佳伟胜江散对糖尿病肾病大鼠模型的拮抗作用：与 EGFR/MAPK3/1 信号通路相关

摘要

在这里，我们提出了一个描述网络药理学和分子对接技术的方案，以探索嘉味盛江散 （JWSJS） 治疗糖尿病肾病的作用机制。

摘要

我们旨在深入研究 Jiawei Shengjiang San （JWSJS） 治疗糖尿病肾病和部署网络药理学作用的机制。利用网络药理学和分子对接技术，我们预测了 JWSJS 的活性成分和靶点，并构建了一个细致的“药物-成分-靶点”网络。利用基因本体论 （GO） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 富集分析来识别 JWSJS 的治疗途径和靶点。部署 Autodock Vina 1.2.0 进行分子对接验证，并进行 100 ns 分子动力学模拟以确认对接结果，然后进行 体内 动物验证。研究结果显示，JWSJS 与糖尿病肾病共享 227 个交叉靶点，构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络拓扑。KEGG 富集分析表明，JWSJS 通过调节脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路、细胞凋亡和 HIF-1 信号通路减轻糖尿病肾病，丝裂原活化蛋白激酶 1 （MAPK1）、MAPK3、表皮生长因子受体 （EGFR） 和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 （AKT1） 被确定为多个通路的集体靶点。分子对接断言 JWSJS 的核心成分 （槲皮素、棕榈油酸和木犀草素） 可以通过氢键稳定与三个关键靶点 （MAPK1、MAPK3 和 EGFR） 的构象。 体内 检查表明，由于 JWSJS，体重显着增加，糖化血清蛋白 （GSP） 、低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C） 、三磷酸尿苷 （UTP） 和空腹血糖 （FBG） 水平降低。电子显微镜结合苏木精和伊红 （HE） 以及高碘酸-希夫 （PAS） 染色突出了每个治疗组在不同程度上减轻肾脏损伤的潜力，表现出 p-EGFR 、 p-MAPK3/1 和 BAX 的不同下降，以及 BCL-2 表达的增加治疗大鼠的肾脏组织。总之，这些见解表明，JWSJS 对糖尿病肾病的保护作用可能与抑制 EGFR/MAPK3/1 信号通路的激活和减轻肾细胞凋亡有关。

引言

糖尿病 （DM） 是一种影响多个系统的慢性疾病，可因持续高血糖而引起各种并发症，例如糖尿病肾病 （DN）、视网膜病变和神经病变¹。DN 是 DM 的一种严重并发症，约占终末期肾病 （ESRD） 的 30%-50%²。其临床表现为微量白蛋白尿，可进展为 ESRD，其特征是肾小球体积增加、系膜基质增生和肾小球基底膜增厚³。DN 的发病机制很复杂，尚未完全阐明。临床方法如降低血糖、调节血压、减少蛋白尿等多用于延缓其进展，但效果一般。

目前，尚未发现治疗 DN⁴ 的特异性药物。然而，几个世纪以来，中草药已广泛用于治疗 DM 及其并发症⁵ ，并改善了患者的临床症状并延缓了疾病进展。由于中草药具有多组分、多靶点、多通路效应的优势，有望成为治疗 DN⁶ 的创新药物来源。

“生江散”起源于明代医医龚庭贤的《万兵汇春》。《内浮仙坊》一书描述了 Bombyx Batryticatus、Cicadae periiostracum、Curcumaelongae Rhizoma 和 Radix Rhei et Rhizome 的用途。基于此，在添加 Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba 和 Smilacis Glabrae Rhixoma 后，它发挥了胜江散增清、降浊、释滞“热”、调“气”血的功能 ^7,8。它还可以增加健脾和补肾的效果。它的功效与 DN 的“气”因缺乏“生命能量”、过度干燥和“热”以及三重增能器引起的“热”停滞而无序上升和下降的发病机制一致 ^7,8。

既往临床研究表明，中草药已被用于治疗 DM 及其并发症，而甲味生姜散 （JWSJS） 已被证明可以调节血糖和血脂，减少蛋白尿，并显着提高早期 DN⁷ 患者的临床疗效。JWSJS 降低 DN 大鼠尿蛋白和血糖水平的能力已被先前的研究证实。这可能是通过抑制 TXNIP/NLRP3 和 RIP1/RIP3/MLKL 信号通路，减少足细胞焦亡，防止 DN 大鼠肾组织坏死凋亡，从而实现肾脏保护⁹。JWSJS 可以上调 DN 大鼠肾蛋白和波多辛蛋白的表达，减少足细胞损伤，从而表明 JWSJS 对足细胞损伤具有抑制作用。JWSJS 具有一定的抗 DN 作用，安全性良好，但对其研究较少，这项工作主要集中在细胞焦亡和坏死细胞凋亡上。文献不够深入或系统¹⁰。我们以前的研究结果证实，JWSJS 可以减少 DN 大鼠的蛋白尿并减轻肾脏损伤⁷。然而，关于 JWSJS 治疗 DN 机制的研究很少，缺乏深度和系统化。因此，本研究旨在利用网络药理学分析 JWSJS 治疗 DN 的分子物质和作用机制，为未来的研究提供坚实的基础。

网络药理学是研究药物作用机制的新兴方法，包括化学信息学、网络生物学、生物信息学和药理学^11,12。网络药理学研究设计与传统中医的整体概念^13,14 非常相似，是研究中草药机制的重要方法。分子对接可以研究分子之间的相互作用并预测它们的结合模式和亲和力。分子对接已成为计算机辅助药物研究领域的一项关键技术¹⁵。因此，本研究通过网络药理学和分子对接方法构建了 JWSJS-DN-靶点相互作用网络，为进一步探索 JWSJS 治疗 DN 提供了可靠的理论依据。

研究方案

所有动物均按照美国国家研究委员会实验动物护理和使用指南第 8^版进行维护和使用，并按照 ARRIVE 指南中的建议进行报告^16,17。该研究是根据中国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》进行的，并获得了河北中医药大学动物伦理委员会 （DWLL2019030） 的批准。

1. JWSJS 活性成分和靶标集合

1. 将药物成分 JWSJS（Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba、Smilacis Glabrae Rhixoma、Radix Rhei et Rhizome 和 Curcumaelongae Rhizoma）输入中医系统药理学数据库和分析平台 （TCMSP） 数据库¹⁸ 以检索所有化学成分。 根据吸收、分布、代谢和排泄 （ADME） 筛选口服生物利用度 （OB） ≥ 30% 和药物样性质 （DL） ≥ 0.18 种化学成分^19,20。
2. 使用 TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php，版本 2.3）检索化学成分的相应靶标。
3. 通过搜索中药和化学成分数据库²¹ 获得 Bombyx Batryticatus 和 Cicadae periiostracum 的活性成分。
4. 为了提高实验的可信度，为本研究选择具有化学文摘服务 （CAS） 编号的化合物。然后从 PubChem 下载活性成分的 2D 结构图（.sdf 格式）（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，2021 年更新）²²。
5. 使用 SwissADME （www.swissadme.ch，2021 年更新）²³筛选胃肠道 （GI） 吸收率高的成分作为药物相似性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge），其≥ 2 项为“是”。这导致了 Bombyx Batryticatus 和 Cicadae Periostracum 的活性成分。
6. 将这些导入 TCMSP 数据库以进行目标蛋白质预测（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，版本 2.3）¹⁸。
7. 在 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org，2021 年更新）中标准化目标，状态设置为 “已审查” ，物种设置为 “人类²⁴”。

2. DN 对应的 target 集合

1. 通过 GeneCards（https://www.genecards.org/，版本 5.1）²⁵、OMIM（https://omim.org/，2021 年更新）²⁶、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/，2021 年更新）²⁷、PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/，2021 年更新）²⁸ 和 DrugBank 数据库（https://www.drugbank.ca/，2021 年更新）²⁹。合并去重后获取 DN 的目标。
2. JWSJS 和 DN 常见目标的筛选及网络构建
   1. 使用 R 4.2.0 软件筛选 JWSJS 和 DN 的常见目标，并绘制维恩图。将 JWSJS 的活性成分和潜在靶点导入 Cytoscape 3.8.0 软件³⁰ 中，构建 药物-成分-靶点 网络图，可视化药物、成分、靶点和疾病之间的联系。
   2. 让节点的大小反映 degree 值的大小，其中 degree 值越高表示节点在网络中更重要。
3. PPI 蛋白-蛋白相互作用网络的构建和核心靶点的筛选
   1. 使用在线平台 STRING（版本：11.5）分析交叉基因以构建蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络³¹。使用 多种蛋白质 分析模式构建网络，将物种设置为 Homo sapiens，并将所需的最低交互分数设置为 >0.9³⁰。
   2. 使用 Cytoscape 3.8.0 对网络进行拓扑分析，计算每个节点的中介中心性 （BC）、接近中心性 （CC）、度中心性 （DC）、特征向量中心性 （EC）、基于局部平均连通性的方法 （LAC） 和网络中心性 （NC） 值，并筛选出所有值均大于中位数³² 的 6 个节点。重复此过程数次，以确定 JWSJS 用于 DN 治疗的核心靶点。
4. GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析
   1. 进行 GO 和 KEGG 富集分析，以确定与 JWSJS 和 DN 的共同靶标相关的生物过程、分子功能、细胞成分和通路。
   2. 使用 组织。Hs.eg.db 软件包获取交集目标的 ID，并使用 clusterProfiler org.用于富集分析的 Hs.eg.db、Enrichplot 和 ggplot2 包³³.
   3. 筛选校正 P 值为 0.05 的前 10 个生物学命中<功能性 GO 富集分析，并选择富集度最高的前 30 条通路进行 KEGG 分析。

3. 分子对接

1. 使用 AutoDock Vina 软件在 JWSJS 核心组分和 DN 疗法的核心靶点之间进行分子对接³⁴。
2. 在 PubChem 数据库中搜索，获取 JWSJS 核心组件的 2D 结构的 sdf 文件。使用 ChemBio 3D Ultra14.0 软件生成和优化其 3D 结构，将其保存为 mol2 格式，并将其用作配体文件。
3. 从结构生物信息学研究合作实验室 （RCSB） 蛋白质数据库 （PDB） 数据库中查找并下载核心靶标 3D 结构的 pdb 格式。使用 Pymol 2.4.0 软件从蛋白质结构中去除水分子和配体，保存为 pdb 格式，并用作受体文件。
4. 将受体 pdb 文件导入 AutoDockTools 1.5.7 软件进行氢化，将受体蛋白和小分子配体都转换为 pdbqt 格式，为受体蛋白设置活性口袋，间距系数设置为 1。
5. 使用 Autodock vina 1.2.0 进行分子对接并计算结合能;如果 Affinity < 0，则认为分子自发地与蛋白质结合，Affinity 的绝对值越大，表示它们之间的结合越稳定。最后，使用 Pymol 2.3.0 和 LigPlot 2.2.5 软件可视化对接结果。

4. 分子动力学模拟

1. 要使用 Desmond 软件执行 MD 模拟，请执行以下步骤：
   1. 使用 Desmond 软件的 2019-1 学术版来评估蛋白质-配体相互作用的稳定性和灵活性。
   2. 对从对接研究中衍生的三种最有前途的配体复合物进行分子动力学 （MD） 研究。在含有 0.15 M NaCl 的 SPC 水性环境中进行模拟，复制生理离子条件。模拟框的设计旨在确保溶质与其边界保持至少 10 Å 的距离。引入反离子以中和系统的电荷。此外，还应用了由 OPLS 2005 力场参数控制的周期性边界条件。
   3. 使用 Desmond 默认参数启动 100 ps 的能量最小化阶段。
   4. 通过 Nosé-Hoover 链和 Martyna-Tobias-Klein 方法，确保所有生产 MD 系统的温度和压力稳定在 26.85 °C （300 K） 和 1.01325 bar。分子动力学模拟以 2 fs 的时间步长执行，总持续时间为 100 ns，每 100 ps 记录一次原子坐标。
   5. 打开模拟交互图 （SID） 模块。将仿真结果数据文件加载到模块中。
   6. 从模块中的可用选项中选择所需的分析类型（例如，均方根偏差 [RMSD]、均方根波动 [RMSF]、氢键分析等）。指定所选分析类型所需的任何其他参数。
   7. 通过单击 Analyze 或 Start 按钮运行分析。
   8. 分析完成后，在 SID 模块界面中查看和解释结果。如果需要，请导出结果以供进一步使用或演示。

5. 动物实验验证

1. 动物和实验设计
   注：本研究涉及 75 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠，这些大鼠来自 SPF 级动物生产设施，年龄为 8 周龄，体重为 150 克± 20 克（动物生产证书编号 SCXK [河北] 2018-004）。
   1. 将大鼠饲养在 SPF 级动物实验室中，并在适应性喂养 1 周后将它们随机分为正常组和模型组。为正常组提供正常饮食，为模型组提供高糖和高脂肪饮食。4 周后，让大鼠禁食，但不要剥夺它们的水 12 小时。
   2. 用腹膜内注射链脲佐菌素 （STZ;35 mg·^kg-1） 注射模型组。72 小时后，通过尾静脉采血测试血糖水平。如果空腹血糖水平为 ≥16.7 mmol·^L-1，确认它是一个成功的糖尿病模型。
   3. 通过观察大鼠肾脏的组织病理学变化来确认成功的 DN 模型。
   4. 将成功复制的模型随机分为模型组，该模型组接受 JWSJS，分别为 4.37 g/kg、8.73 g/kg 和 17.46 g/kg（相当于临床等效剂量的 3.2、6.3 和 12.6 倍）以及厄贝沙坦组（0.014 g/kg）。每组由 10 只大鼠组成。通过口服强饲法每天一次服用所有药物。始终如一地维持这种给药方案 4 周。
   5. 使用腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 麻醉大鼠，并通过失去踏板撤退反射来确认适当的麻醉。安乐死前从腹主动脉采集血样。
   6. 使用150mg / kg剂量腹膜内注射戊巴比妥钠对大鼠实施安乐死后收集肾脏。
      注意：按照最新的美国兽医协会 （AVMA） 安乐死指南 （https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals），对动物进行了人道安乐死。
2. 肾脏组织学分析
   注意：将肾组织固定在 4% 多聚甲醛中，并在 48 小时后在乙醇中脱水;切片包埋在石蜡中。将切片切成薄片 （4 μm） 进行苏木精和伊红 （HE） 和过碘酸-希夫 （PAS） 染色，并在光学显微镜下观察肾脏组织学的形态学变化。
   1. HE 染色：
      1. 脱蜡和水合：用二甲苯 I 和 II（各 10 分钟）、无水醇 I 和 II（各 3 分钟）处理组织切片。然后，将组织切片浸入 95%、90%、80% 和 70% 乙醇中（每次 2 分钟），然后用蒸馏水洗涤 5 分钟。
      2. 将组织切片置于苏木精染色中 5 分钟，然后用盐酸醇区分切片 5 秒。
      3. 将切片置于伊红染色溶液中 3 分钟。
      4. 脱水、澄清和封片：在不同时间用不同的乙醇（70%、80%、90%、95% 和无水乙醇）对切片脱水，然后在二甲苯 I 和 II 中清洗它们，然后用中性胶封片。
   2. PAS 染色：
      1. 按照步骤 5.2.1 中描述的脱蜡步骤，用高碘酸染色溶液处理切片 ~8 分钟。
      2. 用蒸馏水冲洗切片 2 分钟，然后用 Schiff 试剂在黑暗中染色 15 分钟。
      3. 用 Schiff 试剂处理切片后，用自来水清洗切片 10 分钟。
      4. 使用苏木精对切片进行复染 1 分钟，然后用 HCl-醇区分它们 30 秒。在自来水中再次清洗切片 5 分钟，使细胞核染成蓝色。
   3. 电子显微镜检查：
      1. 将样品在 2.5% 戊二醛中固定 3 小时，然后在 PBS 中冲洗 3 小时。此外，在 1% 渗透酸中处理样品 3 小时，然后在 PBS 中再次冲洗 3 小时。
      2. 通过一系列渐进的酒精浴脱水，最后以丙酮结束（每个步骤总共持续约 2 小时）。
      3. 在室温 （RT） 下用环氧丙烷和环氧树脂 （1：1） 的混合物浸润样品 2 小时，然后在 37 °C 下用纯环氧树脂再渗透 2 小时。
      4. 在此之后，在切片前36小时内在越来越高的温度下固化和硬化样品。该工艺可确保组织被树脂彻底浸润，然后硬化以允许进行电子显微镜检查的薄切片。
      5. 用 3% 乙酸铀酰和铅酸双重染色，并在 15 分钟内通过电子显微镜观察和拍摄样品。
         注意：透射电子显微镜 （TEM） 设置如下：在高对比度模式 （Zoom-1 HC-1） 下放大 7000 倍，在 TEM 系统上加速电压为 80.0 kV。
3. 免疫组化
   1. 脱蜡：将组织切片分别置于二甲苯 I 和 II 中 10 分钟。
   2. 再水化：将脱蜡的组织切片依次放入无水乙醇 I 和 II 中各 3 分钟，然后放入 95%、90%、80% 和 70% 乙醇中各 2 分钟，再水化。
   3. 抗原修复：将组织切片在高压下浸入 0.1 M 柠檬酸盐-柠檬酸缓冲溶液中约 5 分钟，然后冷却至 RT。
   4. 封闭：为防止抗体的非特异性结合，通过将组织切片与 5% 正常山羊血清在约 37 °C 下孵育 30 分钟来封闭。
   5. 一抗孵育：将一抗 p-EGFR（1：200 稀释）和 p-MAPK3/1（1：200 稀释）添加到组织切片上，并在 4 °C 的加湿室中孵育过夜。
   6. 二抗孵育：用 PBS 洗涤切片 3 次，然后将生物素标记的二抗（根据制造商的说明在 PBS 中稀释）添加到切片上，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   7. 在 37 °C 下将辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素工作溶液涂在组织切片上，然后使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤三次。
   8. 对于 DAB 显影，将切片与 DAB 显影液一起孵育（在 RT 下避光 3 分钟），然后用蒸馏水冲洗。DAB 充当辣根过氧化物酶 （HRP） 的色原底物，该酶在氧化后变成棕色。
   9. 用苏木精复染约 2 分钟，用 1% 盐醇区分切片 5 秒，然后在流水下洗涤以变为蓝色。
   10. 通过将切片连续置于从低浓度到高浓度的一系列乙醇中脱水，在二甲苯 I 和 II 中澄清，并用中性胶固定切片。
       注：此过程大约需要 18-24 小时，包括过夜一抗孵育。
   11. 为每个切片随机选择三个视野 （200x），并使用图像分析软件分析切片的染色结果。按照以下步骤使用 Image Pro Plus 6.0 软件。
   12. 首先，将截面的图像导入软件中。
   13. 密度校正：为确保结果准确，请执行浓度校正。
       1. 导航到 测量 > 校准 > 强度 > 新建 > 标准> 图像 可选密度>选项。然后，单击图像的空白区域以记录背景值并通过单击确认 OK.
   14. 设置测量参数：设置测量参数以计算面积和积分光密度 （IOD）。
       1. 单击 Measure > Count/Size > Measure >选择 Measurements。选择 Area（100） 和 IOD，然后单击 OK。
       2. 转到 “选项”，选中 “样品上的深色背景”，“4-Connect Pre-Filter ”，然后单击 “确定”。
   15. 颜色选择：为了准确确定阳性，请选择颜色来检测染色区域与未染色区域。
       1. 单击基于 HSI > Histogram Select Colors > Histogram 。根据图片调整 H 值，同时保持 S 不变， I 在 0 到背景值之间。然后，单击确认 关闭.
       2. 数据收集和计算：通过单击“ > Data Collector > Layout”中的“度量”来执行数据收集和计算，其中选择了 “名称”、“面积（总和）”和“ IOD（总和） ”。然后，单击 Count > Collect Now > Data List 导出数据以供进一步分析或存储。
          注：这导致根据 IOD/面积对每个切片中的蛋白质表达进行半定量测量，这表明相对于分析的总面积存在多少蛋白质。
4. Western 印迹
   1. 获取肾组织并将其切成块。将这些碎片放入 1.5 mL 离心管中，加入预冷的蛋白质裂解液（50 mM Tris [pH 7.4]、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]），并匀浆。
   2. 将其在冰上放置 30 分钟，然后在 4 °C 下以 13400 x g 离心 20 分钟。 将所得样品储存在 -80 °C 冰箱中。
   3. 使用 Bradford 方法定量蛋白质。
      1. 将试剂和蒸馏水以 1：4 的比例混合，制备考马斯亮蓝工作溶液。
      2. 建立三个组 - 空白蛋白组、标准蛋白组和样品蛋白组。向每组中加入 3 mL 考马斯亮蓝工作溶液，空白组加入生理盐水，标准组加入标准蛋白，样品组加入提取的上清液蛋白。
      3. 让混合物静置 5 分钟后，使用紫外分光光度计测量其吸光度值。
      4. 使用以下公式计算样品浓度：蛋白质浓度 （mg/mL） =（样品吸光度值/标准管吸光度值）x 标准蛋白质浓度 x 5。
   4. 向每个蛋白质样品中加入等体积的 6x 上样缓冲液。在 100 °C 下煮沸 5 分钟，然后分装并储存在 -20 °C 冰箱中直至进一步使用。
   5. 进行标准电泳、印迹和封闭。
      1. 使用 12% 分离凝胶进行标准 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）。为浓缩胶施加 100 V 的恒定电压，为分离凝胶施加 120 V 的恒定电压，直到染料前沿到达凝胶底部。
      2. 使用湿式转移系统，将蛋白质在 100 V 下在 4 °C 的冷藏室中转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上 2 小时。
      3. 蛋白质转移后，在 RT 下用 TBST 中的 5% 脱脂牛奶封闭膜 1 小时。
   6. 在含 5% BSA 的 TBST 中稀释一抗 EGFR （1：2,000）、p-EGFR （1：2,000）、MAPK3/1 （1：2,000）、p-MAPK3/1 （1：2,000）、Bcl-2 （1：2,000）、BAX （1：2,000） 和 CAPDH （1：5,000）。加入这些稀释的一抗，并在 4 °C 下轻轻搅拌孵育膜过夜。
   7. 用 TBST 洗涤膜 3 次后，加入稀释的二抗 （1：5,000），然后孵育 1 小时。显色后，使用 ImageJ 软件对目标条带进行定量分析。
5. qPCR 分析
   1. 分组：将样品分配到组 - 对照、DN、厄贝沙坦、JWSJS-L、JWSJS-M、JWSJS-H。
   2. RNA 提取：进行组织匀浆和 RNA 提取，然后按照制造商的说明添加氯仿、离心和 RNA 沉淀。
   3. RNA 沉淀和洗涤：用异丙醇沉淀 RNA，然后用乙醇洗涤。
   4. RNA 增溶：干燥 RNA 沉淀并将其溶解在 DEPC 处理过的水中。
   5. cDNA 合成：按照制造商的说明使用特定的反应混合物进行逆转录。
   6. qPCR 扩增：使用 GAPDH、MAPK3、MAPK1 和 EGFR 的特异性引物进行 qPCR，并按照制造商的说明进行扩增。
      引物序列如下：
      GAPDH： F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'， R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3： F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3'， R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1： F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3'， R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR：F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3，R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'。

6. 统计方法

1. 使用适当的软件（例如 SPSS）执行分析，并将测量数据表示为平均值±标准差。如果数据满足正态分布和方差同质性的标准，则使用单因素方差分析在各组之间进行比较，并使用 Bonferroni 方法进行多重比较。
2. 如果方差不是同质的，则使用 T2 检验进行多重比较。将 P < 0.05 视为统计显著性。

结果

按照方案，根据 OB 和 DL 的既定标准，经过筛选和重复数据删除，最终从分析中获得 JWSJS 的 90 种活性成分。其中包括 20 种 Hedysarum multijugum Maxim、23 种 Epimrdii Herba、15 种光滑 根瘤病、16 种 大黄根茎、4 种 姜黄根瘤、15 种 蝉 Periostracum 和 6 种 Bombyx Batryticatus 成分。由于 JWSJS 中有许多活性成分，因此仅列出了 20 种（见 表...

讨论

我们的研究结合了网络药理学、分子对接和 体内 动物模型。一个关键步骤是建立“药物-成分-靶点”网络，这对于确定 JWSJS 治疗 DN 的潜在机制至关重要，特别关注其与 EGFR/MAPK3/1 信号通路的相互作用。

在这项研究中，我们进行了几次修改，特别是在分子对接过程中，以提高我们预测的准确性。故障排除主要集中在优化 体内 动物模型的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F