Antagonistische Wirkung von Jiawei Shengjiang San auf ein Rattenmodell der diabetischen Nephropathie: Verwandt mit dem EGFR/MAPK3/1-Signalweg

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Netzwerkpharmakologie und molekulare Docking-Techniken beschreibt, um den Wirkmechanismus von Jiawei Shengjiang San (JWSJS) bei der Behandlung der diabetischen Nephropathie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Unser Ziel war es, die Mechanismen zu untersuchen, die der Aktion von Jiawei Shengjiang San (JWSJS) bei der Behandlung der diabetischen Nephropathie und dem Einsatz von Netzwerkpharmakologie zugrunde liegen. Mit Hilfe von Netzwerkpharmakologie und molekularen Docking-Techniken haben wir die Wirkstoffe und Ziele von JWSJS vorhergesagt und ein akribisches "Wirkstoff-Komponenten-Ziel"-Netzwerk konstruiert. Die Anreicherungsanalysen der Genontologie (GO) und der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) wurden verwendet, um die therapeutischen Wege und Ziele von JWSJS zu ermitteln. Autodock Vina 1.2.0 wurde für die Verifizierung des molekularen Dockings eingesetzt, und es wurde eine 100-ns-Molekulardynamiksimulation durchgeführt, um die Andockergebnisse zu bestätigen, gefolgt von einer In-vivo-Verifizierung an Tieren. Die Ergebnisse zeigten, dass JWSJS 227 sich überschneidende Ziele mit der diabetischen Nephropathie teilte und eine Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk-Topologie konstruierte. Die KEGG-Anreicherungsanalyse zeigte, dass JWSJS die diabetische Nephropathie durch Modulation von Lipiden und Atherosklerose, dem PI3K-Akt-Signalweg, der Apoptose und dem HIF-1-Signalweg abschwächt, wobei die Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1), MAPK3, der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und die Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (AKT1) als kollektive Ziele mehrerer Signalwege identifiziert wurden. Molecular docking behauptete, dass die Kernkomponenten von JWSJS (Quercetin, Palmitoleinsäure und Luteolin) die Konformation mit drei zentralen Zielen (MAPK1, MAPK3 und EGFR) durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisieren können. In-vivo-Untersuchungen zeigten eine bemerkenswerte Zunahme des Körpergewichts und eine Verringerung des glykierten Serumproteins (GSP), des Low-Density-Lipoprotein-Cholesterins (LDL-C), des Uridintriphosphats (UTP) und des Nüchternblutzuckerspiegels (FBG) aufgrund von JWSJS. Die Elektronenmikroskopie in Verbindung mit Hämatoxylin und Eosin (HE) und die Periodensäure-Schiff-Färbung (PAS) zeigten das Potenzial jeder Behandlungsgruppe bei der Linderung von Nierenschäden in unterschiedlichem Ausmaß, wobei sie unterschiedliche Rückgänge von p-EGFR, p-MAPK3/1 und BAX sowie Zuwächse der BCL-2-Expression im Nierengewebe der behandelten Ratten zeigten. Zusammenfassend deuten diese Erkenntnisse darauf hin, dass die schützende Wirksamkeit von JWSJS bei diabetischer Nephropathie mit der Unterdrückung der Aktivierung des EGFR/MAPK3/1-Signalwegs und der Linderung der Apoptose der Nierenzellen verbunden sein könnte.

Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist eine chronische Krankheit, die mehrere Systeme betrifft und aufgrund einer kontinuierlichen Hyperglykämie verschiedene Komplikationen verursachen kann, wie z. B. diabetische Nephropathie (DN), Retinopathie und Neuropathie¹. DN ist eine schwerwiegende Komplikation der DM und macht etwa 30 % bis 50 % der Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) ^aus2. Ihre klinische Manifestation ist die Mikroalbuminurie, die zu einer ESRD fortschreiten kann, die durch ein erhöhtes glomeruläres Volumen, eine mesangiale Stromahyperplasie und eine verdickte glomeruläre Basalmembran^{gekennzeichnet ist 3}. Die Pathogenese der DN ist komplex und noch nicht vollständig geklärt. Klinische Methoden wie die Senkung des Blutzuckerspiegels, die Regulierung des Blutdrucks und die Verringerung der Proteinurie werden hauptsächlich verwendet, um das Fortschreiten zu verzögern, aber die Wirkung ist allgemein.

Derzeit wurde kein spezifisches Medikament zur Behandlung von DN⁴ gefunden. Seit Jahrhunderten werden chinesische pflanzliche Arzneimittel jedoch häufig zur Behandlung von DM und seinen Komplikationen eingesetzt⁵ und haben die klinischen Symptome der Patienten verbessert und das Fortschreiten der Krankheit verzögert. Aufgrund der Vorteile von Mehrkomponenten-, Multi-Target- und Multi-Pathway-Effekten wird erwartet, dass chinesische pflanzliche Arzneimittel eine innovative Arzneimittelquelle für die Behandlung von DN⁶ sind.

"Shengjiang san" stammt von den "Wanbing Huichun" des Arztes Gong Tingxian aus der Ming-Dynastie. Das Buch "Neifu Xianfang" beschreibt die Verwendung von Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma und Radix Rhei et Rhizome. Auf dieser Grundlage übt es nach der Zugabe von Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba und Smilacis Glabrae Rhixom die Funktion von Shengjiang san aus, die Klarheit zu erhöhen, die Trübungen zu verringern, stagnierende "Wärme" freizusetzen und das "Qi" und das Blut zu harmonisieren ^7,8. Es erhöht auch die Wirkung der Milzstärkung und der Straffung der Nieren. Seine Wirksamkeit steht im Einklang mit der Pathogenese des "Qi" von DN, das aufgrund eines Mangels an "Lebensenergie", übermäßiger Trockenheit und "Hitze" und einer Stagnation der "Wärme", die durch einen dreifachen Energizer verursacht wird, ansteigt und abfällt ^7,8.

Frühere klinische Studien haben gezeigt, dass chinesische pflanzliche Arzneimittel zur Behandlung von DM und seinen Komplikationen eingesetzt wurden, und es wurde gezeigt, dass Jiawei Shengjiang San (JWSJS) den Blutzucker und die Lipide reguliert, die Proteinurie reduziert und die klinische Wirksamkeit von Patienten mit frühem DN⁷ signifikant verbessert. Die Fähigkeit von JWSJS, den Protein- und Blutzuckerspiegel im Urin bei DN-Ratten zu senken, wurde durch frühere Studien bestätigt. Dies geschieht wahrscheinlich durch die Hemmung der TXNIP/NLRP3- und RIP1/RIP3/MLKL-Signalwege, die Verringerung der Podozyten-Pyroptose und die Verhinderung der nekrotischen Apoptose im Nierengewebe von DN-Ratten, wodurch ein Nierenschutz erreicht^{wird 9}. JWSJS kann die Expression von Nephrin- und Podocin-Proteinen hochregulieren und die Podozytenschädigung bei DN-Ratten reduzieren, was darauf hindeutet, dass JWSJS eine hemmende Wirkung auf die Podozytenschädigung hat. JWSJS hat eine gewisse Anti-DN-Wirkung mit guten Sicherheitsprofilen, aber es gibt wenig Forschung darüber, und diese Arbeit konzentriert sich hauptsächlich auf Pyroptose und nekrotische Apoptose. Die Literatur ist nicht tief genug und nicht systematisch¹⁰. Unsere früheren Ergebnisse haben bestätigt, dass JWSJS die Proteinurie reduzieren und Nierenschäden bei DN-Ratten lindern kann⁷. Es gibt jedoch nur wenige Studien über den Mechanismus von JWSJS für die DN-Behandlung, und diesen fehlt es an Tiefe und Systematisierung. Ziel dieser Studie ist es daher, die molekularen Substanzen und Wirkmechanismen von JWSJS für die DN-Behandlung mittels Netzwerkpharmakologie zu analysieren und eine solide Grundlage für zukünftige Forschung zu schaffen.

Die Netzwerkpharmakologie ist eine aufstrebende Methode zur Untersuchung des Wirkmechanismus von Arzneimitteln, einschließlich Chemieinformatik, Netzwerkbiologie, Bioinformatik und Pharmakologie^11,12. Das Forschungsdesign der Netzwerkpharmakologie ist dem ganzheitlichen Konzept der traditionellen chinesischen Medizin sehr ähnlich^13,14 und es ist eine wichtige Methode, um den Mechanismus chinesischer pflanzlicher Arzneimittel zu untersuchen. Molekulares Docking kann Wechselwirkungen zwischen Molekülen untersuchen und ihre Bindungsmuster und Affinität vorhersagen. Molekulares Docking hat sich zu einer wichtigen Technik im Bereich der computergestützten Arzneimittelforschung entwickelt¹⁵. Daher wurde in dieser Studie ein JWSJS-DN-Ziel-Interaktionsnetzwerk durch Netzwerkpharmakologie und molekulare Docking-Methoden konstruiert, das eine zuverlässige und theoretische Grundlage für die weitere Erforschung der DN-Behandlung mit JWSJS bietet.

Protokoll

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem US National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8^. Auflage, gehalten und verwendet und gemäß den ARRIVE-Richtlinien^16,17 berichtet. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem China National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und von der Tierethikkommission der Universität für Chinesische Medizin Hebei (DWLL2019030) genehmigt.

1. JWSJS Wirkstoffe und Zielsammlung

1. Geben Sie die medizinische Zusammensetzung JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome und Curcumaelongae Rhizoma) in die Datenbank¹⁸ der traditionellen chinesischen Medizin ein, um alle chemischen Komponenten abzurufen.  Gemäß dem ADME-Screening (Absorption, Distribution, Metabolismus und Exkretion) beträgt die orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und die arzneimittelähnlichen Eigenschaften (DL) ≥ 0,18 chemischen Inhaltsstoffe^19,20.
2. Verwenden Sie die TCMSP-Datenbank (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, Version 2.3), um die entsprechenden Ziele chemischer Inhaltsstoffe abzurufen.
3. Beziehen Sie die Wirkstoffe von Bombyx Batryticatus und Cicadae Periostracum , indem Sie in den Datenbanken für Traditionelle Chinesische Medizin und Chemische Zusammensetzung^{suchen 21}.
4. Um die Glaubwürdigkeit der Experimente zu gewährleisten, wählen Sie für diese Studie Verbindungen mit CAS-Nummern (Chemical Abstracts Service) aus. Laden Sie dann 2D-Strukturdiagramme (.sdf-Format) von Wirkstoffen von PubChem herunter (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, aktualisiert 2021)²².
5. Verwenden Sie SwissADME (www.swissadme.ch, aktualisiert 2021)²³, um die Komponenten mit hoher gastrointestinaler (GI) Resorption als Arzneimittelähnlichkeit (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) zu screenen, deren ≥ 2 Items "Ja" waren. Dies führte zu den Wirkstoffen von Bombyx Batryticatus und Cicadae Periostracum.
6. Importieren Sie diese in die TCMSP-Datenbank für die Vorhersage von Zielproteinen (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Version 2.3)¹⁸.
7. Standardisierung der Ziele in der UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org, aktualisiert im Jahr 2021) mit dem Status " Überprüft " und der Spezies " Mensch²⁴".

2. DN-entsprechende Zielsammlung

1. Suche nach diabetischer Nephropathie über GeneCards (https://www.genecards.org/, Version 5.1)²⁵, OMIM (https://omim.org/, aktualisiert im Jahr 2021)²⁶, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, aktualisiert im Jahr 2021)²⁷, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, aktualisiert im Jahr 2021)²⁸ und DrugBank-Datenbanken (https://www.drugbank.ca/, aktualisiert im Jahr 2021)²⁹. Ermitteln Sie die Ziele von DN nach dem Kombinieren und Deduplizieren.
2. Screening gemeinsamer Ziele von JWSJS und DN und Netzbau
   1. Prüfen Sie die gemeinsamen Ziele von JWSJS und DN mit der Software R 4.2.0 und zeichnen Sie Venn-Diagramme. Importieren Sie die Wirkstoffe und potenziellen Ziele von JWSJS in die Cytoscape 3.8.0 Software³⁰ , um ein Drug-Ingredient-Target-Netzwerkdiagramm zu erstellen, das den Zusammenhang zwischen Medikamenten, Inhaltsstoffen, Zielen und Krankheiten visualisiert.
   2. Lassen Sie die Größe des Knotens die Größe des Gradwerts widerspiegeln, wobei ein höherer Gradwert angibt, dass der Knoten im Netzwerk wichtiger ist.
3. Aufbau eines PPI-Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks und Screening von Kernzielen
   1. Analysieren Sie die sich überschneidenden Gene mit der Online-Plattform STRING (Version:11.5), um ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) zu konstruieren³¹. Konstruieren Sie das Netzwerk mit einem Analysemodus für mehrere Proteine , legen Sie die Spezies auf Homo sapiens fest, und legen Sie den minimal erforderlichen Interaktionswert auf >0,9³⁰ fest.
   2. Verwenden Sie Cytoscape 3.8.0, um das Netzwerk topologisch zu analysieren, die Werte für die Zwischenzentralität (BC), die Nähezentralität (CC), die Gradzentralität (DC), die Eigenvektorzentralität (EC), die lokale durchschnittliche konnektivitätsbasierte Methode (LAC) und die Netzwerkzentralität (NC) für jeden Knoten zu berechnen und die sechs Knoten mit allen Werten größer als dem Median³² zu filtern. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um die Kernziele von JWSJS für die DN-Therapie zu identifizieren.
4. GO-Funktionsanalysen und KEGG-Signalweg-Anreicherungsanalyse
   1. Führen Sie GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen durch, um die biologischen Prozesse, molekularen Funktionen, zellulären Komponenten und Signalwege zu identifizieren, die mit den gemeinsamen Zielen von JWSJS und DN verbunden sind.
   2. Verwenden Sie die Organisation. Hs.eg.db Paket, um die IDs der Schnittpunktziele abzurufen, und verwenden Sie den clusterProfiler, org. Hs.eg.db-, enrichplot- und ggplot2-Pakete für Anreicherungsanalysen³³.
   3. Screening auf funktionelle GO-Anreicherungsanalyse der Top 10 biologischen Treffer mit einem korrigierten P-Wert < 0,05 und Auswahl der Top-30-Signalwege mit der höchsten Anreicherung für die KEGG-Analyse.

3. Molekulares Andocken

1. Verwenden Sie die AutoDock Vina-Software, um ein molekulares Andocken zwischen den JWSJS-Kernkomponenten und den Kernzielen für die DN-Therapie³⁴ durchzuführen.
2. Suchen Sie in der PubChem-Datenbank, um die SDF-Datei der 2D-Struktur der JWSJS-Kernkomponenten zu erhalten. Verwenden Sie die ChemBio 3D Ultra14.0-Software, um die 3D-Struktur zu generieren und zu optimieren, speichern Sie sie im mol2-Format und verwenden Sie sie als Ligandendatei.
3. Suchen Sie das PDB-Format der 3D-Struktur der Kernziele aus der Datenbank der Protein Data Bank (PDB) des Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) und laden Sie es herunter. Verwenden Sie die Pymol 2.4.0-Software, um Wassermoleküle und Liganden aus der Proteinstruktur zu entfernen, sie im pdb-Format zu speichern und als Rezeptordatei zu verwenden.
4. Importieren Sie die Rezeptor-PDB-Datei in die AutoDockTools 1.5.7-Software für die Hydrierung, konvertieren Sie sowohl das Rezeptorprotein als auch den niedermolekularen Liganden in das pdbqt-Format, stellen Sie die aktive Tasche für das Rezeptorprotein mit einem auf 1 eingestellten Abstandskoeffizienten ein.
5. Verwenden Sie Autodock vina 1.2.0 für das molekulare Andocken und berechnen Sie die Bindungsenergie; Wenn die Affinität 0 <, berücksichtigen Sie, dass das Molekül spontan an das Protein bindet, ein höherer absoluter Wert der Affinität zeigt eine stabilere Bindung zwischen ihnen an. Visualisieren Sie abschließend die Docking-Ergebnisse mit der Software Pymol 2.3.0 und LigPlot 2.2.5.

4. Molekulardynamische Simulation

1. Um MD-Simulationen mit der Desmond-Software durchzuführen, gehen Sie folgendermaßen vor:
   1. Verwenden Sie die akademische Version 2019-1 der Desmond-Software, um die Stabilität und Flexibilität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen zu bewerten.
   2. Durchführung molekulardynamischer (MD) Untersuchungen an einem Trio der vielversprechendsten Ligandenkomplexe, die aus Docking-Studien abgeleitet wurden. Durchführung von Simulationen in einer wässrigen SPC-Umgebung mit 0,15 M NaCl, die die physiologischen ionischen Bedingungen replizieren. Die Simulationsbox ist so konzipiert, dass der gelöste Stoff mindestens 10 Å von seinen Grenzen entfernt bleibt. Gegenionen werden eingeführt, um die elektrische Ladung des Systems zu neutralisieren. Zusätzlich werden periodische Randbedingungen angewendet, die durch die Parameter des Kraftfeldes OPLS 2005 bestimmt werden.
   3. Initiieren Sie eine Energieminimierungsphase für 100 ps mit Desmond-Standardparametern.
   4. Stellen Sie die Temperatur- und Druckstabilisierung bei 26,85 °C (300 K) und 1,01325 bar durch die Nosé-Hoover-Kette und die Martyna-Tobias-Klein-Methoden für alle MD-Produktionssysteme sicher. Die Molekulardynamik-Simulation wird mit einem Zeitschritt von 2 fs für eine Gesamtdauer von 100 ns ausgeführt, wobei die atomaren Koordinaten alle 100 ps aufgezeichnet werden.
   5. Öffnen Sie das Modul Simulation Interactions Diagram (SID). Laden Sie die Datendateien der Simulationsergebnisse in das Modul.
   6. Wählen Sie den gewünschten Analysetyp aus den im Modul verfügbaren Optionen aus (z. B. Root-Mean-Square-Abweichung [RMSD], Root-Mean-Square-Fluktuation [RMSF], Wasserstoffbrückenbindungsanalyse usw.). Geben Sie alle zusätzlichen Parameter an, die für den ausgewählten Analysetyp erforderlich sind.
   7. Führen Sie die Analyse aus, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren oder Starten klicken.
   8. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, können Sie die Ergebnisse in der Benutzeroberfläche des SID-Moduls anzeigen und interpretieren. Exportieren Sie die Ergebnisse, wenn sie zur weiteren Verwendung oder Präsentation benötigt werden.

5. Validierung von Tierversuchen

1. Tiere und Versuchsaufbau
   HINWEIS: An dieser Studie nahmen 75 männliche Sprague-Dawley-Ratten teil, die aus einer Tierproduktionsanlage mit Lichtschutzfaktor stammten und 8 Wochen alt waren und eine Körpermasse von 150 g ± 20 g aufwiesen (Tierproduktionsbescheinigung Nummer SCXK [Hebei] 2018-004).
   1. Bringen Sie die Ratten in einem Tierlabor mit Lichtschutzfaktor unter und teilen Sie sie nach 1 Woche adaptiver Fütterung nach dem Zufallsprinzip in Normal- und Modellgruppen ein. Versorgen Sie die Normalgruppe mit einer normalen Ernährung und die Modellgruppe mit einer zucker- und fettreichen Ernährung. Nach 4 Wochen fasten Sie die Ratten, aber entziehen Sie ihnen 12 Stunden lang kein Wasser.
   2. Injizieren Sie der Modellgruppe eine intraperitoneale Injektion von Streptozotocin (STZ; 35 mg·^kg-1). Nach 72 h den Blutzuckerspiegel durch eine Schwanzvenenblutabnahme messen. Wenn der Nüchternblutzuckerspiegel ≥16,7 mmol· ^L-1, bestätigen Sie es als erfolgreiches Diabetikermodell.
   3. Bestätigung des erfolgreichen DN-Modells durch Beobachtung histopathologischer Veränderungen in der Rattenniere.
   4. Teilen Sie die erfolgreich replizierten Modelle nach dem Zufallsprinzip in die Modellgruppe auf, die JWSJS mit 4,37 g/kg, 8,73 g/kg und 17,46 g/kg (entsprechend dem 3,2-, 6,3- und 12,6-fachen der klinischen Äquivalentdosis) erhielt, sowie in eine Irbesartan-Gruppe (0,014 g/kg). Jede Gruppe bestand aus 10 Ratten. Verabreichen Sie alle Arzneimittel einmal täglich über eine orale Sonde. Behalten Sie dieses Dosierungsschema 4 Wochen lang konsequent bei.
   5. Betäuben Sie die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie durch Verlust des Pedalentzugsreflexes. Entnehmen Sie vor der Euthanasie Blutproben aus der Bauchaorta.
   6. Entnehmen Sie die Nieren nach dem Einschläfern der Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von Natrium-Pentobarbital in einer Dosis von 150 mg/kg.
      HINWEIS: Die Tiere wurden auf humane Weise eingeschläfert, gemäß den aktuellsten Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) für Euthanasie.
2. Histologische Analysen der Nieren
   HINWEIS: Das Nierengewebe wurde in 4 % Paraformaldehyd fixiert und nach 48 h in Ethanol dehydriert; Abschnitte wurden in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden in dünne (4-μm) Scheiben geschnitten, um sie mit Hämatoxylin- und Eosin (HE) und periodischem Säure-Schiff (PAS) zu färben, und die morphologischen Veränderungen der Nierenhistologie wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet.
   1. HE-Färbung:
      1. Entparaffinierung und Hydratation: Behandeln Sie die Gewebeschnitte mit Xylol I und II (je 10 min), absolutem Alkohol I und II (je 3 min). Tauchen Sie dann die Gewebeschnitte in 95 %, 90 %, 80 % und 70 % Ethanol (jeweils 2 Minuten), gefolgt von einer 5-minütigen Wäsche mit destilliertem Wasser.
      2. Legen Sie die Gewebeschnitte 5 Minuten lang in Hämatoxylin-Färbung und differenzieren Sie die Schnitte dann 5 s lang mit Salzsäure.
      3. Legen Sie den Schnitt für 3 Minuten in die Eosin-Färbelösung.
      4. Dehydratisieren, Reinigen und Einbetten: Entwässern Sie die Abschnitte zu unterschiedlichen Zeiten in verschiedenen Ethanolen (70 %, 80 %, 90 %, 95 % und absolute Ethanole), reinigen Sie sie dann in Xylol I und II, gefolgt von der Montage mit neutralem Gummi.
   2. PAS-Färbung:
      1. Befolgen Sie die in Schritt 5.2.1 beschriebenen Entparaffinierungsschritte und behandeln Sie den Abschnitt ~8 min lang mit der periodischen sauren Färbelösung.
      2. Spülen Sie die Abschnitte 2 Minuten lang in destilliertem Wasser ab und färben Sie sie dann 15 Minuten lang im Dunkeln mit dem Schiff Reagenz.
      3. Waschen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in Leitungswasser, nachdem Sie sie mit dem Schiff-Reagenz behandelt haben.
      4. Die Schnitte 1 min lang mit Hämatoxylin gegenfärben und anschließend 30 s lang mit HCl-Alkohol differenzieren. Waschen Sie die Abschnitte erneut 5 Minuten lang in Leitungswasser, um den Kern blau zu färben.
   3. Elektronenmikroskopie:
      1. Fixieren Sie die Proben 3 h lang in 2,5 % Glutaraldehyd und spülen Sie sie dann 3 h lang in PBS. Behandeln Sie die Proben weiterhin 3 h lang in 1%iger Osmisäure und spülen Sie sie dann erneut 3 h lang in PBS.
      2. Dehydrieren Sie durch eine abgestufte Reihe von Alkoholbädern, die mit Aceton enden (jeder Schritt dauert insgesamt etwa 2 Stunden).
      3. Die Proben werden 2 h lang mit einer Mischung aus Epoxidpropan und Epoxidharz (1:1) bei Raumtemperatur (RT) infiltriert, gefolgt von reinem Epoxidharz bei 37 °C für weitere 2 h.
      4. Danach härten und härten die Proben bei immer höheren Temperaturen über einen Zeitraum von 36 h aus, bevor sie geschnitten werden. Dieser Prozess stellt sicher, dass das Gewebe gründlich mit dem Harz infiltriert wird, das dann gehärtet wird, um ein dünnes Schneiden für die Elektronenmikroskopie zu ermöglichen.
      5. Mit 3% Uranylacetat und Bleisäure doppelt färben und die Proben innerhalb von 15 min elektronenmikroskopisch beobachten und fotografieren.
         HINWEIS: Die Einstellungen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) lauten wie folgt: eine 7000-fache Vergrößerung im Hochkontrastmodus (Zoom-1 HC-1) mit einer Beschleunigungsspannung von 80,0 kV auf einem TEM-System.
3. Immunhistochemie
   1. Entparaffinierung: Legen Sie die Gewebeschnitte für jeweils 10 min in Xylol I und II.
   2. Rehydratisierung: Rehydrieren Sie die entwachsten Gewebeabschnitte, indem Sie sie nacheinander für jeweils 3 min in absolutes Ethanol I und II legen, gefolgt von 95 %, 90 %, 80 % und 70 % Ethanol für jeweils 2 min.
   3. Antigen-Entnahme: Tauchen Sie die Gewebeschnitte ca. 5 min in 0,1 M Citrat-Zitronensäure-Pufferlösung unter hohem Druck und kühlen Sie sie anschließend auf RT ab.
   4. Blockierung: Um eine unspezifische Bindung der Antikörper zu verhindern, blockieren Sie, indem Sie die Gewebeschnitte mit 5% normalem Ziegenserum bei ca. 37 °C für 30 min inkubieren.
   5. Inkubation von Primärantikörpern: Geben Sie die Primärantikörper p-EGFR (verdünnt 1:200) und p-MAPK3/1 (verdünnt 1:200) auf Gewebeschnitte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
   6. Inkubation von Sekundärantikörpern: Waschen Sie die Schnitte dreimal mit PBS, geben Sie dann Biotin-markierte Sekundärantikörper (verdünnt in PBS gemäß den Anweisungen des Herstellers) auf die Schnitte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
   7. Meerrettichperoxidase-konjugierte Streptavidin-Arbeitslösung bei 37 °C auf die Gewebeschnitte auftragen und anschließend dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
   8. Für die DAB-Entwicklung werden die Abschnitte mit DAB-Entwicklungslösung inkubiert (3 min im Dunkeln bei RT) und anschließend mit destilliertem Wasser gespült. DAB fungiert als Chromogensubstrat für das Enzym Meerrettichperoxidase (HRP), das sich bei Oxidation braun verfärbt.
   9. Verwenden Sie Hämatoxylin zur Gegenfärbung für ca. 2 min, differenzieren Sie die Schnitte 5 s lang mit 1%igem Salzalkohol und waschen Sie sie dann unter fließendem Wasser, bis sie blau werden.
   10. Dehydrieren, indem die Abschnitte nacheinander in eine Reihe von Ethanol von niedriger bis hoher Konzentration gelegt werden, klar in Xylol I und II, und die Abschnitte mit neutralem Gummi aufsetzen.
       HINWEIS: Dieses Verfahren dauert ca. 18-24 Stunden, einschließlich der Inkubation des primären Antikörpers über Nacht.
   11. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Gesichtsfelder (200x) für jeden Schnitt aus und analysieren Sie die Färbeergebnisse der Schnitte mit Hilfe der Bildanalysesoftware. Die Image Pro Plus 6.0-Software wurde mit den folgenden Schritten verwendet.
   12. Importieren Sie zunächst ein Bild des Abschnitts in die Software.
   13. Dichtekorrektur: Um genaue Ergebnisse zu gewährleisten, führen Sie eine Dichtekorrektur durch.
       1. Navigieren Sie zu Messen > Kalibrierung > Intensität > Neue > std. Optionale Dichte- > Optionen > Bild. Klicken Sie dann auf einen leeren Bereich des Bildes, um den Hintergrundwert aufzuzeichnen und bestätigen Sie ihn mit OK.
   14. Einstellen von Messparametern: Richten Sie Messparameter ein, um die Fläche und die integrierte optische Dichte (IOD) zu berechnen.
       1. Klicken Sie auf Messen > Anzahl/Größe > Messen > Maße auswählen. Wählen Sie Bereich (100) und IOD aus und klicken Sie dann auf OK.
       2. Gehen Sie zu Optionen, aktivieren Sie Dark Background on Sample, 4-Connect Pre-Filter und klicken Sie auf OK.
   15. Farbauswahl: Um die Positivität genau zu bestimmen, wählen Sie Farben aus, um fleckige Bereiche im Vergleich zu ungefärbten Bereichen zu erkennen.
       1. Klicken Sie auf Farben auswählen > Histogramm basierend > HSI. Passen Sie den H-Wert entsprechend dem Bild an, während S unverändert bleibt und I zwischen Null und dem Hintergrundwert liegt. Bestätigen Sie anschließend mit einem Klick auf Schließen.
       2. Datenerfassung und -berechnung: Führen Sie die Datenerfassung und -berechnung durch, indem Sie auf Measure > Data Collector > Layout klicken, wobei Name, Area(Sum) und IOD(Sum) ausgewählt sind. Klicken Sie dann auf Count > Collect Now > Data List , um die Daten zur weiteren Analyse oder Speicherung zu exportieren.
          HINWEIS: Dies führte zu einer semiquantitativen Messung der Proteinexpression in jedem Abschnitt in Bezug auf IOD/Fläche, die angibt, wie viel Protein im Verhältnis zur analysierten Gesamtfläche vorhanden ist.
4. Western-Blotting
   1. Entnehmen Sie das Nierengewebe und schneiden Sie es in Stücke. Geben Sie diese Stücke in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie die vorgekühlte Proteinlyselösung (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) hinzu und homogenisieren Sie.
   2. 30 min auf Eis legen, dann bei 13400 x g 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Lagern Sie die resultierende Probe in einem -80 °C-Gefrierschrank.
   3. Verwenden Sie die Bradford-Methode, um die Proteine zu quantifizieren.
      1. Bereiten Sie die Coomassie Brilliant Blue Arbeitslösung vor, indem Sie Reagenz und destilliertes Wasser im Verhältnis 1:4 mischen.
      2. Richten Sie drei Gruppen ein: Leer, Standardproteingruppe und Probenproteingruppe. Geben Sie 3 ml Coomassie Brilliant Blue Arbeitslösung zu jeder Gruppe, zusammen mit physiologischer Kochsalzlösung für die Blindgruppe, Standardprotein für die Standardgruppe und dem extrahierten Überstandsprotein für die Probengruppe.
      3. Nachdem Sie die Mischungen 5 Minuten lang stehen gelassen haben, messen Sie ihre Absorptionswerte mit einem Ultraviolett-Spektralphotometer.
      4. Berechnen Sie die Probenkonzentration mit dieser Formel: Proteinkonzentration (mg/ml) = (Absorptionswert der Probe/Absorptionswert des Standardröhrchens) x Standardproteinkonzentration x 5.
   4. Geben Sie ein gleiches Volumen von 6x Ladepuffer zu jeder Proteinprobe. Vor dem Aliquotieren bei 100 °C 5 Minuten kochen und bis zur weiteren Verwendung in einem Gefrierschrank bei -20 °C aufbewahren.
   5. Führen Sie Standardelektrophorese, Blotting und Blockierung durch.
      1. Führen Sie eine Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit einem 12 % auflösenden Gel durch. Legen Sie eine konstante Spannung von 100 V für das Stapelgel und 120 V für das Auflösungsgel an, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
      2. Übertragen Sie Proteine auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen bei 100 V für 2 h in einem Kühlraum bei 4 °C mit einem Nasstransfersystem.
      3. Nach dem Proteintransfer die Membranen mit 5 % fettfreier Milch in TBST für 1 h bei RT blockieren.
   6. Verdünnen Sie die Primärantikörper EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) und CAPDH (1:5.000) in TBST mit 5 % BSA. Diese verdünnten Primärantikörper werden zugegeben und die Membranen über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert.
   7. Nachdem Sie die Membran dreimal mit TBST gewaschen haben, fügen Sie verdünnte Sekundärantikörper (1:5.000) hinzu und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang. Führen Sie nach der Farbentwicklung eine quantitative Analyse der Zielbanden mit der ImageJ-Software durch.
5. qPCR-Analyse
   1. Gruppierung: Weisen Sie Proben den Gruppen zu - Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
   2. RNA-Extraktion: Führen Sie eine Gewebehomogenisierung und RNA-Extraktion durch, gefolgt von Chloroform-Zugabe, Zentrifugation und RNA-Fällung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. RNA-Fällung und Waschen: RNA mit Isopropanol ausfällen und mit Ethanol waschen.
   4. RNA-Solubilisierung: Trocknen Sie das RNA-Pellet und lösen Sie es in DEPC-behandeltem Wasser auf.
   5. cDNA-Synthese: Führen Sie die reverse Transkription mit spezifischen Reaktionsgemischen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   6. qPCR-Amplifikation: Verwenden Sie spezifische Primer für GAPDH, MAPK3, MAPK1 und EGFR für die qPCR und führen Sie die Amplifikation gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      Die Primersequenzen waren wie folgt:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTTTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Statistische Methoden

1. Führen Sie die Analyse mit geeigneter Software (z. B. SPSS) durch und stellen Sie die gemessenen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung(en) dar. Wenn die Daten die Kriterien der Normalverteilung und Varianzhomogenität erfüllen, vergleichen Sie die Gruppen mit der unidirektionalen ANOVA und führen Sie mehrere Vergleiche mit der Bonferroni-Methode durch.
2. Verwenden Sie den T2-Test für Mehrfachvergleiche, wenn die Varianz nicht homogen ist. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Dem Protokoll folgend wurden schließlich 90 Wirkstoffe von JWSJS aus der Analyse nach Screening und Deduplizierung nach den festgelegten Standards von OB und DL gewonnen. Dazu gehörten 20 Arten von Hedysarum Multijugum Maxim, 23 Arten von Epimrdii Herba, 15 Arten von Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 Arten von Radix Rhei et Rhizome, vier Arten von Curcumaelongae Rhizoma, 15 Arten von Cicadae Periostracum und sechs Arten von Bombyx Ba...

Diskussion

Unsere Studie verwendete eine Kombination aus Netzwerkpharmakologie, molekularem Docking und in vivo Tiermodellen. Ein entscheidender Schritt war die Etablierung des "drug-component-target"-Netzwerks, das entscheidend für die Identifizierung der potenziellen Mechanismen von JWSJS bei der Behandlung von DN war, wobei der Schwerpunkt auf seiner Interaktion mit dem EGFR/MAPK3/1-Signalweg lag.

Während dieser Studie haben wir mehrere Modifikationen vorge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F