O₂ в течение 20 минут. Промойте дистиллированной водой не менее 3 раз.
2. Высевают семена на безгормональную среду из агара-желли (1% по массе) Мурашиге и Скуга (MS) (pH =5,8, автоклавирование при 121 °C) и инкубируют их в течение 16 ч фотопериода (350 мкмоль/м²с) при 26 °C в течение 15 дней для формирования рассады.
3. Соберите экспланты, разрезав гипокотиль и семядоль рассады на мелкие кусочки (0,5 см) и инкубируйте экспланты в среде MS, содержащей ауксимон 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и фитокинин 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина при 26 °C в темноте в течение 3-4 недель для индуцирования каллуса.
4. Соберите каллус (около 1 см в диаметре, компактный) с помощью скальпелей и щипцов.

2. Обработка мозоли моркови пестицидами

1. Флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол растворить по 10 мг в 100 мл стерильной среды МС с конечными концентрациями 100 мг/л (рН 5,6-7,0).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация обработки испытуемых пестицидов была выбрана в качестве максимальной 50% концентрации ингибирования роста клеток (IC₅₀) в клетке Caco-2.
2. Смешайте 3 г морковной каллуса (с шага 1.4) с 10 мл приготовленных растворов пестицидов (с шага 2.1) в стеклянных колбах в стерильных условиях.
3. Смешайте 3 г морковной каллуса (с шага 1.4) с 10 мл асептической среды MS в стеклянных колбах в стерильных условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все стеклянные колбы были автоклавными.
4. Инкубируйте морковную каллус (из этапов 2.2 и 2.3) при 130 об/мин и 26 °C в темноте в течение 72 часов.
   Установите все процедуры в трех экземплярах.
5. Соберите морковную мозоль из среды путем фильтрации с помощью фильтров из стекловолокна (0,45 мкм) после инкубации в течение 72 ч. Промойте мозоль сверхчистой водой 3 раза.
6. Сублимационную сушку мозолей с помощью сублимационной сушилки при температуре -55 °C, а затем гомогенизацию с помощью высокопроизводительной шлифовальной машины для салфеток с частотой 70 Гц в течение 3 минут.

3. Химическая экстракция морковной каллуса

1. Смешайте в центрифужной пробирке (10 мл) 0,2 г измельченного порошка лиофилизированной каллуса с 3 мл ацетонитрила.
2. Проведите вихревую обработку центрифуги в течение 8 минут, а затем обработайте ее ультразвуком в течение 5 минут (150 Вт, 40 кГц).
3. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетирования после центрифугирования при 8 000 x g при 4 °C в течение 10 минут.
4. Повторите процедуру экстракции 3 раза и сгруппируйте экстракты в чистой центрифужной пробирке (10 мл).
5. Сконцентрируйте собранные экстракты до сухости с помощью концентратора для продувки азотом при температуре 40 °C.
6. Остатки экстрактов (начиная с шага 3.5) повторно растворить в 1 мл модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) с 0,3% диметилсульфоксидом (DMSO).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки на этапе 3.6 были получены из экстрактов каллуса, обработанного пестицидами (из этапа 2.2).
7. Повторно растворите остатки экстрактов (начиная с шага 3.5) с 1 мл DMEM с 0,3% ДМСО и растворите 1 мг флусилазола, диниконазола, тебуконазола и пропиконазола в 4 разных пробирках соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки на шаге 3.7 были получены из экстрактов пустой каллуса (из шага 2.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM готовили из 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков (пенициллин и стрептомицин).

4. Реанимация клетки Caco-2

Примечание: Все реагенты и материалы, участвующие в тестах клеток Caco-2, были автоклавированы в течение 20 минут и стерилизованы под ультрафиолетовым светом в течение 2 часов.

1. Извлеките пробирку для криоконсервации (для хранения замороженных клеток) из резервуара с жидким азотом и быстро перенесите ее на водяную баню при температуре 37 °C. Непрерывно встряхивайте его, чтобы замерзший раствор оттаял.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания воды через крышку криоконсервационной трубки при встряхивании.
2. Продезинфицируйте поверхность пробирки для криоконсервации 75% спиртом после того, как замерзший раствор оттает. Быстро переложите клеточный раствор в стерильную центрифужную пробирку с помощью пипетирования.
3. Удалите надосадочную жидкость из пробирки для криоконсервации после центрифугирования при температуре 1 000 x g при 4 °C в течение 3 минут. Добавьте 1 мл DMEM и приостановите клетки, слегка постукивая и встряхивая.
4. Перенесите клеточную суспензию (из шага 4.3) в стеклянную колбу с помощью пипетирования. Добавьте 5 мл DMEM в стеклянную колбу, и аккуратно встряхните стеклянную колбу, чтобы равномерно распределить клетки.
5. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.4 выполнялись на очень чистой скамейке.

5. Прохождение ячейки Caco-2

1. Выньте стеклянную колбу из инкубатора и выбросьте питательную среду, когда плотность клеток достигнет более 80%. Промойте клетки PBS 3x.
2. Добавьте 1 мл раствора трипсин-ЭДТА и равномерно распределите его, чтобы обеспечить полный контакт с клетками.
3. Удаляют пищеварительный раствор, когда клетки уменьшаются от прилипшей формы до небольшой круглой точки и не подвешиваются под наблюдением микроскопа (100-кратное увеличение). Осторожно постучите по стенке колбы, чтобы вызвать удаление ячеек.
4. Добавьте 2 мл DMEM, повторите полоскание стенки колбы 10 раз, осторожно постучите по стенке колбы и переложите 1 мл клеточной суспензии в другую стеклянную колбу.
5. Добавьте 5 мл DMEM в стеклянные колбы. Аккуратно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить ячейки.
6. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2. Заменяйте питательную среду свежей DMEM каждые 24 ч до тех пор, пока плотность клеток не превысит 80%.
7. Повторяйте процедуры пассажа клеток до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество клеток (примерно 2 x 10⁶) для следующих тестов на воздействие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 5.1-5.5 выполнялись на сверхчистой скамейке. Количество клеток определяли с помощью гемоцитометра¹⁹.

6. Экспозиция клетки Caco-2

1. Извлеките стеклянные колбы (из пункта 5.7) из инкубатора и повторите шаги 5.1-5.4 для сбора ячеек.
2. Осторожно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить клетки и перенести суспензию клеток в центрифужную пробирку (15 мл).
3. Разбавляют клеточную суспензию (начиная со стадии 6.2) с помощью DMEM в сочетании с цитометрией до достижения клеточной плотности примерно 1 x 10⁵ клеток/мл. Аккуратно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить ячейки.
4. Добавьте 100 мкл PBS в наружные лунки 96-луночного планшета для предотвращения испарения питательной среды из-за краевого эффекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно постукивайте по стенке центрифужной пробирки, чтобы поддерживать однородность клеточной суспензии.
5. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии (начиная с шага 6.3) в левую лунку 96-луночного планшета и дайте отдохнуть в течение 10 минут.
6. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C с 5%_CO2 в течение 48 часов.
7. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора после инкубации в течение 48 ч и выбросьте питательную среду.
8. Установите группу метаболитов пестицидов, добавив по 100 мкл растворов (из шага 3.6) в каждую лунку.
   Примечание: В каждой лунке на этапе 6.8 метаболиты пестицидов были получены из родителей 0,1 мг.
9. Установите родительскую группу пестицидов, добавив 100 мкл растворов (из шага 3.7) в каждую лунку для сравнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой лунке на этапе 6.9 содержали 0,1 мг пестицида-родителя.
10. Установите холостой контроль, добавив 100 мкл DMEM с 0,3% ДМСО в каждую лунку. Используйте по шесть лунок для каждой группы (шаг 6.8-6.9).
11. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6.1-6.5 и 6.7-6.10 выполнялись на сверхчистой скамье.

7. Оценка жизнеспособности клеток

1. Извлеките из инкубатора планшет на 96 лунок (начиная с 6.11) и выбросьте питательную среду после выдержки в течение 24 часов. Промойте клетки PBS 2x.
2. Добавьте по 100 мкл DMEM в каждую лунку, а затем добавьте по 10 мкл реагентов CCK-8. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить ячейки.
3. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 4 ч.
4. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора после инкубации в течение 4 часов и измерьте оптическое поглощение (OD) на длине волны 450 нм с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
5. Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующему уравнению:
   жизнеспособность клеток (%) = (_{Экспериментальная группа} ОД - ОД_ДМЭМ) / (_{контроль} ОД - ОД_ДМЭМ)×100%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.1-7.2 выполнялись на сверхчистой скамье.

Результаты

На рисунке 1 представлена схема предложенного метода получения, экстракции и оценки цитотоксичности метаболитов пестицидов в каллусе моркови. На рисунке 2 представлены кривые поглощения и кинетики метаболизма испытуемых пестицидов, ?...

Обсуждение

Данный протокол был разработан для оценки интегральной цитотоксичности метаболитов триазоловых пестицидов в растениях путем объединения моделей каллуса растений и клеток человека. Важнейшими шагами для этого предлагаемого протокола являются культивирование калл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500 mL
96-well plate	Thermo Fisher
Acetonitrile	Sigma-Aldrich
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,Ltd	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
Caco-2 cells	Nuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
CCK8 reagents	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China	G021-1-3
Centrifuge	Thermo Fisher
CO2 incubator	Labtrip	HWJ-3-160
Dimethyl sulfoxide	Solarbio Life Sciences	D8371
Diniconazole, 98.7%	J&K Scientific	83657-24-3
Dulbecco's modified Eagle's medium	Solarbio Life Sciences	11965-500 mL
electronic balance	Shanghai Precision Instrument Co., Ltd	FA1004B
Fetal bovine serum	Cellmax
Fluorescence spectrophotometer	Tecan	Infinite M200
Flusilazole, 98.5%	J&K Scientific	85509-19-9
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Inverted microscope	Leica Biosystems	DMi1
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
Nitrogen blowing concentrator	AOSHENG	MD200-2
PBS	Solarbio Life Sciences	P1022-500 mL
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio Life Sciences	P1400-100 mL
Propiconazole, 100%	J&K Scientific	60207-90-1
Research plus	Eppendorf	10-1000 μL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.	THZ-98AB
Tebuconazole, 100%	J&K Scientific	107534-96-3
Trypsin-EDTA solution	Solarbio Life Sciences	T1300-100 mL
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized super clean bench	AIRTECH
Vortex instrument	Wuxi Laipu Instrument Equipment Co., Ltd	BV-1010