El establecimiento de defectos compuestos óseo y de sutura de calvario en ratas: un modelo estandarizado para la investigación de la terapia regenerativa de sutura

Resumen

Describimos los procedimientos quirúrgicos detallados de los defectos del compuesto óseo y sutura de calvario en ratas, junto con las investigaciones sobre los pronósticos a corto y largo plazo del modelo. Nuestro objetivo es construir un modelo estandarizado para el desarrollo de terapias regenerativas de sutura.

Resumen

Los defectos de la pantorrilla a gran escala a menudo coinciden con la ruptura de la sutura craneal, lo que lleva a deficiencias en la restauración del defecto de la pantorrilla y el desarrollo del cráneo (este último ocurre en el cráneo en desarrollo). Sin embargo, la falta de un modelo estandarizado dificulta el progreso en la investigación de las terapias regenerativas con sutura y plantea desafíos para realizar análisis comparativos entre distintos estudios. Para abordar este problema, el protocolo actual describe el proceso de modelado detallado de los defectos compuestos óseos de sutura de calvario en ratas.

El modelo se generó perforando agujeros rectangulares de espesor completo que miden 4,5 mm × 2 mm a través de las suturas coronales. Las ratas fueron sacrificadas y las muestras de cráneo se recolectaron postoperatoriamente en el día 0, semana 2, semana 6 y semana 12. Los resultados de la μCT de las muestras recogidas inmediatamente después de la cirugía confirmaron el establecimiento exitoso del defecto compuesto de sutura ósea, que implicó la extirpación de la sutura coronal y los tejidos óseos adyacentes.

Los datos de la^6ª y^12ª semanas postoperatorias demostraron una tendencia natural a la cicatrización del defecto. La tinción histológica validó aún más esta tendencia al mostrar un aumento de las fibras mineralizadas y hueso nuevo en el centro del defecto. Estos hallazgos indican una fusión progresiva de la sutura a lo largo del tiempo después de los defectos de la pantorrilla, lo que subraya la importancia de las intervenciones terapéuticas para la regeneración de la sutura. Anticipamos que este protocolo facilitará el desarrollo de terapias regenerativas de sutura, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la restauración funcional de los defectos de la pantorrilla y reduciendo los resultados adversos asociados con la pérdida de sutura.

Introducción

Las suturas craneales son conexiones fibrosas densas entre los huesos craneales, que actúan como articulaciones para facilitar un ligero movimiento del cráneo y proporcionan un colchón protector para el cerebro^{bajo presión.} En los últimos años, el aumento de la investigación ha puesto de manifiesto el papel fundamental de las suturas craneales en el desarrollo del cráneo, la homeostasis craneofacial y el potencial osteoreparador inherente 2,3,4,5,6,7,8. Durante los períodos de crecimiento y desarrollo, las suturas craneales actúan como los principales centros de crecimiento en el cráneo⁴. La formación de hueso nuevo ocurre en los frentes osteogénicos a ambos lados de las suturas, mientras que las células dentro de las suturas mantienen un estado mesenquimal indiferenciado, lo que garantiza una expansión equilibrada del cráneo junto con el crecimiento del cerebro¹. La pérdida de suturas craneales en este momento resulta en una discrepancia entre el crecimiento del cráneo y el cerebro, lo que lleva a problemas graves como lesiones cerebrales, hidrocefalia, aumento de la presión intracraneal y disfunción cognitiva ^3,9.

Además, las suturas craneales juegan un papel crucial en la determinación del pronóstico de los defectos de la pantorrilla ^5,7,10. El potencial regenerativo a través de la superficie de la pantorrilla está distribuido de manera desigual, con suturas craneales que muestran capacidades notablemente superiores en comparación con las regiones sin sutura^10,11. Un estudio indica que la velocidad de cicatrización del defecto de la pantorrilla se correlaciona inversamente con la distancia entre la sutura craneal y el sitio de la lesión¹⁰. Específicamente, la extirpación de las suturas coronales y sagitales conduce a la no cicatrización de los defectos del hueso parietal⁷, enfatizando la necesidad de la regeneración de la sutura en los defectos del pantorrilla. Sin embargo, los estudios actuales se centran principalmente en la restauración de la estructura ósea craneal, descuidando la regeneración del mesénquima de sutura.

En cuanto a los avances en la regeneración de suturas, se han observado resultados prometedores con el trasplante de colgajos óseos que contienen suturas, células madre mesenquimales (MSC) y biomateriales artificiales. Cuando los colgajos óseos con suturas se trasplantaron a defectos del pantorrilla, se integraron y cicatrizaron con éxito, en contraste con aquellos sin suturas que mostraron falta de artrosis e incapacidad para formar periostio, duramadre u osteocitos⁵. Del mismo modo, la implantación de MSCs derivadas de la médula ósea en defectos sagitales de sutura ósea facilitó la formación de espacios similares a suturas¹². Cabe destacar que un estudio reciente destacó la realización de la regeneración de suturas con MSC Gli1⁺, lo que permite el control de la presión intracraneal, la corrección de la deformidad del cráneo y la mejora de la función neurocognitiva¹³. A medida que la medicina regenerativa y la ingeniería biomédica se desarrollan, los investigadores se centran cada vez más en los biomateriales de ingeniería de tejidos debido a sus características adaptables y personalizables¹⁴. En particular, las membranas de politetrafluoroetileno han demostrado ser efectivas en la reconstrucción del hueso craneal y el mesénquima de sutura simultáneamente^15,16.

Sin embargo, la investigación craneofacial carece de modelos establecidos para explorar las terapias regenerativas mesenquimales de sutura, a diferencia de los modelos relativamente maduros en la reparación de otros tejidos como el hueso, la piel, el cartílago y los músculos¹⁷. La ausencia de un modelo estandarizado restringe el estudio de las terapias regenerativas con sutura y dificulta la realización de análisis comparativos entre diferentes estudios. Por lo tanto, nuestro estudio estableció un defecto compuesto óseo de sutura calvarial de rata practicable y reproducible. A través de este método, nuestro objetivo es desarrollar intervenciones clínicas adecuadas para la reconstrucción de la sutura craneal, ofreciendo perspectivas novedosas sobre la reparación funcional de los defectos de la pantorrilla y disminuyendo los resultados desfavorables resultantes de la pérdida de sutura.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales de este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Un total de 12 ratas Sprague-Dawley (SD) (machos, 300 g, 8 semanas de edad) (3 ratas en cada uno de los cuatro puntos temporales) se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación prequirúrgica

1. Artículos quirúrgicos
   1. Prepare los instrumentos quirúrgicos que se muestran en la Figura 1A, incluyendo pinzas curvas, un bisturí estéril desechable, un elevador perióstico, una aguja de irrigación, bolas de algodón, una pieza de mano de baja velocidad, un motor quirúrgico, fresas redondas dentales de baja velocidad (Figura 1B, 1,2 mm y 0,8 mm de diámetro, respectivamente), un soporte para agujas, suturas de monofilamento 3-0 y una tijera recta.
2. Esterilización y desinfección
   1. Esterilice los instrumentos mediante esterilización por vapor (125-135 °C, 20-25 min) con anticipación.
   2. Use etanol para esterilizar equipos médicos sensibles al calor, como máquinas de afeitar eléctricas.
   3. Utilice telas médicas no tejidas estériles para cubrir la plataforma de operación y desinfecte el entorno circundante con etanol al 75%.
3. Anestesia
   1. Prepare a los animales para la cirugía con un período de aclimatación de 1 semana.
   2. Inyecte a las ratas por vía intraperitoneal xilacina (10 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) 20 minutos antes de la cirugía para anestesia o utilice cualquier protocolo anestésico adecuado para lograr la anestesia general.
      NOTA: El cóctel anestésico de ketamina-xilacina administrado por vía intraperitoneal en ratas suele hacer efecto en 10-15 minutos, alcanzando el pico de anestesia alrededor de 35-40 minutos después de la inyección. Para prevenir la hipotermia durante la anestesia, es mejor colocar a las ratas sobre una almohadilla térmica.
   3. Administrar una inyección subcutánea preoperatoria de carprofeno a 5 mg/kg para proporcionar analgesia.
   4. Use el "método de pellizcar los dedos de los pies" para determinar si las ratas están conscientes y responden o no.

2. Proceso quirúrgico

1. Preparación del sitio
   1. Coloque a la rata en posición prona con la cabeza extendida naturalmente verticalmente, sin necesidad de dispositivos especiales o restricciones para mantener esta postura (Figura 2A).
   2. Aplique ungüento veterinario, es decir, vaselina, en los ojos de la rata para prevenir la sequedad de la córnea.
   3. Retire el vello del cuero cabelludo entre el puente nasal y la articulación de la columna cervical con una afeitadora eléctrica (Figura 2B). Desinfecte el área quirúrgica con movimientos circulares irradiando desde el centro con una solución de yodóforo al 2% seguida de etanol al 75%. Emplea un paño quirúrgico para cubrir el dorso del animal y el pelaje que rodea la incisión.
2. Apertura del centro quirúrgico
   1. Comenzando desde el punto medio del hueso nasal, haga una incisión cutánea longitudinal de 2 cm con un bisturí desechable siguiendo la línea media del cráneo (Figura 2C).
   2. Realice una incisión perióstica en la línea media reflejando el punto inicial y la extensión de la capa de piel con un bisturí (Figura 2D). Luego, levante suavemente el periostio a ambos lados de la incisión con un elevador perióstico (Figura 2E1) para exponer los huesos parietales, los huesos frontales y las suturas coronales (Figura 2E2).
      NOTA: Al incidir el periostio, tenga cuidado de no dañar las suturas craneales para evitar un sangrado excesivo al cortar. La exposición adecuada de la sutura coronal es de suma importancia para los siguientes procedimientos.
   3. Enjuague la herida con solución salina y seque el área quirúrgica con bolas de algodón.
3. Establecimiento del modelo de defecto compuesto óseo y sutura
   1. Ajuste el motor quirúrgico a 35,000 rpm girando la perilla (Figura 1A, flecha amarilla), luego encienda el interruptor (Figura 1A, flecha blanca).
   2. Comenzando desde cualquier punto de la sutura coronal, aplique fuerza vertical con una fresa redonda de 1,2 mm de diámetro hasta que se sienta una sensación de avance.
      NOTA: Se recomienda el punto medio de la sutura coronal (indicado por flechas amarillas en la Figura 2E2) como punto de partida para la penetración. Al moler, los taladros dentales deben mantenerse perpendiculares a la superficie craneal. Tenga cuidado de no continuar perforando después de penetrar todo el grosor del cráneo para evitar cualquier daño adicional a las ratas, incluido el daño cerebral o la hemorragia cerebral.
   3. Desde el punto de penetración, mueva la fresa lateralmente a lo largo de la sutura coronal para crear una ranura de posicionamiento de aproximadamente 4 mm de largo (Figura 2F1). Retire el tejido óseo con la fresa a ambos lados de la ranura de posicionamiento para formar inicialmente un defecto rectangular de espesor completo (Figura 2F2).
   4. Emplee una fresa redonda de 0,8 mm de diámetro para refinar los detalles (Figura 2G1), lo que implica el rectificado de ángulos rectos y el suavizado de los márgenes de defectos, logrando finalmente un defecto rectangular estándar que mide 2 mm de ancho y 4,5 mm de largo (Figura 2G2).
      NOTA: Para lograr la extirpación completa de la sutura coronal mientras se preservan las suturas sagital y frontal en ratas SD de 300 g, la longitud máxima posible del defecto es de aproximadamente 4,5 mm. Considerando el ancho de la sutura coronal en la dirección antero-posterior (Figura Suplementaria S1), el ancho del defecto se estableció en 2 mm.
   5. Cree dos defectos en las mitades izquierda y derecha de la sutura coronal para la autocomparación.
   6. Mantenga la irrigación continua de la solución salina durante el procedimiento de perforación para protegerse contra lesiones térmicas en el cráneo y el cerebro. Mientras tanto, use bolas de algodón para secar el área de operación.
4. Verificación de la dimensión de la muestra
   1. Verifique regularmente la longitud y el ancho de los defectos utilizando un calibrador vernier (Figura 2H1, H2) para garantizar la consistencia en todas las muestras.
5. Cierre del sitio quirúrgico
   1. Cierre la piel con suturas de monofilamento 3-0 (Figura 2I).
6. Postoperatorio inmediato microtomografía computarizada in vivo (μCT)
   1. Si es posible, se deben realizar tomografías computarizadas in vivo en todas las ratas inmediatamente después de la cirugía para confirmar el éxito del procedimiento quirúrgico y monitorear las tendencias de recuperación de defectos para cada individuo.

3. Cuidados postquirúrgicos

1. De acuerdo con los protocolos de cuidado animal, administrar analgésicos establecidos según sea necesario después de la cirugía, por ejemplo, carprofeno (5 mg/kg, uso subcutáneo).
2. Transfiera las ratas a una almohadilla térmica constante (37 °C) para la recuperación postoperatoria.
3. Una vez que estén completamente conscientes, reubique a las ratas en su jaula de alojamiento que contenga ropa de cama limpia.
   NOTA: Monitoree continuamente a las ratas después de la cirugía. No los deje desatendidos hasta que puedan mantener la decúbito esternal. Mantenga a las ratas operadas aisladas de las demás hasta que se recuperen por completo.
4. Realizar el manejo de la analgesia y el seguimiento postoperatorio durante 24 h, seguido de evaluaciones diarias durante la primera semana después de la cirugía. A partir de entonces, monitoree a las ratas al menos 1-2 veces por semana.

4. Recogida de muestras y análisis de datos

1. Preparación de la muestra
   1. Recoja muestras de cráneo en el día postoperatorio 0, semana 2, semana 6 y semana 12. Sacrificar a las ratas mediante inhalación de CO₂ .
   2. Fijar las muestras en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 h antes de continuar con el análisis.
2. Evaluación de μCT
   1. Realizar tomografías computarizadas en huesos craneales del postoperatorio día 0, semana 6, semana 12 con los siguientes parámetros de exploración: potencial del tubo de rayos X, 70 kVp; intensidad de rayos X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tiempo de integración, 1 x 300 ms; y tamaño de vóxel, 10 μm.
   2. Obtenga imágenes de reconstrucción 3D y de corte transversal con software de procesamiento de imágenes (ver Tabla de Materiales).
   3. Mida el volumen de defectos residuales y realice análisis estadísticos con el software correspondiente (consulte la tabla de materiales).
3. Tinción histológica
   1. Descalcificar los huesos craneales en una solución de ácido etilendiaminotetraacético al 12% (p/v) (pH = 7,2) a 4 °C durante 6 semanas.
      NOTA: Descalcifique las muestras con cambios de solución cada 3 días. Utilice una coctelera para acelerar el proceso. La finalización está indicada cuando una aguja de 25 G penetra fácilmente en la muestra.
   2. Proceda con la deshidratación, la inclusión en parafina y la preparación de secciones de 6 μm utilizando protocolos estándar¹⁸.
   3. Realizar análisis histológicos utilizando hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricrómica de Masson siguiendo el protocolo¹⁸ del kit.

Resultados

En este estudio, el defecto compuesto de sutura calvarial de rata y hueso se estableció mediante la perforación de un orificio rectangular de 4,5 mm x 2 mm a través de la sutura coronal. La ilustración esquemática quirúrgica y el diagrama de flujo de la investigación se muestran en la Figura 3. La imagen 3D y la vista transversal de las muestras postoperatorias de 0 días, es decir, las muestras recogidas inmediatamente después de la cirugía, confir...

Discusión

Los modelos convencionales de defectos de la pantorrilla, ya sea que involucren suturas craneales o no, se concentran principalmente en la reparación del tejido duro, a menudo descuidando la regeneración vital del mesénquima de sutura^19,20. En la investigación de la regeneración de suturas, los modelos anteriores, como los de Mardas et ^al.15,16, que utilizaban una fr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
2% Iodophor solution	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
75% Ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	None
Cotton swabs	Lakong Medical Devices Co.,	None
Curved forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Dataviewer and Ctan software for residual defect volume assessments	Bruker	None
Dental low-speed round burs	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012 RA1-008
Disposable sterile scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None
Disposable syringes (22 G)	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	SB1-089(IX)
Electric shaver	JASE	BM320210
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340GR500
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Irrigation needle (23 G)	Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.	None
Low-speed handpiece	Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.	None
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical non-woven fabrics	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	None
Micro-computed tomography (µCT)	Scanco Medical AG	µCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional images	Materialise	None
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Periosteal elevator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Saline solution	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Scanco medical visualizer software for 3D image reconstruction	Scanco Medical AG	None
SPSS Statistics 20.0 for statistical analysis	IBM	None
Sprague-Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None
Straight Scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Surgical Motor	MARATHON	N3-140232
Surgical sutures (3-0 monofilament)	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None