JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole décrivant la pharmacologie du réseau et les techniques d’amarrage moléculaire pour explorer le mécanisme d’action de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) dans le traitement de la néphropathie diabétique.

Résumé

Notre objectif était d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent l’action de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) dans le traitement de la néphropathie diabétique et le déploiement de la pharmacologie en réseau. En utilisant la pharmacologie de réseau et les techniques d’amarrage moléculaire, nous avons prédit les composants actifs et les cibles du JWSJS et construit un réseau méticuleux « médicament-composant-cible ». Les analyses d’enrichissement de l’ontologie génétique (GO) et de l’encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont été utilisées pour discerner les voies thérapeutiques et les cibles du JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 a été déployé pour la vérification de l’amarrage moléculaire, et une simulation de dynamique moléculaire de 100 ns a été menée pour confirmer les résultats de l’amarrage, suivie d’une vérification in vivo sur l’animal. Les résultats ont révélé que JWSJS partageait 227 cibles croisées avec la néphropathie diabétique, construisant une topologie de réseau d’interaction protéine-protéine. L’analyse d’enrichissement de KEGG a révélé que le JWSJS atténue la néphropathie diabétique en modulant les lipides et l’athérosclérose, la voie de signalisation PI3K-Akt, l’apoptose et la voie de signalisation HIF-1, la protéine kinase 1 activée par les mitogènes (MAPK1), la MAPK3, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et la sérine/thréonine-protéine kinase 1 (AKT1) étant identifiées comme cibles collectives de plusieurs voies. L’amarrage moléculaire a affirmé que les composants clés de JWSJS (quercétine, acide palmitoléique et lutéoline) pouvaient stabiliser la conformation avec trois cibles pivots (MAPK1, MAPK3 et EGFR) par liaison hydrogène. Les examens in vivo ont révélé une augmentation notable du poids corporel et une réduction des taux de protéines sériques glyquées (GSP), de cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL-C), d’uridine triphosphate (UTP) et de glycémie à jeun (FBG) dues au JWSJS. La microscopie électronique couplée à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) et à la coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) a mis en évidence le potentiel de chaque groupe de traitement à atténuer les lésions rénales à des degrés divers, montrant des déclins variés de p-EGFR, de p-MAPK3/1 et de BAX, et des augmentations de l’expression de BCL-2 dans les tissus rénaux des rats traités. En conclusion, ces informations suggèrent que l’efficacité protectrice du JWSJS sur la néphropathie diabétique pourrait être associée à la suppression de l’activation de la voie de signalisation EGFR/MAPK3/1 et à l’atténuation de l’apoptose des cellules rénales.

Introduction

Le diabète sucré (DM) est une maladie chronique qui affecte plusieurs systèmes et peut entraîner diverses complications dues à une hyperglycémie continue, telles que la néphropathie diabétique (DN), la rétinopathie et la neuropathie1. La DN est une complication grave du diabète sucré, représentant environ 30 à 50 % des maladies rénales terminales (IRT)2. Sa manifestation clinique est une microalbuminurie, qui peut évoluer vers une IRT caractérisée par une augmentation du volume glomérulaire, une hyperplasie stromale mésangiale et un épaississement de la membrane basale glomérulaire3. La pathogenèse de la DN est complexe et n’a pas été entièrement élucidée. Les méthodes cliniques telles que l’abaissement de la glycémie, la régulation de la pression artérielle et la réduction de la protéinurie sont principalement utilisées pour retarder sa progression, mais l’effet est général.

À l’heure actuelle, aucun médicament spécifique n’a été trouvé pour traiter le DN4. Pendant des siècles, cependant, les plantes médicinales chinoises ont été largement utilisées dans le traitement du diabète et de ses complications5 et ont amélioré les symptômes cliniques des patients et retardé la progression de la maladie. En raison des avantages des effets multi-composants, multi-cibles et multi-voies, les plantes médicinales chinoises devraient être une source de médicament innovante pour le traitement du DN6.

« Shengjiang san » est issu du « Wanbing Huichun » du médecin de la dynastie Ming, Gong Tingxian. Le livre « Neifu Xianfang » décrit l’utilisation de Bombyx Batryticatus, Cigadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma et Radix Rhei et Rhizome. Sur cette base, après avoir ajouté Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba et Smilacis Glabrae Rhixoma, il exerce la fonction de shengjiang san d’augmenter la lucidité, de diminuer la turbidité, de libérer la « chaleur » stagnante et d’harmoniser le « qi » et le sang 7,8. Il augmente également l’effet de renforcement de la rate et de tonification des reins. Son efficacité est compatible avec la pathogenèse du « qi » de DN qui monte et descend dans le désordre en raison d’une carence en « énergie vitale », d’une sécheresse et d’une « chaleur » excessives et d’une stagnation de la « chaleur » causée par un triple énergisant 7,8.

Des études cliniques antérieures ont montré que les plantes médicinales chinoises ont été utilisées pour traiter le diabète et ses complications, et il a été démontré que le jiawei shengjiang san (JWSJS) régule la glycémie et les lipides, réduit la protéinurie et améliore considérablement l’efficacité clinique des patients atteints de DN7 précoce. La capacité du JWSJS à réduire les protéines urinaires et la glycémie chez les rats DN a été confirmée par des études antérieures. Cela se produit probablement en inhibant les voies de signalisation TXNIP/NLRP3 et RIP1/RIP3/MLKL, en réduisant la pyroptose podocytaire et en prévenant l’apoptose nécrotique dans les tissus rénaux des rats DN, obtenant ainsi une protection rénale9. Le JWSJS peut réguler à la hausse l’expression des protéines de néphrine et de podocine et réduire les lésions podocytaires chez les rats DN, suggérant ainsi que le JWSJS a un effet inhibiteur sur les lésions des podocytes. Le JWSJS a un certain effet anti-DN avec de bons profils d’innocuité, mais il y a peu de recherches à ce sujet, et ce travail se concentre principalement sur la pyroptose et l’apoptose nécrotique. La littérature n’est pas suffisamment approfondie ou systématique10. Nos résultats précédents ont confirmé que le JWSJS peut réduire la protéinurie et atténuer les lésions rénales chez les rats DN7. Cependant, il n’y a que quelques études sur le mécanisme du JWSJS pour le traitement de la DN, et celles-ci manquent de profondeur et de systématisation. Ainsi, cette étude vise à analyser les substances moléculaires et les mécanismes d’action du JWSJS pour le traitement de la DN en utilisant la pharmacologie en réseau et à fournir une base solide pour les recherches futures.

La pharmacologie des réseaux est une méthode émergente pour étudier le mécanisme d’action des médicaments, y compris la chimioinformatique, la biologie des réseaux, la bio-informatique et la pharmacologie11,12. La conception de la recherche en pharmacologie en réseau est assez similaire au concept holistique de la médecine traditionnelle chinoise13,14, et c’est une méthode importante pour étudier le mécanisme des plantes médicinales chinoises. L’amarrage moléculaire permet d’étudier les interactions entre les molécules et de prédire leurs modèles de liaison et leur affinité. L’amarrage moléculaire est devenu une technique essentielle dans le domaine de la recherche sur les médicaments assistée par ordinateur15. Par conséquent, cette étude a construit un réseau d’interaction JWSJS-DN-cible par le biais de la pharmacologie du réseau et des méthodes d’amarrage moléculaire qui offre une base fiable et théorique pour une exploration plus approfondie du traitement DN avec JWSJS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Tous les animaux ont été entretenus et utilisés conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du National Research Council des États-Unis, 8e édition, et ont été signalés conformément aux recommandations des lignes directrices ARRIVE16,17. L’étude a été menée conformément au Guide du Conseil national de recherches de Chine pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvée par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise du Hebei (DWLL2019030).

1. Ingrédients actifs du JWSJS et collecte cible

  1. Entrez la composition médicinale JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome, et Curcumaelongae Rhizoma) dans la base de données de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise et la plateforme d’analyse (TCMSP)18 pour récupérer tous les composants chimiques.  Selon le dépistage de l’absorption, de la distribution, du métabolisme et de l’excrétion (ADME), la biodisponibilité orale (OB) ≥ 30% et les propriétés similaires au médicament (DL) ≥ 0,18 ingrédients chimiques19,20.
  2. Utilisez la base de données TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, version 2.3) pour récupérer les cibles correspondantes des ingrédients chimiques.
  3. Obtenez les ingrédients actifs de Bombyx Batryticatus et de Cicadae Periostracum en effectuant une recherche dans les bases de données de la médecine traditionnelle chinoise et de la composition chimique21.
  4. Pour la crédibilité de l’expérience, sélectionnez des composés portant le numéro CAS (Chemical Abstracts Service) pour cette étude. Téléchargez ensuite les diagrammes de structure 2D (format .sdf) des ingrédients actifs de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, mis à jour en 2021)22.
  5. Utilisez SwissADME (www.swissadme.ch, mis à jour en 2021)23pour dépister les composants présentant une absorption gastro-intestinale (GI) élevée en tant que similitude médicamenteuse (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) dont les ≥ 2 éléments étaient « Oui ». Cela a conduit aux composants actifs de Bombyx Batryticatus et Cicadae Periostracum.
  6. Importez-les dans la base de données TCMSP pour la prédiction des protéines cibles (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Version. 2.3)18.
  7. Normaliser les objectifs dans la base de données UniProt (https://www.uniprot.org, mise à jour en 2021) avec le statut défini comme Examiné et l’espèce définie comme Humain24.

2. Collecte cible correspondante DN

  1. Recherchez la néphropathie diabétique à l’aide de GeneCards (https://www.genecards.org/, version. 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, mis à jour en 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, mis à jour en 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, mis à jour en 2021)28 et bases de données DrugBank (https://www.drugbank.ca/, mis à jour en 2021)29. Obtenez les cibles de DN après combinaison et déduplication.
  2. Criblage des cibles communes de JWSJS et DN et construction de réseaux
    1. Filtrez les cibles courantes de JWSJS et DN à l’aide du logiciel R 4.2.0 et dessinez des diagrammes de Venn. Importez les ingrédients actifs et les cibles potentielles de JWSJS dans le logiciel Cytoscape 3.8.030 pour créer un diagramme de réseau médicament-ingrédient-cible qui visualise le lien entre les médicaments, les ingrédients, les cibles et les maladies.
    2. Que la taille du nœud reflète la taille de la valeur du degré, où une valeur de degré plus élevée indique que le nœud est plus important dans le réseau.
  3. Construction d’un réseau d’interaction protéine-protéine IPP et criblage de cibles principales
    1. Analyser les gènes qui se croisent à l’aide de la plateforme en ligne STRING (Version :11.5) pour construire un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP)31. Construisez le réseau à l’aide d’un mode d’analyse de protéines multiples , définissez l’espèce sur Homo sapiens et définissez le score d’interaction minimum requis sur >0,930.
    2. Utilisez Cytoscape 3.8.0 pour analyser topologiquement le réseau, calculer les valeurs de centralité d’intermédiarité (BC), de centralité de proximité (CC), de centralité de degré (DC), de centralité de vecteur propre (EC), de méthode basée sur la connectivité moyenne locale (LAC) et de centralité de réseau (NC) pour chaque nœud, et filtrer les six nœuds dont toutes les valeurs sont supérieures à la médiane32. Répétez ce processus plusieurs fois pour identifier les cibles principales du JWSJS pour la thérapie DN.
  4. Analyses fonctionnelles GO et analyse d’enrichissement de la voie KEGG
    1. Effectuer des analyses d’enrichissement GO et KEGG pour identifier les processus biologiques, les fonctions moléculaires, les composants cellulaires et les voies associés aux cibles communes du JWSJS et du DN.
    2. Utilisez l’org. Hs.eg.db package pour obtenir les ID des cibles d’intersection et utiliser clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot et ggplot2 pour les analyses d’enrichissement33.
    3. Filtrez l’analyse fonctionnelle de l’enrichissement GO sur les 10 principaux résultats biologiques avec une valeur P corrigée < 0,05, et sélectionnez les 30 principales voies avec l’enrichissement le plus élevé pour l’analyse KEGG.

3. Amarrage moléculaire

  1. Utilisez le logiciel AutoDock Vina pour effectuer un amarrage moléculaire entre les composants principaux du JWSJS et les cibles principales de la thérapie DN34.
  2. Recherchez dans la base de données PubChem le fichier sdf de la structure 2D des composants de base de JWSJS. Utilisez le logiciel ChemBio 3D Ultra14.0 pour générer et optimiser sa structure 3D, l’enregistrer au format mol2 et l’utiliser comme fichier de ligand.
  3. Trouvez et téléchargez le format pdb de la structure 3D des cibles principales à partir de la base de données de la banque de données sur les protéines (PDB) du Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Utilisez le logiciel Pymol 2.4.0 pour supprimer les molécules d’eau et les ligands de la structure protéique, enregistrez-le au format pdb et utilisez-le comme fichier récepteur.
  4. Importez le fichier pdb du récepteur dans le logiciel AutoDockTools 1.5.7 pour l’hydrogénation, convertissez à la fois la protéine réceptrice et le ligand de la petite molécule au format pdbqt, définissez la poche active pour la protéine réceptrice avec le coefficient d’espacement défini à 1.
  5. Utilisez Autodock vina 1.2.0 pour l’amarrage moléculaire et calculez l’énergie de liaison ; si l’affinité < 0, considérez que la molécule se lie spontanément à la protéine, une valeur absolue d’affinité plus élevée indique une liaison plus stable entre elles. Enfin, visualisez les résultats de l’amarrage à l’aide des logiciels Pymol 2.3.0 et LigPlot 2.2.5.

4. Simulation de dynamique moléculaire

  1. Pour effectuer des simulations MD à l’aide du logiciel Desmond, procédez comme suit :
    1. Utiliser la version académique 2019-1 du logiciel Desmond pour évaluer la stabilité et la flexibilité des interactions protéine-ligand.
    2. Mener des études de dynamique moléculaire (DM) sur un trio des complexes de ligands les plus prometteurs dérivés d’études d’amarrage. Effectuez des simulations dans un environnement aqueux SPC avec 0,15 M de NaCl, en reproduisant les conditions ioniques physiologiques. La boîte de simulation est conçue pour s’assurer que le soluté reste à au moins 10 Å de ses limites. Des contre-ions sont introduits pour neutraliser la charge électrique du système. De plus, des conditions aux limites périodiques sont appliquées, régies par les paramètres du champ de force OPLS 2005.
    3. Lancez une phase de minimisation de l’énergie pour 100 ps à l’aide des paramètres par défaut de Desmond.
    4. Assurer la stabilisation de la température et de la pression à 26,85 °C (300 K) et 1,01325 bar grâce à la chaîne Nosé-Hoover et aux méthodologies Martyna-Tobias-Klein sur tous les systèmes MD de production. La simulation de dynamique moléculaire est exécutée avec un pas de temps de 2 fs pour une durée totale de 100 ns, en enregistrant les coordonnées atomiques tous les 100 ps.
    5. Ouvrez le module SID (simulation interactions diagramme). Chargez les fichiers de données de résultats de simulation dans le module.
    6. Sélectionnez le type d’analyse souhaité parmi les options disponibles dans le module (par exemple, écart quadratique moyen [RMSD], fluctuation quadratique moyenne [RMSF], analyse de liaison hydrogène, etc.). Spécifiez les paramètres supplémentaires requis pour le type d’analyse choisi.
    7. Exécutez l’analyse en cliquant sur le bouton Analyser ou Démarrer.
    8. Une fois l’analyse terminée, visualisez et interprétez les résultats dans l’interface du module SID. Exportez les résultats si nécessaire pour une utilisation ultérieure ou une présentation.

5. Validation de l’expérience sur les animaux

  1. Animaux et conception expérimentale
    REMARQUE : Cette étude a porté sur 75 rats Sprague-Dawley mâles, âgés de 8 semaines et âgés de 8 semaines avec une masse corporelle de 150 g ± 20 g (numéro de certificat de production animale SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Hébergez les rats dans un laboratoire animal de niveau SPF et divisez-les au hasard en groupes normaux et modèles après 1 semaine d’alimentation adaptative. Fournissez au groupe normal un régime alimentaire normal et au groupe modèle un régime riche en sucre et en graisses. Au bout de 4 semaines, jeûnez les rats mais ne les privez pas d’eau pendant 12 h.
    2. Injecter dans le groupe modèle une injection intrapéritonéale de streptozotocine (STZ ; 35 mg·kg-1). Après 72 h, testez le taux de sucre dans le sang par prélèvement sanguin dans la veine de la queue. Si la glycémie à jeun est de ≥16,7 mmol· L-1, confirmez qu’il s’agit d’un modèle diabétique réussi.
    3. Confirmez le succès du modèle DN en observant les changements histopathologiques dans le rein du rat.
    4. Répartissez au hasard les modèles répliqués avec succès dans le groupe modèle, qui a reçu le JWSJS à 4,37 g/kg, 8,73 g/kg et 17,46 g/kg (équivalent à 3,2, 6,3 et 12,6 fois la dose équivalente clinique) ainsi qu’un groupe irbésartan (0,014 g/kg). Chaque groupe était composé de 10 rats. Administrer tous les médicaments par gavage oral une fois par jour. Maintenez ce schéma posologique de manière constante pendant 4 semaines.
    5. Anesthésier les rats à l’aide d’une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg) et confirmer la bonne anesthésie par perte du réflexe de retrait de la pédale. Prélever des échantillons de sang dans l’aorte abdominale avant l’euthanasie.
    6. Prélever les reins après euthanasier les rats à l’aide d’une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une dose de 150 mg/kg.
      REMARQUE : Les animaux ont été euthanasiés sans cruauté, conformément aux directives (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) les plus récentes de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie.
  2. Analyses histologiques rénales
    REMARQUE : Les tissus rénaux ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % et déshydratés dans de l’éthanol après 48 h ; Les sections ont été noyées dans de la paraffine. Les coupes ont été coupées en fines tranches (4 μm) pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) et à l’acide périodique de Schiff (PAS), et les changements morphologiques de l’histologie rénale ont été observés au microscope optique.
    1. Coloration HE :
      1. Déparaffinage et hydratation : Traiter les coupes de tissus avec du xylène I et II (10 min chacun), de l’alcool absolu I et II (3 min chacun). Ensuite, immergez les sections de tissu dans de l’éthanol à 95 %, 90 %, 80 % et 70 % (2 min chacune), suivies d’un lavage à l’eau distillée pendant 5 min.
      2. Placez les sections de tissu dans une coloration à l’hématoxyline pendant 5 min, puis différenciez les sections avec de l’alcool chlorhydrique pendant 5 s.
      3. Placez la section dans la solution de coloration à l’éosine pendant 3 min.
      4. Déshydratation, nettoyage et montage : Déshydratez les sections à des moments variables dans différents éthanols (70 %, 80 %, 90 %, 95 % et éthanols absolus), puis clarifiez-les dans du xylène I et II, puis montez avec de la gomme neutre.
    2. Coloration PAS :
      1. Suivez les étapes de déparaffinage décrites à l’étape 5.2.1 et traitez la section avec la solution de coloration acide périodique pendant ~8 min.
      2. Rincez les sections à l’eau distillée pendant 2 min, puis colorez-les avec le réactif Schiff pendant 15 min dans l’obscurité.
      3. Lavez les sections à l’eau du robinet pendant 10 minutes après les avoir traitées avec le réactif Schiff.
      4. Contre-colorez les sections à l’aide d’hématoxyline pendant 1 min, puis différenciez-les avec de l’alcool HCl pendant 30 s. Lavez à nouveau les sections à l’eau du robinet pendant 5 minutes pour colorer le noyau en bleu.
    3. Microscopie électronique :
      1. Fixez les échantillons dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 3 h, puis rincez-les dans du PBS pendant 3 h. De plus, traitez les échantillons avec de l’acide osmique à 1 % pendant 3 h, puis rincez-les à nouveau dans du PBS pendant 3 h.
      2. Déshydratez-vous par une série graduée de bains d’alcool se terminant par de l’acétone (chaque étape dure environ 2 h au total).
      3. Infiltrer les échantillons avec un mélange d’époxypropane et de résine époxy (1:1) à température ambiante (RT) pendant 2 h, suivi d’une résine époxy pure à 37 °C pendant 2 h supplémentaires.
      4. Après cela, durcissez et durcissez les échantillons à des températures de plus en plus élevées sur une période de 36 h avant la section. Ce processus garantit que le tissu est complètement infiltré avec la résine, qui est ensuite durcie pour permettre un tranchage fin pour la microscopie électronique.
      5. Colorer deux fois avec de l’acétate d’uranyle à 3 % et du plomb-acide, et observer et photographier les échantillons par microscopie électronique dans les 15 minutes.
        REMARQUE : Les réglages de la microscopie électronique en transmission (MET) sont les suivants : un grossissement de 7000x en mode à contraste élevé (Zoom-1 HC-1), avec une tension d’accélération de 80,0 kV sur un système MET.
  3. Immunohistochimie
    1. Déparaffinage : Placez les sections de tissu dans du xylène I et II pendant 10 min chacune.
    2. Réhydratation : Réhydratez les sections de tissus déparaffinés en les plaçant successivement dans de l’éthanol absolu I et II pendant 3 min chacune, puis de 95 %, 90 %, 80 % et 70 % d’éthanol pendant 2 min chacune.
    3. Récupération de l’antigène : Immerger les coupes de tissus dans une solution tampon de citrate-acide citrique 0,1 M sous haute pression pendant environ 5 minutes, puis refroidir à RT.
    4. Blocage : Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps, bloquer en incubant les sections de tissu avec 5 % de sérum de chèvre normal à environ 37 °C pendant 30 min.
    5. Incubation primaire des anticorps : Ajouter les anticorps primaires p-EGFR (dilué 1:200) et p-MAPK3/1 (dilué 1:200) sur des coupes de tissus et incuber pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    6. Incubation d’anticorps secondaires : Lavez les sections trois fois avec du PBS, puis ajoutez des anticorps secondaires marqués à la biotine (dilués dans du PBS selon les instructions du fabricant) sur les sections et incubez à 37 °C pendant 30 min.
    7. Appliquez une solution de travail de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort sur les coupes de tissus à 37 °C, puis lavez-les trois fois à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    8. Pour le développement DAB, incuber les sections avec la solution de développement DAB (3 min dans l’obscurité à RT), suivie d’un rinçage à l’eau distillée. Le DAB agit comme un substrat chromogène pour l’enzyme raifort peroxydase (HRP), qui brunit lors de l’oxydation.
    9. Utilisez de l’hématoxyline pour contre-coloration pendant environ 2 min, différenciez les sections avec de l’alcool chlorhydrique à 1% pendant 5 s, puis lavez à l’eau courante pour qu’elles deviennent bleues.
    10. Déshydrater en plaçant successivement les sections dans une série d’éthanol de faible à haute concentration, clair dans du xylène I et II, et monter les sections avec de la gomme neutre.
      REMARQUE : Cette procédure dure environ 18 à 24 h, y compris l’incubation primaire des anticorps pendant la nuit.
    11. Sélectionnez au hasard trois champs visuels (200x) pour chaque section et analysez les résultats de coloration des sections à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Le logiciel Image Pro Plus 6.0 a été utilisé en suivant les étapes ci-dessous.
    12. Tout d’abord, importez une image de la section dans le logiciel.
    13. Correction de la densité : Pour garantir des résultats précis, effectuez une correction de la densité.
      1. Accédez à Mesurer >étalonnage > l’intensité > nouvelles > Normes > options de densité > options facultatives image. Ensuite, cliquez sur une zone vide de l’image pour enregistrer la valeur d’arrière-plan et confirmez-la en cliquant sur OK.
    14. Réglage des paramètres de mesure : Configurez les paramètres de mesure pour calculer la surface et la densité optique intégrée (IOD).
      1. Cliquez sur Mesurer > Nombre/Taille > Mesurer > sélectionnez Mesures. Sélectionnez Area(100) et IOD, puis cliquez sur OK.
      2. Allez dans Options, cochez Fond sombre sur l’échantillon, Préfiltre 4-Connect et cliquez sur OK.
    15. Sélection des couleurs : pour déterminer avec précision la positivité, sélectionnez des couleurs pour détecter les zones tachées par rapport aux zones non tachées.
      1. Cliquez sur Sélectionner les couleurs > histogramme basé > HSI. Ajustez la valeur H en fonction de l’image tout en gardant S inchangé et I compris entre zéro et la valeur d’arrière-plan. Ensuite, validez en cliquant sur Fermer.
      2. Collecte et calcul des données : Effectuez la collecte et le calcul des données en cliquant sur Mesurer > Collecteur de données > Disposition, où Nom, Superficie (Somme) et IOD (Somme) sont sélectionnés. Ensuite, cliquez sur Compter > Collecter maintenant > liste de données pour exporter les données à des fins d’analyse ou de stockage plus approfondis.
        REMARQUE : Cela a permis d’obtenir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans chaque section en termes de IOD/Zone, qui indique la quantité de protéines présente par rapport à la surface totale analysée.
  4. Transfert Western
    1. Prélevez le tissu rénal et coupez-le en morceaux. Placez ces morceaux dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, ajoutez la solution de lyse protéique pré-refroidie (50 mM de Tris [pH 7,4], 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium [SDS]) et homogénéisez.
    2. Laisser sur glace pendant 30 min, puis centrifuger à 13400 x g pendant 20 min à 4 °C. Conservez l’échantillon obtenu dans un congélateur à -80 °C.
    3. Utilisez la méthode de Bradford pour quantifier les protéines.
      1. Préparez la solution de travail Coomassie Brilliant Blue en mélangeant le réactif et l’eau distillée dans un rapport de 1:4.
      2. Établissez trois groupes : blanc, groupe protéique standard et groupe protéique échantillon. Ajouter 3 ml de solution de travail Coomassie Brilliant Blue à chaque groupe, ainsi que du sérum physiologique pour le groupe blanc, de la protéine standard pour le groupe standard et de la protéine surnageante extraite pour le groupe échantillon.
      3. Après avoir laissé reposer les mélanges pendant 5 minutes, mesurez leurs valeurs d’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre ultraviolet.
      4. Calculez la concentration de l’échantillon à l’aide de la formule suivante : Concentration en protéines (mg/mL) = (Valeur d’absorbance de l’échantillon/Valeur d’absorbance standard du tube) x Concentration standard en protéines x 5.
    4. Ajoutez un volume égal de tampon de chargement 6x à chaque échantillon de protéines. Faites bouillir à 100 °C pendant 5 min avant de les aliquote et de les conserver dans un congélateur à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.
    5. Effectuez une électrophorèse, un transfert et un blocage standard.
      1. Effectuez une électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide (PAGE) à l’aide d’un gel de résolution à 12 %. Appliquez une tension constante de 100 V pour le gel d’empilage et de 120 V pour le gel de résolution jusqu’à ce que la face du colorant atteigne le bas du gel.
      2. Transférez les protéines sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à 100 V pendant 2 h dans une chambre froide à 4 °C à l’aide d’un système de transfert humide.
      3. Après le transfert de protéines, bloquer les membranes avec 5% de lait écrémé dans le TBST pendant 1 h à la RT.
    6. Anticorps primaires dilués EGFR (1:2 000), p-EGFR (1:2 000), MAPK3/1 (1:2 000), p-MAPK3/1 (1:2 000), Bcl-2 (1:2 000), BAX (1:2 000) et CAPDH (1:5 000) dans TBST avec 5 % de BSA. Ajoutez ces anticorps primaires dilués et incubez les membranes pendant la nuit à 4 °C en agitant doucement.
    7. Après avoir lavé la membrane trois fois avec du TBST, ajoutez des anticorps secondaires dilués (1:5 000), suivis d’une incubation pendant 1 h. Après le développement des couleurs, effectuez une analyse quantitative des bandes cibles à l’aide du logiciel ImageJ.
  5. Analyse qPCR
    1. Regroupement : Attribuez des échantillons à des groupes - Contrôle, DN, Irbésartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Extraction de l’ARN : Effectuer l’homogénéisation des tissus et l’extraction de l’ARN, suivie de l’ajout de chloroforme, de la centrifugation et de la précipitation de l’ARN selon les instructions du fabricant.
    3. Précipitation et lavage de l’ARN : Précipiter l’ARN avec de l’isopropanol et laver avec de l’éthanol.
    4. Solubilisation de l’ARN : Sécher la pastille d’ARN et la dissoudre dans de l’eau traitée au DEPC.
    5. Synthèse de l’ADNc : Effectuez la transcription inverse à l’aide de mélanges réactionnels spécifiques selon les instructions du fabricant.
    6. Amplification qPCR : Utilisez des amorces spécifiques pour GAPDH, MAPK3, MAPK1 et EGFR pour la qPCR et effectuez l’amplification selon les instructions du fabricant.
      Les séquences d’amorces étaient les suivantes :
      GAPDH : F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3' ;
      MAPK3 : F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3' ;
      MAPK1 : F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3' ;
      EGFR : F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTTTTTTGATTGG-3'.

6. Méthodes statistiques

  1. Effectuez l’analyse à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., SPSS) et représentez les données mesurées comme la moyenne ± l’écart(s) type(s). Si les données répondent aux critères de distribution normale et d’homogénéité de la variance, comparer entre les groupes à l’aide de l’ANOVA à un facteur et effectuer plusieurs comparaisons avec la méthode de Bonferroni.
  2. Utilisez le test T2 pour des comparaisons multiples si la variance n’est pas homogène. Considérez P < 0,05 comme statistiquement significatif.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Suite au protocole, 90 principes actifs de JWSJS ont finalement été obtenus à partir de l’analyse après criblage et déduplication selon les normes établies de OB et DL. Ceux-ci comprenaient 20 types d’Hedysarum Multijugum Maxim, 23 types d’Epimrdii Herba, 15 types de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 types de Radix Rhei et Rhizome, quatre types de Curcumaelongae Rhizoma, 15 types de Cigadae Periostracum et six types de composan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Notre étude a utilisé une combinaison de pharmacologie de réseau, d’amarrage moléculaire et de modèles animaux in vivo . Une étape critique a été la mise en place du réseau « drug-component-target », qui a été crucial pour identifier les mécanismes potentiels du JWSJS dans le traitement de la DN, en se concentrant particulièrement sur son interaction avec la voie de signalisation EGFR/MAPK3/1.

Au cours de cette étude, nous avons appo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le projet général de la Fondation des sciences naturelles de la province du Hebei, Chine (n° H2019423037).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2×SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Automatic biochemical analysis instrumentHitachi, Japan7170A
Anhydrous EthanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Primary antibodies Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Primary antibodies Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopeOlympus, JapanBX53
Chloroform SubstituteECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARelease 2019-1
Digital Constant Temperature Water BathChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Fasting blood glucose (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Primary antibodies Affinity, USAAF7021Rat
Glycated serum protein (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Transmission electron microscopeHitachi, JapanH-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solutionServicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Real-Time PCR Amplification InstrumentApplied Biosystems, USAiQ5 
Irbesartan tabletsHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China TGL-16K
Mini trans-blot transfer systemBio-Rad, USAN/A
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad, USAN/A
NanoVue Plus SpectrophotometerHealthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765
p-EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF3044Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies Affinity, USAAF1015Rat
Secondary antibodies Santa Cruz, USAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, USAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 

Références

  1. Viigimaa, M., Sachinidis, A., Toumpourleka, M., Koutsampasopoulos, K., Alliksoo, S., Titma, T. Macrovascular complications of Type 2 diabetes mellitus. Curr Vasc Pharmacol. 18 (2), 110-116 (2020).
  2. Umanath, K., Lewis, J. B. Update on diabetic nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 71 (6), 884-895 (2018).
  3. Han, W., et al. Huangkui capsule alleviates renal tubular epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy via inhibiting NLRP3 inflammasome activation and TLR4/NF-kappaB signaling. Phytomedicine. 57, 203-214 (2019).
  4. Giralt-Lopez, A., et al. Revisiting experimental models of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 21 (10), 3587(2020).
  5. Lu, Z., Zhong, Y., Liu, W., Xiang, L., Deng, Y. the efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease. J Diabetes Res. 2019, 2697672(2019).
  6. Niu, H., et al. The therapeutic mechanism of PuRenDan for the treatment of diabetic nephropathy: Network pharmacology and experimental verification. J Ethnopharmacol. 293, 115283(2022).
  7. Gao, F., Wang, Z., Yang, B., Tan, J. Mechanism of Jiawei Shengjiang San in the treatment of membranous nephropathy based on network pharmacology. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 37 (5), 132-138 (2021).
  8. Li, W., Xie, M. Analysis of composing and application rule in the evolution of Shengjiang San. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 44 (10), 894-898 (2021).
  9. Zhang, Y., et al. Mechanism of Jiawei Shengjiang powder in inhibiting renal inflammation and fibrosis in diabetic rats based on TLR4/NF-kappaB and Raf/MEK pathways. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (5), 20-27 (2022).
  10. Zhao, L., et al. Pharmacodynamic mechanism of Yishen Tongluo Formula in treatment of diabetic kidney disease based on network pharmacology and verification of key regulation pathway. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 45 (8), 824-834 (2022).
  11. Zhang, J., Liang, R., Wang, L., Yang, B. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology. J Ethnopharmacol. 229, 104-114 (2019).
  12. Chen, L., et al. Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure. J Ethnopharmacol. 219, 359-368 (2018).
  13. Zhu, M., Qin, Y. C., Gao, C. Q., Yan, H. C., Wang, X. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food Funct. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  14. Ding, Z., et al. Systems pharmacology reveals the mechanism of activity of Ge-Gen-Qin-Lian decoction against LPS-induced acute lung injury: A novel strategy for exploring active components and effective mechanism of TCM formulae. Pharmacol Res. 156, 104759(2020).
  15. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412(2010).
  17. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guides for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press (US). Washington (DC. (2011).
  18. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  19. Xu, X., et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 13 (6), 6964-6982 (2012).
  20. Tao, W., et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease. J Ethnopharmacol. 145 (1), 1-10 (2013).
  21. Traditional Chinese Medicine and Chemical Composition databases in Chemistry Database[DB/OL]. , Available from: http://www.organchem.csdb.cn (2021).
  22. Halladay, C. W., Trikalinos, T. A., Schmid, I. T., Schmid, C. H., Dahabreh, I. J. Using data sources beyond PubMed has a modest impact on the results of systematic reviews of therapeutic interventions. J Clin Epidemiol. 68 (9), 1076-1084 (2015).
  23. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7, 42717(2017).
  24. UniProt, C. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 40 (D1), D71-D75 (2012).
  25. Stelzer, G., et al. The GeneCards Suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1-33 (2016).
  26. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Curr Protoc Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  27. Zhou, Y., et al. Therapeutic target database update 2022: facilitating drug discovery with enriched comparative data of targeted agents. Nucleic Acids Res. 50 (D1), D1398-D1407 (2022).
  28. Whirl-Carrillo, M., et al. Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 92 (4), 414-417 (2012).
  29. Law, V., et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic Acids Res. 42 (D1), D1091-D1097 (2014).
  30. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  31. Xu, J., et al. Pharmacological mechanisms underlying the neuroprotective effects of Alpinia oxyphylla Miq. on Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 2071(2020).
  32. Tang, Y., Li, M., Wang, J., Pan, Y., Wu, F. X. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks. Biosystems. 127, 67-72 (2015).
  33. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  34. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  35. Yang, X., et al. Rational selection of the 3D structure of biomacromolecules for molecular docking studies on the mechanism of endocrine disruptor action. Chem Res Toxicol. 29 (9), 1565-1570 (2016).
  36. Diller, D. J., Merz, K. M. throughput docking for library design and library prioritization. Proteins. 43 (2), 113-124 (2001).
  37. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PLoS One. 8 (12), e83922(2013).
  38. Godse, N. R., et al. TMEM16A/ANO1 inhibits apoptosis via downregulation of Bim expression. Clin Cancer Res. 23 (23), 7324-7332 (2017).
  39. Ilhan, I., et al. Irbesartan decreased mitochondrial stress-related apoptosis in cisplatin-induced acute kidney injury via regulating BCL-2/BAX signaling. Mol Biol Rep. 49 (7), 6125-6133 (2022).
  40. Lee, M., et al. Protective effect of hydroxysafflor yellow a on nephropathy by attenuating oxidative stress and inhibiting apoptosis in induced Type 2 diabetes in rat. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7805393(2020).
  41. Schlessinger, J. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell. 110 (6), 669-672 (2002).
  42. Gu, X., Chu, L., Kang, Y. Angiogenic factor-based signature predicts prognosis and immunotherapy response in non-small-cell lung cancer. Front Genet. 13, 894024(2022).
  43. Chu, L., et al. Age-related changes in endogenous glucocorticoids, gonadal steroids, endocannabinoids and their ratios in plasma and hair from the male C57BL/6 mice. Gen Comp Endocrinol. 301, 113651(2021).
  44. Chen, J., Chen, J. K., Harris, R. C. EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 26 (5), 1115-1125 (2015).
  45. Skibba, M., et al. New EGFR inhibitor, 453, prevents renal fibrosis in angiotensin II-stimulated mice. Eur J Pharmacol. 789, 421-430 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

M decineNum ro 207Pharmacologie de r seauAmarrage mol culaireVoie de signalisation EGFR MAPK3 1ApoptoseM tabolisme des lipidesSignalisation PI3K AktSignalisation HIF 1Querc tineAcide palmitol iqueLut oline

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.