Efecto antagónico de Jiawei Shengjiang San en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe la farmacología de redes y las técnicas de acoplamiento molecular para explorar el mecanismo de acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética.

Resumen

Nuestro objetivo fue profundizar en los mecanismos que subyacen a la acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética y en el despliegue de la farmacología de red. Empleando técnicas de farmacología de redes y acoplamiento molecular, predijimos los componentes activos y las dianas de JWSJS y construimos una meticulosa red de "fármaco-componente-diana". Se utilizaron análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) para discernir las vías terapéuticas y los objetivos del JWSJS. Se implementó Autodock Vina 1.2.0 para la verificación del acoplamiento molecular, y se realizó una simulación de dinámica molecular de 100 ns para confirmar los resultados del acoplamiento, seguida de una verificación en animales in vivo . Los hallazgos revelaron que JWSJS compartía 227 objetivos que se cruzaban con la nefropatía diabética, construyendo una topología de red de interacción proteína-proteína. El análisis de enriquecimiento de KEGG denotó que JWSJS mitiga la nefropatía diabética mediante la modulación de los lípidos y la aterosclerosis, la vía de señalización PI3K-Akt, la apoptosis y la vía de señalización HIF-1, con la proteína quinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1), MAPK3, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la serina/treonina-proteína quinasa 1 (AKT1) identificados como objetivos colectivos de múltiples vías. El acoplamiento molecular afirmó que los componentes centrales de JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico y luteolina) podrían estabilizar la conformación con tres objetivos fundamentales (MAPK1, MAPK3 y EGFR) a través de enlaces de hidrógeno. Los exámenes in vivo indicaron un aumento notable del peso corporal y reducciones de las proteínas séricas glicosiladas (GSP), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), el trifosfato de uridina (UTP) y los niveles de glucosa en sangre en ayunas (FBG) debido al JWSJS. La microscopía electrónica junto con la hematoxilina y la eosina (HE) y la tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) destacaron el potencial de cada grupo de tratamiento para aliviar el daño renal en diversos grados, exhibiendo disminuciones variadas en p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX, e incrementos en la expresión de BCL-2 en los tejidos renales de las ratas tratadas. En conclusión, estos conocimientos sugieren que la eficacia protectora de JWSJS en la nefropatía diabética podría estar asociada con la supresión de la activación de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 y el alivio de la apoptosis de las células renales.

Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica que afecta a múltiples sistemas y puede causar diversas complicaciones debido a la hiperglucemia continua, como la nefropatía diabética (DN), la retinopatía y la neuropatía¹. La DN es una complicación grave de la DM, que representa alrededor del 30-50% de la enfermedad renal terminal (IRCT)². Su manifestación clínica es la microalbuminuria, que puede progresar a IRCT caracterizada por aumento del volumen glomerular, hiperplasia del estroma mesangial y engrosamiento de la membrana basal^{glomerular 3}. La patogenia de la DN es compleja y no ha sido completamente dilucidada. Los métodos clínicos, como la disminución de la glucosa en sangre, la regulación de la presión arterial y la reducción de la proteinuria, se utilizan principalmente para retrasar su progreso, pero el efecto es general.

En la actualidad, no se ha encontrado ningún fármaco específico para tratar la DN⁴. Sin embargo, durante siglos, las hierbas medicinales chinas han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento de la DM y sus complicaciones⁵ y han mejorado los síntomas clínicos de los pacientes y retrasado la progresión de la enfermedad. Debido a las ventajas de los efectos multicomponente, multiobjetivo y multivía, se espera que las hierbas medicinales chinas sean una fuente de fármaco innovadora para el tratamiento de la DN⁶.

"Shengjiang san" se originó a partir del "Wanbing Huichun" del médico de la dinastía Ming Gong Tingxian. El libro "Neifu Xianfang" describe el uso de Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma y Radix Rhei et Rhizome. En base a esto, después de agregar Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba y Smilacis Glabrae Rhixoma, ejerce la función de shengjiang san de aumentar la lucidez, disminuir la turbidez, liberar el "calor" estancado y armonizar el "qi" y la sangre ^7,8. También aumenta el efecto de fortalecer el bazo y tonificar los riñones. Su eficacia es consistente con la patogenia del "qi" de DN para subir y bajar de orden debido a la deficiencia de "energía vital", sequedad excesiva y "calor", y estancamiento del "calor" causado por un triple energizante ^7,8.

Estudios clínicos previos han demostrado que las hierbas medicinales chinas se han utilizado para tratar la DM y sus complicaciones, y se ha demostrado que el jiawei shengjiang san (JWSJS) regula la glucosa y los lípidos en sangre, reduce la proteinuria y mejora significativamente la eficacia clínica de los pacientes con DN temprano⁷. La capacidad de JWSJS para reducir los niveles de proteína urinaria y glucosa en sangre en ratas DN ha sido confirmada por estudios previos. Esto probablemente sucede mediante la inhibición de las vías de señalización TXNIP/NLRP3 y RIP1/RIP3/MLKL, reduciendo la piroptosis de podocitos y previniendo la apoptosis necrótica en los tejidos renales de ratas DN, logrando así la protección renal⁹. El JWSJS puede aumentar la expresión de la nefrina y la proteína podocina y reducir la lesión de los podocitos en ratas DN, lo que sugiere que el JWSJS tiene un efecto inhibidor sobre la lesión de los podocitos. El JWSJS tiene un cierto efecto anti-DN con buenos perfiles de seguridad, pero hay poca investigación al respecto, y este trabajo se centra principalmente en la piroptosis y la apoptosis necrótica. La literatura no es lo suficientemente profunda ni sistemática¹⁰. Nuestros hallazgos previos han confirmado que el JWSJS puede reducir la proteinuria y aliviar el daño renal en ratas DN⁷. Sin embargo, existen pocos estudios sobre el mecanismo del JWSJS para el tratamiento de la DN, y estos carecen de profundidad y sistematización. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo analizar las sustancias moleculares y los mecanismos de acción de JWSJS para el tratamiento de la DN utilizando farmacología en red y proporcionar una base sólida para futuras investigaciones.

La farmacología de redes es un método emergente para estudiar el mecanismo de acción de los fármacos, incluyendo la quimioinformática, la biología de redes, la bioinformática y la farmacología^11,12. El diseño de la investigación en farmacología en red es bastante similar al concepto holístico de la medicina tradicional china^13,14, y es un método importante para estudiar el mecanismo de las hierbas medicinales chinas. El acoplamiento molecular puede estudiar las interacciones entre moléculas y predecir sus patrones de unión y afinidad. El acoplamiento molecular se ha convertido en una técnica crítica en el campo de la investigación farmacológica asistida por ordenador¹⁵. Por lo tanto, este estudio construyó una red de interacción JWSJS-DN-diana a través de métodos de farmacología de red y acoplamiento molecular que ofrece una base teórica y confiable para una mayor exploración del tratamiento de DN con JWSJS.

Protocolo

Todos los animales fueron mantenidos y utilizados de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,^8ª Edición, y fueron reportados como se recomienda en las guías ARRIVE^16,17. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de China para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Hebei (DWLL2019030).

1. Ingredientes activos de JWSJS y colección de objetivos

1. Ingrese la composición medicinal JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome y Curcumaelongae Rhizoma) en la base de datos de la base de datos de la plataforma de análisis y farmacología de los sistemas de medicina tradicional china (TCMSP)¹⁸ para recuperar todos los componentes químicos.  De acuerdo con la pantalla de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME), la biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y las propiedades similares a los medicamentos (DL) ≥ 0,18 ingredientes químicos^19,20.
2. Utilice la base de datos TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, versión 2.3) para recuperar los objetivos correspondientes de ingredientes químicos.
3. Obtener los ingredientes activos de Bombyx Batryticatus y Cicadae Periostracum mediante la búsqueda en las bases de datos de Medicina Tradicional China y Composición Química²¹.
4. Para mayor credibilidad experimental, seleccione compuestos con números de servicio de resúmenes químicos (CAS) para este estudio. A continuación, descargue los diagramas de estructura 2D (formato .sdf) de los ingredientes activos de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, actualizados en 2021)²².
5. Utilice SwissADME (www.swissadme.ch, actualizado en 2021)²³para detectar los componentes con alta absorción gastrointestinal (GI) como similitud farmacológica (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) cuyos ≥ 2 ítems fueron "Sí". Esto condujo a los componentes activos de Bombyx Batryticatus y Cicadae Periostracum.
6. Importarlos a la base de datos TCMSP para la predicción de proteínas diana (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Versión. 2.3)¹⁸.
7. Estandarizar los objetivos en la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org, actualizada en 2021) con el estado establecido como Revisado y las especies establecidas como Humano²⁴.

2. Colección de destino DN correspondiente

1. Búsqueda de nefropatía diabética a través de GeneCards (https://www.genecards.org/, Versión. 5.1)²⁵, OMIM (https://omim.org/, actualizado en 2021)²⁶, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, actualizado en 2021)²⁷, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, actualizado en 2021)²⁸ y bases de datos de DrugBank (https://www.drugbank.ca/, actualizado en 2021)²⁹. Obtenga los objetivos de DN después de combinar y desduplicar.
2. Cribado de objetivos comunes de JWSJS y DN y construcción de redes
   1. Filtre los objetivos comunes de JWSJS y DN utilizando el software R 4.2.0 y dibuje diagramas de Venn. Importe los ingredientes activos y los objetivos potenciales de JWSJS en el software Cytoscape 3.8.0³⁰ para crear un diagrama de red Medicamento-Ingrediente-Objetivo que visualice la conexión entre medicamentos, ingredientes, objetivos y enfermedades.
   2. Deje que el tamaño del nodo refleje el tamaño del valor de grado, donde un valor de grado más alto indica que el nodo es más importante en la red.
3. Construcción de la red de interacción proteína-proteína de PPI y cribado de dianas principales
   1. Analice los genes que se cruzan utilizando la plataforma en línea STRING (Versión:11.5) para construir una red de interacción proteína-proteína (PPI)³¹. Construya la red utilizando un modo de análisis de proteínas múltiples , establezca la especie en Homo sapiens y establezca la puntuación de interacción mínima requerida en >0,9³⁰.
   2. Utilice Cytoscape 3.8.0 para analizar la red topológicamente, calcular la centralidad de intermediación (BC), la centralidad de cercanía (CC), la centralidad de grado (DC), la centralidad del vector propio (EC), el método basado en la conectividad (LAC) promedio local y los valores de centralidad de la red (NC) para cada nodo, y descartar los seis nodos con todos los valores mayores que la mediana³². Repita este proceso varias veces para identificar los objetivos principales de JWSJS para la terapia de DN.
4. Análisis funcionales de GO y análisis de enriquecimiento de la vía KEGG
   1. Realizar análisis de enriquecimiento de GO y KEGG para identificar los procesos biológicos, las funciones moleculares, los componentes celulares y las vías asociadas con los objetivos comunes de JWSJS y DN.
   2. Utilice la org. Hs.eg.db paquete para obtener los ID de los destinos de intersección y utilizar clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot y ggplot2 para análisis de enriquecimiento³³.
   3. Evalúe el análisis de enriquecimiento funcional de GO en los 10 principales resultados biológicos con un valor P corregido < 0,05, y seleccione las 30 vías principales con el mayor enriquecimiento para el análisis KEGG.

3. Acoplamiento molecular

1. Utilice el software AutoDock Vina para realizar el acoplamiento molecular entre los componentes principales de JWSJS y los objetivos principales para la terapia DN³⁴.
2. Busque en la base de datos de PubChem para obtener el archivo sdf de la estructura 2D de los componentes principales de JWSJS. Utilice el software ChemBio 3D Ultra14.0 para generar y optimizar su estructura 3D, guárdelo en formato mol2 y utilícelo como archivo de ligando.
3. Busque y descargue el formato pdb de la estructura 3D de los objetivos principales de la base de datos del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Utilice el software Pymol 2.4.0 para eliminar las moléculas de agua y los ligandos de la estructura de la proteína, guardarlo en formato pdb y utilizarlo como archivo receptor.
4. Importe el archivo pdb del receptor en el software AutoDockTools 1.5.7 para la hidrogenación, convierta tanto la proteína receptora como el ligando de molécula pequeña en formato pdbqt, establezca el bolsillo activo para la proteína receptora con el coeficiente de espaciado establecido en 1.
5. Utilice Autodock vina 1.2.0 para el acoplamiento molecular y calcule la energía de enlace; si la afinidad < 0, considere que la molécula se une espontáneamente con la proteína, un mayor valor absoluto de afinidad indica una unión más estable entre ellas. Por último, visualice los resultados del acoplamiento utilizando el software Pymol 2.3.0 y LigPlot 2.2.5.

4. Simulación dinámica molecular

1. Para realizar simulaciones de MD utilizando el software Desmond, siga estos pasos:
   1. Emplear la versión académica 2019-1 del software Desmond para evaluar la estabilidad y flexibilidad de las interacciones proteína-ligando.
   2. Llevar a cabo investigaciones de dinámica molecular (MD) en un trío de los complejos de ligandos más prometedores derivados de estudios de acoplamiento. Realizar simulaciones en un entorno acuoso SPC con 0,15 M de NaCl, replicando las condiciones iónicas fisiológicas. La caja de simulación está diseñada para garantizar que el soluto permanezca al menos a 10 Å de distancia de sus límites. Se introducen contraiones para neutralizar la carga eléctrica del sistema. Además, se aplican condiciones de contorno periódicas, regidas por los parámetros del campo de fuerza OPLS 2005.
   3. Inicie una fase de minimización de energía para 100 ps utilizando los parámetros predeterminados de Desmond.
   4. Garantice la estabilización de la temperatura y la presión a 26,85 °C (300 K) y 1,01325 bar a través de la cadena Nosé-Hoover y las metodologías Martyna-Tobias-Klein en todos los sistemas MD de producción. La simulación de dinámica molecular se ejecuta con un paso de tiempo de 2 fs para una duración total de 100 ns, registrando las coordenadas atómicas cada 100 ps.
   5. Abra el módulo de diagrama de interacciones de simulación (SID). Cargue los archivos de datos de resultados de la simulación en el módulo.
   6. Seleccione el tipo de análisis deseado de las opciones disponibles en el módulo (por ejemplo, desviación cuadrática media [RMSD], fluctuación cuadrática media [RMSF], análisis de enlaces de hidrógeno, etc.). Especifique los parámetros adicionales necesarios para el tipo de análisis elegido.
   7. Ejecute el análisis haciendo clic en el botón Analizar o Iniciar.
   8. Una vez completado el análisis, visualice e interprete los resultados dentro de la interfaz del módulo SID. Exporte los resultados si es necesario para su uso o presentación posterior.

5. Validación de experimentos con animales

1. Animales y diseño experimental
   NOTA: Este estudio involucró a 75 ratas macho Sprague-Dawley, que se obtuvieron de una instalación de producción animal de grado SPF y tenían 8 semanas de edad con una masa corporal de 150 g ± 20 g (número de certificado de producción animal SCXK [Hebei] 2018-004).
   1. Aloje a las ratas en un laboratorio de animales con nivel de SPF y divídalas aleatoriamente en grupos normales y modelo después de 1 semana de alimentación adaptativa. Proporcionar al grupo normal una dieta normal y al grupo modelo una dieta alta en azúcar y grasas. Después de 4 semanas, ayune las ratas pero no las prive de agua durante 12 h.
   2. Inyectar al grupo modelo una inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; 35 mg·^kg-1). Después de 72 h, pruebe los niveles de azúcar en sangre a través de una muestra de sangre de las venas de cola. Si el nivel de glucosa en sangre en ayunas es de ≥16,7 mmol· ^L-1, lo confirman como un modelo diabético exitoso.
   3. Confirmar el éxito del modelo de DN mediante la observación de cambios histopatológicos en el riñón de rata.
   4. Divida aleatoriamente los modelos replicados con éxito en el grupo modelo, que recibió JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg y 17,46 g/kg (equivalente a 3,2, 6,3 y 12,6 veces la dosis clínica equivalente), así como un grupo de irbesartán (0,014 g/kg). Cada grupo estaba formado por 10 ratas. Administre todos los medicamentos por sonda nasogástrica oral una vez al día. Mantenga este régimen de dosificación de manera constante durante 4 semanas.
   5. Anestesiar a las ratas con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg) y confirmar la anestesia adecuada mediante la pérdida del reflejo de retirada del pedal. Recolectar muestras de sangre de la aorta abdominal antes de la eutanasia.
   6. Recoger los riñones después de sacrificar a las ratas mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 150 mg/kg.
      NOTA: Los animales fueron sacrificados humanitariamente, siguiendo las pautas (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) más actualizadas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) para la eutanasia.
2. Análisis histológicos renales
   NOTA: Los tejidos renales se fijaron en paraformaldehído al 4% y se deshidrataron en etanol después de 48 h; Las secciones se incrustaron en parafina. Las secciones se cortaron en rodajas finas (4 μm) para la tinción con hematoxilina y eosina (HE) y ácido peryódico-Schiff (PAS), y se observaron los cambios morfológicos de la histología renal bajo un microscopio óptico.
   1. Tinción HE:
      1. Desparafinado e hidratación: Tratar las secciones de tejido con Xileno I y II (10 min cada una), alcohol absoluto I y II (3 min cada una). A continuación, sumerja las secciones de tejido en etanol al 95%, 90%, 80% y 70% (2 min cada una), seguido de un lavado con agua destilada durante 5 min.
      2. Colocar las secciones de tejido en tinción de hematoxilina durante 5 min y luego diferenciar las secciones con alcohol clorhídrico durante 5 s.
      3. Coloque la sección en la solución de tinción de eosina durante 3 min.
      4. Deshidratación, limpieza y montaje: Deshidratar las secciones en diferentes momentos en diferentes etanoles (70%, 80%, 90%, 95% y etanoles absolutos), luego limpiarlas en xileno I y II, seguido de montaje con goma neutra.
   2. Tinción de PAS:
      1. Siga los pasos de desparafinado descritos en el paso 5.2.1 y trate la sección con la solución de tinción de ácido peryódico durante ~8 min.
      2. Enjuague las secciones en agua destilada durante 2 minutos y luego tíñalas con el reactivo Schiff durante 15 minutos en la oscuridad.
      3. Lave las secciones con agua del grifo durante 10 minutos después de tratarlas con el reactivo Schiff.
      4. Contratinción de las secciones con hematoxilina durante 1 min y luego diferenciarlas con alcohol HCl durante 30 s. Vuelva a lavar las secciones con agua del grifo durante 5 minutos para colorear el núcleo de azul.
   3. Microscopía electrónica:
      1. Fije las muestras en glutaraldehído al 2,5% durante 3 h, luego enjuáguelas en PBS durante 3 h. Además, trate las muestras con ácido ósmico al 1% durante 3 h y luego enjuague nuevamente con PBS durante 3 h.
      2. Deshidrate a través de una serie gradual de baños de alcohol que terminan en acetona (cada paso dura aproximadamente 2 h en total).
      3. Infiltrar las muestras con una mezcla de propano epoxi y resina epoxi (1:1) a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, seguido de resina epoxi pura a 37 °C durante 2 h adicionales.
      4. Después de esto, curar y endurecer las muestras a temperaturas cada vez más altas durante un período de 36 h antes de cortarlas. Este proceso asegura que el tejido se infiltre completamente con la resina, que luego se endurece para permitir un corte fino para la microscopía electrónica.
      5. Doble tinción con acetato de uranilo al 3% y ácido de plomo, y observe y fotografíe las muestras mediante microscopía electrónica en 15 minutos.
         NOTA: Los ajustes de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) son los siguientes: un aumento de 7000x en modo de alto contraste (Zoom-1 HC-1), con un voltaje de aceleración de 80.0 kV en un sistema TEM.
3. Inmunohistoquímica
   1. Desparafinado: Coloque las secciones de tejido en xileno I y II durante 10 min cada una.
   2. Rehidratación: Rehidratar las secciones de tejido desparafinado colocándolas sucesivamente en etanol absoluto I y II durante 3 min cada una, seguidas de etanol al 95%, 90%, 80% y 70% durante 2 min cada una.
   3. Recuperación de antígenos: Sumerja las secciones de tejido en una solución tampón de citrato y ácido cítrico de 0,1 M a alta presión durante unos 5 minutos y luego enfríe a RT.
   4. Bloqueo: Para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos, bloquee incubando las secciones de tejido con suero de cabra normal al 5% a aproximadamente 37 °C durante 30 min.
   5. Incubación de anticuerpos primarios: Añadir los anticuerpos primarios p-EGFR (diluido 1:200) y p-MAPK3/1 (diluido 1:200) en secciones de tejido e incubar durante la noche a 4 °C dentro de una cámara humidificada.
   6. Incubación de anticuerpos secundarios: Lave las secciones tres veces con PBS, luego agregue anticuerpos secundarios marcados con biotina (diluidos en PBS según las instrucciones del fabricante) en las secciones e incube a 37 °C durante 30 min.
   7. Aplique la solución de trabajo de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante en las secciones de tejido a 37 °C, seguido de un lavado tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   8. Para el desarrollo de DAB, incube las secciones con la solución de revelado de DAB (3 min en la oscuridad en RT), seguido de un enjuague con agua destilada. El DAB actúa como sustrato cromógeno para la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP), que se vuelve marrón con la oxidación.
   9. Use hematoxilina para contratinción durante aproximadamente 2 minutos, diferencie las secciones con alcohol clorhídrico al 1% durante 5 s, luego lave con agua corriente para que se vuelva azul.
   10. Deshidratar colocando sucesivamente las secciones en una serie de etanol de baja a alta concentración, transparente en xileno I y II, y montar las secciones con goma neutra.
       NOTA: Este procedimiento dura aproximadamente 18-24 h, incluyendo la incubación de anticuerpos primarios durante la noche.
   11. Seleccione aleatoriamente tres campos visuales (200x) para cada sección y analice los resultados de tinción de las secciones utilizando un software de análisis de imágenes. Se utilizó el software Image Pro Plus 6.0 siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   12. Primero, importe una imagen de la sección en el software.
   13. Corrección de densidad: Para garantizar resultados precisos, realice una corrección de densidad.
       1. Navegue hasta Medir > calibración > intensidad > las opciones de densidad > opcionales estándar de la nueva > > imagen. Luego, haga clic en un área en blanco de la imagen para registrar el valor de fondo y confírmelo haciendo clic en Aceptar.
   14. Configuración de los parámetros de medición: Configure los parámetros de medición para calcular el área y la densidad óptica integrada (IOD).
       1. Haga clic en Medir > recuento/tamaño > medir > seleccionar medidas. Seleccione Área(100) e IOD y, a continuación, haga clic en Aceptar.
       2. Vaya a Opciones, marque Fondo oscuro en la muestra, Prefiltro de 4 conexiones y haga clic en Aceptar.
   15. Selección de color: Para determinar con precisión la positividad, seleccione los colores para detectar las áreas manchadas frente a las áreas no manchadas.
       1. Haga clic en Seleccionar colores > histograma basado > HSI. Ajuste el valor H de acuerdo con la imagen mientras mantiene S sin cambios e I entre cero y el valor de fondo. A continuación, confirme haciendo clic en Cerrar.
       2. Recopilación y cálculo de datos: Realice la recopilación y el cálculo de datos haciendo clic en Medir > Recopilador de datos > Diseño, donde se seleccionan Nombre, Área (Suma) e IOD (Suma). A continuación, haga clic en Contar > recopilar ahora > lista de datos para exportar los datos para su posterior análisis o almacenamiento.
          NOTA: Esto dio como resultado una medición semicuantitativa de la expresión de proteínas en cada sección en términos de IOD/Área, que indica cuánta proteína está presente en relación con el área total analizada.
4. Western blot
   1. Obtener el tejido renal y cortarlo en trozos. Coloque estas piezas en un tubo de centrífuga de 1,5 mL, agregue la solución de lisis de proteínas preenfriada (50 mM de Tris [pH 7.4],150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato de sodio, 0.1% de dodecil sulfato de sodio [SDS]) y homogeneice.
   2. Déjelo en hielo durante 30 minutos, luego centrifugue a 13400 x g durante 20 minutos a 4 °C. Almacene la muestra resultante en un congelador a -80 °C.
   3. Utiliza el método de Bradford para cuantificar las proteínas.
      1. Prepare la solución de trabajo Coomassie Brilliant Blue mezclando reactivo y agua destilada en una proporción de 1:4.
      2. Establezca tres grupos: en blanco, grupo de proteína estándar y grupo de proteína de muestra. Agregue 3 mL de solución de trabajo Coomassie Brilliant Blue a cada grupo, junto con solución salina fisiológica para el grupo blanco, proteína estándar para el grupo estándar y la proteína sobrenadante extraída para el grupo de muestra.
      3. Después de dejar reposar las mezclas durante 5 minutos, mida sus valores de absorbancia con un espectrofotómetro ultravioleta.
      4. Calcule la concentración de la muestra utilizando esta fórmula: Concentración de proteína (mg/mL) = (Valor de absorbancia de la muestra/Valor de absorbancia del tubo estándar) x Concentración de proteína estándar x 5.
   4. Agregue un volumen igual de tampón de carga 6x a cada muestra de proteína. Hervir a 100 °C durante 5 min antes de alícuotas y guardarlos en un congelador a -20 °C hasta su uso posterior.
   5. Realizar electroforesis, transferencia y bloqueo estándar.
      1. Realice la electroforesis estándar en gel de poliacrilamida (PAGE) SDS utilizando un gel resolutivo al 12%. Aplique un voltaje constante de 100 V para el gel apilador y 120 V para el gel resolutivo hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
      2. Transfiera las proteínas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 2 h en una cámara frigorífica a 4 °C utilizando un sistema de transferencia húmeda.
      3. Después de la transferencia de proteínas, bloquee las membranas con leche descremada al 5% en TBST durante 1 h en RT.
   6. Diluir los anticuerpos primarios EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) y CAPDH (1:5.000) en TBST con 5% de BSA. Añadir estos anticuerpos primarios diluidos e incubar las membranas durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
   7. Después de lavar la membrana tres veces con TBST, añadir anticuerpos secundarios diluidos (1:5.000), seguido de una incubación durante 1 h. Después del desarrollo del color, realice un análisis cuantitativo de las bandas objetivo utilizando el software ImageJ.
5. Análisis de qPCR
   1. Agrupación: Asigne muestras a los grupos: Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
   2. Extracción de ARN: Realice la homogeneización de tejidos y la extracción de ARN, seguidas de la adición de cloroformo, la centrifugación y la precipitación de ARN según las instrucciones del fabricante.
   3. Precipitación y lavado de ARN: Precipitar ARN con isopropanol y lavar con etanol.
   4. Solubilización de ARN: Secar el pellet de ARN y disolverlo en agua tratada con DEPC.
   5. Síntesis de ADNc: Realice la transcripción inversa utilizando mezclas de reacción específicas según las instrucciones del fabricante.
   6. Amplificación de qPCR: Utilice cebadores específicos para GAPDH, MAPK3, MAPK1 y EGFR para qPCR y realice la amplificación según las instrucciones del fabricante.
      Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Métodos estadísticos

1. Realice el análisis utilizando el software adecuado (por ejemplo, SPSS) y represente los datos medidos como la media ± desviación estándar. Si los datos cumplieron con los criterios de distribución normal y homogeneidad de varianza, compare entre grupos utilizando ANOVA de un factor y realice comparaciones múltiples con el método de Bonferroni.
2. Utilice la prueba T2 para comparaciones múltiples si la varianza no es homogénea. Considere P < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Siguiendo el protocolo, finalmente se obtuvieron 90 ingredientes activos de JWSJS del análisis después del cribado y la deduplicación de acuerdo con los estándares establecidos de OB y DL. Estos incluían 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, cuatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum y seis tipos de...

Discusión

Nuestro estudio empleó una combinación de farmacología de red, acoplamiento molecular y modelos animales in vivo . Un paso crítico fue el establecimiento de la red "farmaco-componente-diana", que fue crucial para identificar los mecanismos potenciales de JWSJS en el tratamiento de la DN, centrándose particularmente en su interacción con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1.

Durante este estudio, hicimos varias modificaciones, particularmente e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F