大鼠颅骨缝合骨复合缺损的建立:缝合再生治疗研究的标准化模型

摘要

我们描述了大鼠颅骨缝合骨复合缺损的详细手术程序，以及对模型的短期和长期预后的研究。我们的目标是构建一个标准化的模型来开发缝合再生疗法。

摘要

大面积颅骨缺损通常与颅缝断裂同时发生，导致颅骨缺损修复和颅骨发育受损（后者发生在发育中的颅骨中）。然而，缺乏标准化模型阻碍了缝合再生疗法的研究进展，并为在不同研究中进行比较分析带来了挑战。为了解决这个问题，目前的协议描述了大鼠颅骨缝合复合缺损的详细建模过程。

该模型是通过在冠状缝合线上钻 4.5 mm × 2 mm 的全层矩形孔生成的。对大鼠实施安乐死，并在术后第 0 天、第 2 周、第 6 周和第 12 周收获颅骨样本。手术后立即采集的样本的 μCT 结果证实了缝合骨复合缺损的成功建立，涉及去除冠状缝合和邻近的骨组织。

术后^第 6 周和第 12 周的数据表明缺损有自然愈合的趋势。组织学染色通过显示缺损中心矿化纤维增加和新骨进一步验证了这一趋势。这些发现表明颅骨缺损后随着时间的推移进行性缝合融合，强调了治疗干预对缝合再生的重要性。我们预计该协议将促进缝合再生疗法的发展，为颅骨缺损的功能恢复和减少与缝合损失相关的不良后果提供新的见解。

引言

颅缝是颅骨之间致密的纤维连接，充当关节以促进颅骨的轻微运动，并为承受压力的大脑提供保护垫¹。近年来，越来越多的研究强调了颅缝在颅骨发育、颅面稳态和固有的骨修复潜力中的关键作用 2,3,4,5,6,7,8。在生长发育期间，颅缝是颅骨的主要生长中心⁴。缝合线两侧的成骨前部发生新骨形成，而缝合线内的细胞保持未分化的间充质状态，确保颅骨扩张与大脑生长的平衡¹。此时颅缝的丢失导致颅骨和大脑的生长之间存在差异，导致脑损伤、脑积水、颅内压升高和认知功能障碍等严重问题 ^3,9。

此外，颅缝在决定颅骨缺损的预后方面起着至关重要的作用 ^5,7,10。颅骨表面的再生电位分布不均匀，与非缝合区域相比，颅缝显示出非常优越的能力^10,11。一项研究表明，颅骨缺损愈合的速度与颅缝与损伤部位之间的距离成反比¹⁰。具体来说，冠状缝和矢状缝的移除导致顶骨缺损不愈合⁷，强调了颅骨缺损缝合再生的必要性。然而，目前研究的重点主要是颅骨结构的恢复，而忽视了缝合间充质的再生。

关于缝合再生的进步，已经观察到含缝合线的骨瓣、间充质干细胞 （MSC） 和人造生物材料的移植有希望的结果。当有缝合线的骨瓣移植到颅骨缺损中时，它们成功地整合和愈合，而那些没有缝合的骨瓣则表现出不愈合并且无法形成骨膜、硬脑膜或骨细胞⁵。同样，来自骨髓的 MSC 植入矢状缝合骨复合缺损中促进了缝合样间隙的形成¹²。值得注意的是，最近的一项研究强调了使用 Gli1 ⁺ MSC 实现缝合再生，从而可以控制颅内压、矫正颅骨畸形和增强神经认知功能¹³。随着再生医学和生物医学工程的发展，研究人员越来越关注组织工程生物材料，因为它们具有适应性和可定制的特性¹⁴。值得注意的是，聚四氟乙烯膜已被证明可有效同时重建颅骨和缝合间充质^15,16。

然而，颅面研究缺乏探索缝合间充质再生疗法的既定模型，这与修复骨骼、皮肤、软骨和肌肉等其他组织的相对成熟的模型不同¹⁷。缺乏标准化模型限制了缝合再生疗法的研究，并使得在不同研究中进行比较分析变得具有挑战性。因此，我们的研究建立了一个实用且可重复的大鼠颅骨缝合骨复合缺陷。通过这种方法，我们旨在为颅缝重建开发适当的临床干预措施，为颅骨缺损的功能修复和减少缝合损失造成的不良结果提供新的视角。

研究方案

本研究中的所有动物程序均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会 （WCHSIRB-D-2021-597） 审查和批准。总共 12 只 （四个时间点各 3 只大鼠） Sprague-Dawley （SD） 大鼠 （雄性，300 g，8 周龄） 从商业来源获得（参见 材料表）。

1. 术前准备

1. 手术项目
   1. 准备 图 1A 所示的手术器械，包括弯曲的镊子、一次性无菌手术刀、骨膜电梯、冲洗针、棉球、低速手机、手术电机、牙科低速圆针（图 1B，直径分别为 1.2 毫米和 0.8 毫米）、持针器、3-0 单丝缝合线和直剪刀。
2. 灭菌和消毒
   1. 提前通过蒸汽灭菌（125-135°C，20-25 分钟）对器械进行消毒。
   2. 使用乙醇对热敏性医疗设备（如电动剃须刀）进行消毒。
   3. 使用无菌医用无纺布覆盖手术平台，并用 75% 乙醇对周围环境进行消毒。
3. 麻醉
   1. 准备动物进行手术，适应期为 1 周。
   2. 手术前 20 分钟腹膜内注射甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 和氯胺酮 （100 mg/kg） 进行麻醉，或使用任何合适的麻醉方案实现全身麻醉。
      注意:大鼠腹膜内给药的氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉混合物通常在 10-15 分钟内起效，注射后约 35-40 分钟达到麻醉峰值。为了防止麻醉期间体温过低，最好将大鼠放在加热垫上。
   3. 术前皮下注射 5 mg/kg 的卡洛芬以提供镇痛作用。
   4. 使用"脚趾捏法"来确定大鼠是否有意识和反应。

2. 手术过程

1. 整地
   1. 将大鼠置于俯卧位，头部自然垂直伸展，无需特殊设备或约束装置来保持这种姿势（图 2A）。
   2. 将兽药膏（即凡士林）涂抹在大鼠的眼睛上，以防止角膜干燥。
   3. 用电动剃须刀去除鼻梁和颈椎关节之间头皮上的毛发（图 2B）。用 2% 碘伏溶液和 75% 乙醇以从中心辐射的圆周运动对手术区域进行消毒。使用手术单覆盖动物的背部和切口周围的皮毛。
2. 手术部位开放
   1. 从鼻骨的中点开始，用一次性手术刀沿着颅骨中线做一个 2 cm 的纵向皮肤切口（图 2C）。
   2. 用手术刀做一个中线骨膜切口，反映皮肤层的初始点和范围（图 2D）。然后，用骨膜升降器轻轻提起切口两侧的骨膜（图 2E1），露出顶骨、额骨和冠状缝合线（图 2E2）。
      注意:切开骨膜时，注意不要伤害颅缝，以防止切割时出血过多。冠状缝线的充分暴露对于以下程序至关重要。
   3. 用生理盐水冲洗伤口，并用棉球擦干手术区域。
3. 缝骨复合缺损模型的建立
   1. 通过旋转旋钮将手术电机设置为 35,000 rpm（图 1A，黄色箭头），然后打开开关（图 1A，白色箭头）。
   2. 从冠状缝合线上的任何一点开始，使用直径为 1.2 毫米的圆车针施加垂直力，直到感觉到突破感。
      注意:推荐冠状缝合线的中点（ 图 2E2 中由黄色箭头表示）作为穿透的起点。研磨时，牙钻应保持垂直于颅面。小心不要在穿透整个颅骨厚度后继续钻孔，以防止对大鼠造成任何进一步的伤害，包括脑损伤或脑出血。
   3. 从穿透点开始，沿冠状缝合线横向移动车针，形成一个约 4 毫米长的定位槽（图 2F1）。用定位槽两侧的车刺去除骨组织，最初形成矩形全层缺损（图 2F2）。
   4. 使用直径为 0.8 mm 的圆针来细化细节（图 2G1），包括直角磨削和缺陷边缘的平滑，最终获得 2 mm 宽和 4.5 mm 长的标准矩形缺陷（图 2G2）。
      注意:为了在 300 g SD 大鼠中实现冠状缝的完全去除，同时保留矢状缝和额缝，最大可行缺损长度约为 4.5 毫米。考虑到冠状缝合线在前后方向的宽度（补充图 S1），缺损宽度设置为 2 毫米。
   5. 在冠状缝合线的左半部分和右半部分创建两个缺损以进行自我比较。
   6. 在钻孔过程中保持盐水溶液的持续冲洗，以防止对颅骨和大脑的热损伤。同时，使用棉球擦干操作区域。
4. 样品尺寸验证
   1. 使用游标卡尺（图 2H1、H2）定期验证缺陷的长度和宽度，以确保所有样品的一致性。
5. 手术部位闭合
   1. 用 3-0 根单丝缝合线闭合皮肤（图 2I）。
6. 术后即刻 体内 显微计算机断层扫描 （μCT）
   1. 如果可行，手术后立即对所有大鼠进行 体内 μCT 扫描，以确认外科手术的成功并监测每个人的缺陷恢复趋势。

3. 术后护理

1. 根据动物护理方案，手术后根据需要施用既定的镇痛药，例如卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）。
2. 将大鼠转移到恒定加热垫 （37 °C） 中进行术后恢复。
3. 一旦完全清醒，将大鼠转移到装有干净床上用品的笼子中。
   注意:术后持续监测大鼠。在他们能够保持胸骨卧位之前，不要让他们无人看管。将手术大鼠与他人隔离，直到完全恢复。
4. 进行镇痛管理和术后监测 24 小时，然后在术后第一周进行每日评估。此后每周至少监测大鼠 1-2 次。

4. 样本采集和数据分析

1. 样品制备
   1. 在术后第 0 天、第 2 周、第 6 周和第 12 周收集颅骨标本。使用 CO₂ 吸入对大鼠实施安乐死。
   2. 在进一步分析之前，将样品在 4 °C 的 4% 多聚甲醛中固定 24 小时。
2. μCT 评估
   1. 对术后第 0 天、第 6 周、第 12 周的颅骨进行 μCT 扫描，扫描参数如下: X 射线管电位，70 kVp;X 射线强度，0.2 mA;过滤器，AL 0.5 mm;积分时间，1 x 300 ms;体素大小，10 μm。
   2. 使用图像处理软件获得 3D 重建和横截面图像（参见 材料表）。
   3. 测量残余缺陷体积并使用相应的软件进行统计分析（参见 材料表）。
3. 组织学染色
   1. 在 4 °C 下，在 12% （w/v） 乙二胺四乙酸溶液 （pH = 7.2） 中使颅骨脱钙 6 周。
      注:每 3 天更换一次溶液，对样品进行脱钙。使用摇床来加快该过程。当 25 G 针头轻松穿透样品时，指示完成。
   2. 使用标准方案¹⁸ 进行脱水、石蜡包埋和制备 6 μm 切片。
   3. 按照试剂盒方案¹⁸ 使用苏木精和伊红 （H&E） 和 Masson 三色染色进行组织学分析。

结果

在这项研究中，通过在冠状缝上钻一个 4.5 mm x 2 mm 的矩形孔来建立大鼠颅骨缝合骨复合缺损。手术示意图和研究流程图如图 3 所示。术后 0 天样本（即手术后立即采集的样本）的 3D 图像和横截面视图证实了全层颅骨缺损的成功创建，涉及冠状缝合线以及两端相邻骨骼结构的完全移除（图 4A）。术后 6 周的 μCT 图像和相应的统?...

讨论

传统的颅骨缺损模型，无论是否涉及颅缝，都主要集中在硬组织的修复上，往往忽视缝合间充质的重要再生^19,20。在缝合再生研究中，以前的模型，如 Mardas 等人 ^15,16 的模型，利用环钻在大鼠的矢状缝合线上产生 5 毫米的圆形缺损，导致大量硬组织损失，从而偏离了缝合再生的主要目...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
2% Iodophor solution	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
75% Ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	None
Cotton swabs	Lakong Medical Devices Co.,	None
Curved forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Dataviewer and Ctan software for residual defect volume assessments	Bruker	None
Dental low-speed round burs	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012 RA1-008
Disposable sterile scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None
Disposable syringes (22 G)	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	SB1-089(IX)
Electric shaver	JASE	BM320210
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340GR500
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Irrigation needle (23 G)	Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.	None
Low-speed handpiece	Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.	None
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical non-woven fabrics	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	None
Micro-computed tomography (µCT)	Scanco Medical AG	µCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional images	Materialise	None
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Periosteal elevator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Saline solution	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Scanco medical visualizer software for 3D image reconstruction	Scanco Medical AG	None
SPSS Statistics 20.0 for statistical analysis	IBM	None
Sprague-Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None
Straight Scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Surgical Motor	MARATHON	N3-140232
Surgical sutures (3-0 monofilament)	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None