Efeito antagônico de Jiawei Shengjiang San em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a farmacologia da rede e as técnicas de docking molecular para explorar o mecanismo de ação do Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética.

Resumo

Nosso objetivo foi aprofundar os mecanismos subjacentes à ação de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética e na implantação da farmacologia em rede. Empregando farmacologia de rede e técnicas de docking molecular, previmos os componentes ativos e alvos do JWSJS e construímos uma rede meticulosa de "medicamento-componente-alvo". As análises de enriquecimento da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG) foram utilizadas para discernir as vias terapêuticas e os alvos do JWSJS. O Autodock Vina 1.2.0 foi implantado para verificação de docking molecular, e uma simulação de dinâmica molecular de 100 ns foi conduzida para confirmar os resultados do docking, seguida de verificação in vivo em animais. Os resultados revelaram que o JWSJS compartilhava 227 alvos que se cruzavam com a nefropatia diabética, construindo uma topologia de rede de interação proteína-proteína. A análise de enriquecimento de KEGG denotou que o JWSJS mitiga a nefropatia diabética modulando lipídios e aterosclerose, a via de sinalização PI3K-Akt, apoptose e a via de sinalização HIF-1, com proteína quinase 1 ativada por mitógeno (MAPK1), MAPK3, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e serina/treonina-proteína quinase 1 (AKT1) identificados como alvos coletivos de múltiplas vias. O docking molecular afirmou que os principais componentes do JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico e luteolina) poderiam estabilizar a conformação com três alvos principais (MAPK1, MAPK3 e EGFR) por meio de ligações de hidrogênio. Exames in vivo indicaram aumento notável no peso corporal e reduções nos níveis de proteína sérica glicada (GSP), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), trifosfato de uridina (UTP) e glicemia de jejum (FBG) devido à JWSJS. A microscopia eletrônica acoplada à coloração de hematoxilina e eosina (HE) e ácido periódico-Schiff (PAS) destacou o potencial de cada grupo de tratamento em aliviar danos renais em diversas extensões, exibindo declínios variados em p-EGFR, p-MAPK3 / 1 e BAX, e incrementos na expressão de BCL-2 nos tecidos renais dos ratos tratados. Conclusivamente, esses insights sugerem que a eficácia protetora da JWSJS na nefropatia diabética pode estar associada à supressão da ativação da via de sinalização EGFR/MAPK3/1 e ao alívio da apoptose das células renais.

Introdução

O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica que acomete múltiplos sistemas e pode causar diversas complicações devido à hiperglicemia contínua, como nefropatia diabética (ND), retinopatia e neuropatia¹. A ND é uma complicação grave do DM, sendo responsável por cerca de 30% a 50% da doença renal terminal (DRT)². Sua manifestação clínica é a microalbuminúria, que pode evoluir para DRCT caracterizada por aumento do volume glomerular, hiperplasia estromal mesangial e espessamento da membrana basal glomerular³. A patogênese da ND é complexa e não foi totalmente elucidada. Métodos clínicos, como redução da glicose no sangue, regulação da pressão arterial e redução da proteinúria, são usados principalmente para retardar seu progresso, mas o efeito é geral.

Atualmente, nenhum medicamento específico foi encontrado para tratar o DN⁴. Durante séculos, no entanto, os fitoterápicos chineses têm sido amplamente utilizados no tratamento do DM e suas complicações⁵ e melhoraram os sintomas clínicos dos pacientes e retardaram a progressão da doença. Devido às vantagens dos efeitos multicomponentes, multialvos e multivias, espera-se que os fitoterápicos chineses sejam uma fonte inovadora de medicamentos para o tratamento do DN⁶.

"Shengjiang san" originou-se do "Wanbing Huichun" pelo médico da Dinastia Ming Gong Tingxian. O livro "Neifu Xianfang" descreve o uso de Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhisoma e Radix Rhei et Rhizome. Com base nisso, depois de adicionar Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba e Smilacis Glabrae Rhixoma, exerce a função de shengjiang san de aumentar a lucidez, diminuir a turbidez, liberar o "calor" estagnado e harmonizar o "qi" e o sangue ^7,8. Também aumenta o efeito de fortalecer o baço e tonificar os rins. Sua eficácia é consistente com a patogênese do "qi" do DN para subir e descer fora de ordem devido à deficiência de "energia vital", secura excessiva e "calor" e estagnação do "calor" causada por um energizador triplo ^7,8.

Estudos clínicos anteriores mostraram que medicamentos fitoterápicos chineses têm sido usados para tratar o DM e suas complicações, e o jiawei shengjiang san (JWSJS) demonstrou regular a glicose no sangue e os lipídios, reduzir a proteinúria e melhorar significativamente a eficácia clínica de pacientes com ND precoce⁷. A capacidade do JWSJS de reduzir os níveis de proteína urinária e glicose no sangue em ratos com ND foi confirmada por estudos anteriores. Isso provavelmente ocorre inibindo as vias de sinalização TXNIP/NLRP3 e RIP1/RIP3/MLKL, reduzindo a piroptose de podócitos e prevenindo a apoptose necrótica em tecidos renais de ratos com ND, alcançando assim proteção renal⁹. A JWSJS pode regular positivamente a expressão da nefrina e da proteína podocina e reduzir a lesão de podócitos em ratos com DN, sugerindo assim que a JWSJS tem um efeito inibitório na lesão de podócitos. O JWSJS tem um certo efeito anti-DN com bons perfis de segurança, mas há pouca pesquisa sobre isso, e este trabalho se concentra principalmente na piroptose e na apoptose necrótica. A literatura não é suficientemente profunda ou sistemática¹⁰. Nossos achados anteriores confirmaram que a JWSJS pode reduzir a proteinúria e aliviar os danos renais em ratos com ND⁷. No entanto, existem poucos estudos sobre o mecanismo da JWSJS para o tratamento da ND, e estes carecem de profundidade e sistematização. Assim, este estudo tem como objetivo analisar as substâncias moleculares e os mecanismos de ação da JWSJS para o tratamento da ND usando farmacologia em rede e fornecer uma base sólida para pesquisas futuras.

A farmacologia de rede é um método emergente para estudar o mecanismo de ação de drogas, incluindo quimioinformática, biologia de rede, bioinformática e farmacologia^11,12. O projeto de pesquisa em farmacologia de rede é bastante semelhante ao conceito holístico da medicina tradicional chinesa^13,14 e é um método importante para estudar o mecanismo dos medicamentos fitoterápicos chineses. O docking molecular pode estudar as interações entre moléculas e prever seus padrões de ligação e afinidade. O docking molecular emergiu como uma técnica crítica no campo da pesquisa de medicamentos auxiliada por computador¹⁵. Portanto, este estudo construiu uma rede de interação JWSJS-DN-alvo por meio de farmacologia de rede e métodos de docking molecular que oferece uma base confiável e teórica para uma exploração mais aprofundada do tratamento de DN com JWSJS.

Protocolo

Todos os animais foram mantidos e utilizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório,^8ª Edição, e foram relatados conforme recomendado nas diretrizes ARRIVE^16,17. O estudo foi conduzido de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa da China para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Hebei (DWLL2019030).

1. Ingredientes ativos JWSJS e coleta de alvos

1. Insira a composição medicinal JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rizoma e Curcumaelongae Rhizoma) no banco de dados de farmacologia de sistemas de medicina tradicional chinesa e banco de dados da plataforma de análise (TCMSP)¹⁸ para recuperar todos os componentes químicos.  De acordo com a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME), a biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e as propriedades semelhantes a drogas (DL) ≥ 0,18 ingredientes químicos ^19,20.
2. Use o banco de dados TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, Versão. 2.3) para recuperar os alvos correspondentes de ingredientes químicos.
3. Obtenha os ingredientes ativos de Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum pesquisando nos bancos de dados de Medicina Tradicional Chinesa e Composição Química²¹.
4. Para credibilidade experimental, selecione compostos com números de serviço de resumos químicos (CAS) para este estudo. Em seguida, baixe diagramas de estrutura 2D (formato .sdf) de ingredientes ativos do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, atualizado em 2021)²².
5. Use o SwissADME (www.swissadme.ch, atualizado em 2021)²³para rastrear os componentes com alta absorção gastrointestinal (GI) como similaridade de medicamentos (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) cujos ≥ 2 itens foram 'Sim'. Isso levou aos componentes ativos de Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum.
6. Importe-os para o banco de dados TCMSP para previsão de proteína-alvo (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Versão. 2.3)¹⁸.
7. Padronizar os alvos no banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org, atualizado em 2021) com o status definido como Revisado e as espécies definidas como Humano²⁴.

2. Coleta de alvos correspondente ao DN

1. Pesquise nefropatia diabética por meio de GeneCards (https://www.genecards.org/, versão 5.1)²⁵, OMIM (https://omim.org/, atualizado em 2021)²⁶, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, atualizado em 2021)²⁷, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, atualizado em 2021)²⁸ e bancos de dados DrugBank (https://www.drugbank.ca/, atualizado em 2021)²⁹. Obtenha os destinos do DN após a combinação e a eliminação da duplicação.
2. Triagem de alvos comuns de JWSJS e DN e construção de rede
   1. Filtre os alvos comuns de JWSJS e DN usando o software R 4.2.0 e desenhe diagramas de Venn. Importe os ingredientes ativos e os alvos potenciais do JWSJS para o software Cytoscape^{3.8.0 30} para criar um diagrama de rede Medicamento-Ingrediente-Alvo que visualize a conexão entre medicamentos, ingredientes, alvos e doenças.
   2. Deixe o tamanho do nó refletir o tamanho do valor do grau, onde um valor de grau mais alto indica que o nó é mais importante na rede.
3. Construção de rede de interação proteína-proteína PPI e triagem de alvos centrais
   1. Analise os genes que se cruzam usando a plataforma online STRING (Versão: 11.5) para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI)³¹. Construa a rede usando um modo de análise de proteínas múltiplas , defina a espécie como Homo sapiens e defina a pontuação mínima de interação necessária para >0,9³⁰.
   2. Use o Cytoscape 3.8.0 para analisar a rede topologicamente, calcular a centralidade de intermediação (BC), centralidade de proximidade (CC), centralidade de grau (DC), centralidade de autovetor (EC), método baseado em conectividade média local (LAC) e valores de centralidade de rede (NC) para cada nó e filtrar os seis nós com todos os valores maiores que a mediana³². Repita esse processo várias vezes para identificar os principais alvos do JWSJS para a terapia de ND.
4. Análises funcionais GO e análise de enriquecimento da via KEGG
   1. Realize análises de enriquecimento GO e KEGG para identificar os processos biológicos, funções moleculares, componentes celulares e vias associadas aos alvos comuns de JWSJS e DN.
   2. Use a organização. Hs.eg.db pacote para obter as IDs dos destinos de interseção e use o clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot e ggplot2 para análises de enriquecimento³³.
   3. Faça a triagem da análise funcional de enriquecimento de GO nos 10 principais acertos biológicos com um valor de P corrigido < 0,05 e selecione as 30 principais vias com o maior enriquecimento para análise KEGG.

3. Acoplamento molecular

1. Use o software AutoDock Vina para realizar o acoplamento molecular entre os componentes principais do JWSJS e os alvos principais para a terapia DN³⁴.
2. Pesquise no banco de dados PubChem para obter o arquivo sdf da estrutura 2D dos componentes principais do JWSJS. Use o software ChemBio 3D Ultra14.0 para gerar e otimizar sua estrutura 3D, salve-o no formato mol2 e use-o como um arquivo ligante.
3. Encontre e baixe o formato pdb da estrutura 3D dos alvos principais do banco de dados do Banco de Dados de Proteínas (PDB) do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Use o software Pymol 2.4.0 para remover moléculas de água e ligantes da estrutura da proteína, salve-o no formato pdb e use-o como um arquivo receptor.
4. Importe o arquivo pdb do receptor para o software AutoDockTools 1.5.7 para hidrogenação, converta a proteína do receptor e o ligante de molécula pequena no formato pdbqt, defina o bolso ativo para a proteína do receptor com o coeficiente de espaçamento definido em 1.
5. Use o Autodock vina 1.2.0 para acoplamento molecular e calcule a energia de ligação; se a afinidade < 0, considere que a molécula se liga espontaneamente à proteína, maior valor absoluto de afinidade indica uma ligação mais estável entre elas. Por fim, visualize os resultados do encaixe usando os softwares Pymol 2.3.0 e LigPlot 2.2.5.

4. Simulação dinâmica molecular

1. Para realizar simulações de MD usando o software Desmond, siga estas etapas:
   1. Empregue a versão acadêmica 2019-1 do software Desmond para avaliar a estabilidade e a flexibilidade das interações proteína-ligante.
   2. Conduza investigações de dinâmica molecular (MD) em um trio dos complexos de ligantes mais promissores derivados de estudos de docking. Realizar simulações em ambiente aquoso de SPC com NaCl 0,15 M, replicando as condições iônicas fisiológicas. A caixa de simulação é projetada para garantir que o soluto permaneça a pelo menos 10 Å de distância de seus limites. Contra-íons são introduzidos para neutralizar a carga elétrica do sistema. Além disso, são aplicadas condições de contorno periódicas, regidas pelos parâmetros do campo de força OPLS 2005.
   3. Inicie uma fase de minimização de energia para 100 ps usando os parâmetros padrão de Desmond.
   4. Garanta a estabilização de temperatura e pressão a 26,85 °C (300 K) e 1,01325 bar por meio da cadeia Nosé-Hoover e das metodologias Martyna-Tobias-Klein em todos os sistemas MD de produção. A simulação de dinâmica molecular é executada com um passo de tempo de 2 fs para uma duração total de 100 ns, registrando as coordenadas atômicas a cada 100 ps.
   5. Abra o módulo SID (diagrama de interações de simulação). Carregue os arquivos de dados do resultado da simulação no módulo.
   6. Selecione o tipo de análise desejado entre as opções disponíveis no módulo (por exemplo, desvio quadrático médio [RMSD], flutuação quadrática média [RMSF], análise de ligações de hidrogênio, etc.). Especifique quaisquer parâmetros adicionais necessários para o tipo de análise escolhido.
   7. Execute a análise clicando no botão Analisar ou Iniciar.
   8. Quando a análise estiver concluída, visualize e interprete os resultados na interface do módulo SID. Exporte os resultados, se necessário, para uso ou apresentação posterior.

5. Validação de experimentos com animais

1. Animais e planejamento experimental
   NOTA: Este estudo envolveu 75 ratos Sprague-Dawley machos, que foram obtidos de uma instalação de produção animal de grau SPF e tinham 8 semanas de idade com uma massa corporal de 150 g ± 20 g (número do certificado de produção animal SCXK [Hebei] 2018-004).
   1. Alojar os ratos em um laboratório de animais de nível SPF e dividi-los aleatoriamente em grupos normais e modelo após 1 semana de alimentação adaptativa. Forneça ao grupo normal uma dieta normal e ao grupo modelo uma dieta rica em açúcar e gordura. Após 4 semanas, jejue os ratos, mas não os prive de água por 12 h.
   2. Injete o grupo modelo com uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; 35 mg · ^kg-1). Após 72 h, testar os níveis de açúcar no sangue através de amostragem de sangue nas veias da cauda. Se o nível de glicose no sangue em jejum for ≥16,7 mmol· ^L-1, confirma-o como um modelo diabético de sucesso.
   3. Confirme o modelo de ND bem-sucedido observando alterações histopatológicas no rim de ratos.
   4. Divida aleatoriamente os modelos replicados com sucesso no grupo modelo, que recebeu JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg e 17,46 g/kg (equivalente a 3,2, 6,3 e 12,6 vezes a dose clínica equivalente), bem como um grupo de irbesartan (0,014 g/kg). Cada grupo foi composto por 10 ratos. Administre todos os medicamentos por gavagem oral uma vez ao dia. Mantenha este regime posológico de forma consistente durante 4 semanas.
   5. Anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg) e confirmar a anestesia adequada pela perda do reflexo de retirada do pedal. Colete amostras de sangue da aorta abdominal antes da eutanásia.
   6. Colete os rins após a eutanásia dos ratos usando uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose de 150 mg / kg.
      NOTA: Os animais foram eutanasiados humanamente, seguindo as diretrizes mais atualizadas da American Veterinary Medical Association (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) para eutanásia.
2. Análises histológicas renais
   NOTA: Os tecidos renais foram fixados em paraformaldeído a 4% e desidratados em etanol após 48 h; Os cortes foram incluídos em parafina. Os cortes foram cortados em fatias finas (4 μm) para coloração de hematoxilina e eosina (HE) e ácido periódico-Schiff (PAS), e as alterações morfológicas da histologia renal foram observadas ao microscópio óptico.
   1. Coloração HE:
      1. Desparafinação e hidratação: Trate as seções de tecido com xileno I e II (10 min cada), álcool absoluto I e II (3 min cada). Em seguida, mergulhe as seções de tecido em etanol a 95%, 90%, 80% e 70% (2 min cada), seguido de uma lavagem com água destilada por 5 min.
      2. Coloque as seções de tecido na coloração de hematoxilina por 5 min e, em seguida, diferencie as seções com álcool clorídrico por 5 s.
      3. Coloque a seção na solução de coloração de eosina por 3 min.
      4. Desidratação, limpeza e montagem: Desidrate as seções em momentos variados em diferentes etanoles (70%, 80%, 90%, 95% e etanoles absolutos), depois limpe-as em xileno I e II, seguido de montagem com goma neutra.
   2. Coloração PAS:
      1. Siga as etapas de desparafinação descritas na etapa 5.2.1 e trate a seção com a solução de coloração ácida periódica por ~ 8 min.
      2. Enxágue as seções em água destilada por 2 min e depois core-as com o Reagente de Schiff por 15 min no escuro.
      3. Lave as seções em água da torneira por 10 minutos após tratá-las com o reagente de Schiff.
      4. Contra-corar as seções usando hematoxilina por 1 min e depois diferenciá-las com álcool HCl por 30 s. Lave as seções novamente em água da torneira por 5 min para colorir o núcleo de azul.
   3. Microscopia eletrônica:
      1. Fixe as amostras em glutaraldeído a 2,5% por 3 h e depois enxágue em PBS por 3 h. Além disso, trate as amostras em ácido ósmico a 1% por 3 h e depois enxágue novamente em PBS por 3 h.
      2. Desidratar através de uma série graduada de banhos de álcool que terminam em acetona (cada passo dura cerca de 2 h no total).
      3. Infiltrar as amostras com uma mistura de propano epóxi e resina epóxi (1:1) à temperatura ambiente (RT) durante 2 h, seguida de resina epóxi pura a 37 °C durante mais 2 h.
      4. Depois disso, cure e endureça as amostras em temperaturas cada vez mais altas durante um período de 36 h antes do seccionamento. Esse processo garante que o tecido seja completamente infiltrado com a resina, que é então endurecida para permitir cortes finos para microscopia eletrônica.
      5. Corar duas vezes com acetato de uranila a 3% e chumbo-ácido, observar e fotografar as amostras por microscopia eletrônica em 15 min.
         NOTA: As configurações de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) são as seguintes: uma ampliação de 7000x no modo de alto contraste (Zoom-1 HC-1), com uma tensão de aceleração de 80.0 kV em um sistema TEM.
3. Imuno-histoquímica
   1. Desparafinação: Coloque as seções de tecido em xileno I e II por 10 min cada.
   2. Reidratação: Reidrate as seções de tecido desparafinado, colocando-as sucessivamente em etanol absoluto I e II por 3 min cada, seguido de etanol a 95%, 90%, 80% e 70% por 2 min cada.
   3. Recuperação de antígeno: Mergulhe as seções de tecido em solução tampão de citrato-ácido cítrico 0,1 M sob alta pressão por cerca de 5 min e depois resfrie até RT.
   4. Bloqueio: Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos, bloqueie incubando as seções de tecido com soro de cabra normal a 5% a aproximadamente 37 ° C por 30 min.
   5. Incubação de anticorpos primários: Adicione os anticorpos primários p-EGFR (diluído 1:200) e p-MAPK3/1 (diluído 1:200) em seções de tecido e incube durante a noite a 4 ° C dentro de uma câmara umidificada.
   6. Incubação de anticorpos secundários: Lave as seções três vezes com PBS, adicione anticorpos secundários marcados com biotina (diluídos em PBS de acordo com as instruções do fabricante) nas seções e incube a 37 ° C por 30 min.
   7. Aplique a solução de trabalho de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano nas seções de tecido a 37 ° C, seguida de lavagem três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   8. Para o desenvolvimento do DAB, incubar as seções com solução de revelação do DAB (3 min no escuro em RT), seguido de enxágue com água destilada. O DAB atua como um substrato cromógeno para a enzima peroxidase de rábano (HRP), que fica marrom após a oxidação.
   9. Use hematoxilina para contracoloração por cerca de 2 min, diferencie as seções com álcool clorídrico a 1% por 5 s e lave em água corrente para ficar azul.
   10. Desidrate colocando sucessivamente as seções em uma série de etanol de baixa a alta concentração, claro em xileno I e II, e monte as seções com goma neutra.
       NOTA: Este procedimento leva aproximadamente 18-24 h, incluindo incubação noturna de anticorpos primários.
   11. Selecione aleatoriamente três campos visuais (200x) para cada seção e analise os resultados da coloração das seções usando um software de análise de imagem. O software Image Pro Plus 6.0 foi usado seguindo as etapas abaixo.
   12. Primeiro, importe uma imagem da seção para o software.
   13. Correção de densidade: Para garantir resultados precisos, execute uma correção de densidade.
       1. Navegue até Medir > calibração > intensidade > novo padrão > opções opcionais de > de densidade > imagem. Em seguida, clique em uma área em branco da imagem para registrar o valor do plano de fundo e confirme-o clicando em OK.
   14. Configurando parâmetros de medição: Configure os parâmetros de medição para calcular a área e a densidade óptica integrada (IOD).
       1. Clique em Medir > contagem/tamanho > Meça > selecione Medidas. Selecione Área(100) e IOD e clique em OK.
       2. Vá para Opções, marque Fundo escuro na amostra, 4-Connect Pre-Filter e clique em OK.
   15. Seleção de cores: para determinar com precisão a positividade, selecione cores para detectar áreas manchadas versus áreas não manchadas.
       1. Clique em Selecionar cores > histograma baseado > HSI. Ajuste o valor H de acordo com a imagem, mantendo S inalterado e I variando entre zero e o valor de fundo. Em seguida, confirme clicando em Fechar.
       2. Coleta e cálculo de dados: Execute a coleta e o cálculo de dados clicando em Medir > Layout do > do Coletor de Dados, onde Nome, Área (Soma) e IOD (Soma) são selecionados. Em seguida, clique em Contar > Coletar agora > Lista de dados para exportar os dados para análise ou armazenamento posterior.
          NOTA: Isso resultou em uma medição semiquantitativa da expressão de proteínas em cada seção em termos de IOD/Área, que indica quanta proteína está presente em relação à área total analisada.
4. Western blotting
   1. Obtenha o tecido renal e corte-o em pedaços. Coloque essas peças em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione a solução de lise de proteína pré-resfriada (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato de sódio [SDS]) e homogeneize.
   2. Deixar no gelo durante 30 min e centrifugar a 13400 x g durante 20 min a 4 °C. Armazenar a amostra resultante num congelador a -80 °C.
   3. Use o método de Bradford para quantificar as proteínas.
      1. Prepare a solução de trabalho Coomassie Brilliant Blue misturando reagente e água destilada na proporção de 1:4.
      2. Estabeleça três grupos - branco, grupo de proteína padrão e grupo de proteína de amostra. Adicione 3 mL de solução de trabalho Coomassie Brilliant Blue a cada grupo, juntamente com solução salina fisiológica para o grupo em branco, proteína padrão para o grupo padrão e a proteína sobrenadante extraída para o grupo de amostra.
      3. Depois de deixar as misturas repousarem durante 5 min, medir os seus valores de absorvância utilizando um espectrofotómetro ultravioleta.
      4. Calcule a concentração da amostra usando esta fórmula: Concentração de proteína (mg/mL) = (Valor de absorbância da amostra/Valor de absorbância padrão do tubo) x Concentração de proteína padrão x 5.
   4. Adicione um volume igual de tampão de carga 6x a cada amostra de proteína. Ferver a 100 °C durante 5 minutos antes de os aliquotar e conservar num congelador a -20 °C até nova utilização.
   5. Realize eletroforese, blotting e bloqueio padrão.
      1. Realize eletroforese em gel de poliacrilamida SDS padrão (PAGE) usando um gel de resolução a 12%. Aplique uma tensão constante de 100 V para o gel de empilhamento e 120 V para o gel de resolução até que a frente do corante atinja o fundo do gel.
      2. Transferir proteínas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 2 h numa câmara frigorífica a 4 °C utilizando um sistema de transferência húmida.
      3. Após a transferência de proteína, bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em TBST por 1 h em RT.
   6. Dilua os anticorpos primários EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) e CAPDH (1:5.000) em TBST com 5% de BSA. Adicionar estes anticorpos primários diluídos e incubar as membranas durante a noite a 4 °C com agitação suave.
   7. Após lavar a membrana três vezes com TBST, adicionar anticorpos secundários diluídos (1:5.000), seguido de incubação por 1 h. Após o desenvolvimento da cor, realize a análise quantitativa das bandas alvo usando o software ImageJ.
5. Análise de qPCR
   1. Agrupamento: Atribua amostras aos grupos - Controle, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
   2. Extração de RNA: Realize a homogeneização do tecido e a extração de RNA, seguida de adição de clorofórmio, centrifugação e precipitação de RNA de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Precipitação e lavagem de RNA: Precipitar RNA com isopropanol e lavar com etanol.
   4. Solubilização de RNA: Seque o pellet de RNA e dissolva-o em água tratada com DEPC.
   5. Síntese de cDNA: Realize a transcrição reversa usando misturas de reação específicas de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Amplificação de qPCR: Use primers específicos para GAPDH, MAPK3, MAPK1 e EGFR para qPCR e execute a amplificação de acordo com as instruções do fabricante.
      As sequências de primers foram as seguintes:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Métodos estatísticos

1. Realize a análise usando o software apropriado (por exemplo, SPSS) e represente os dados medidos como a média ± desvio(s) padrão(is). Se os dados atenderem aos critérios de distribuição normal e homogeneidade de variância, comparar entre os grupos usando ANOVA de uma via e realizar comparações múltiplas com o método de Bonferroni.
2. Use o teste T2 para comparações múltiplas se a variância não for homogênea. Considere P < 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Seguindo o protocolo, 90 ingredientes ativos de JWSJS foram finalmente obtidos a partir da análise após triagem e desduplicação de acordo com os padrões estabelecidos de OB e DL. Estes incluíram 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, quatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum e seis tipos de compone...

Discussão

Nosso estudo empregou uma combinação de farmacologia de rede, docking molecular e modelos animais in vivo . Um passo crítico foi o estabelecimento da rede "medicamento-componente-alvo", que foi crucial para identificar os mecanismos potenciais do JWSJS no tratamento da ND, concentrando-se particularmente em sua interação com a via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1.

Durante este estudo, fizemos várias modificações, particularmente no processo d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F