L'istituzione di difetti compositi di sutura calvariare-osso nei ratti: un modello standardizzato per l'indagine sulla terapia rigenerativa della sutura

Riepilogo

Descriviamo le procedure chirurgiche dettagliate dei difetti compositi della sutura calvaria-osso nei ratti, insieme alle indagini sulle prognosi a breve e lungo termine del modello. Il nostro obiettivo è quello di costruire un modello standardizzato per lo sviluppo di terapie rigenerative di sutura.

Abstract

I difetti calvari su larga scala spesso coincidono con l'interruzione della sutura cranica, portando a menomazioni nel ripristino del difetto calvario e nello sviluppo del cranio (quest'ultimo si verifica nel cranio in via di sviluppo). Tuttavia, la mancanza di un modello standardizzato ostacola i progressi nello studio delle terapie rigenerative di sutura e pone sfide per la conduzione di analisi comparative tra studi distinti. Per risolvere questo problema, l'attuale protocollo descrive il processo di modellazione dettagliata dei difetti compositi della sutura calvariale-osso nei ratti.

Il modello è stato generato praticando fori rettangolari a tutto spessore che misurano 4,5 mm × 2 mm attraverso le suture coronali. I ratti sono stati soppressi e i campioni di cranio sono stati raccolti dopo l'intervento al giorno 0, alla settimana 2, alla settimana 6 e alla settimana 12. I risultati della μCT dei campioni raccolti immediatamente dopo l'intervento chirurgico hanno confermato il successo dell'instaurazione del difetto composito sutura-osso, che comporta la rimozione della sutura coronale e dei tessuti ossei adiacenti.

I dati della 6a^{e 12a} settimana postoperatoria hanno dimostrato una naturale tendenza alla guarigione del difetto a chiudersi. La colorazione istologica ha ulteriormente convalidato questa tendenza mostrando un aumento delle fibre mineralizzate e nuovo osso al centro del difetto. Questi risultati indicano una fusione progressiva della sutura nel tempo a seguito di difetti calvariali, sottolineando l'importanza degli interventi terapeutici per la rigenerazione della sutura. Prevediamo che questo protocollo faciliterà lo sviluppo di terapie rigenerative di sutura, offrendo nuove intuizioni sul ripristino funzionale dei difetti calvari e riducendo gli esiti avversi associati alla perdita di sutura.

Introduzione

Le suture craniche sono connessioni fibrose dense tra le ossa craniche, che agiscono come articolazioni per facilitare il leggero movimento del cranio e forniscono un cuscino protettivo per il cervello sotto pressione¹. Negli ultimi anni, l'aumento della ricerca ha evidenziato il ruolo fondamentale delle suture craniche nello sviluppo del cranio, nell'omeostasi craniofacciale e nel potenziale osteo-riparativo intrinseco 2,3,4,5,6,7,8. Durante i periodi di crescita e sviluppo, le suture craniche fungono da principali centri di crescita nel cranio⁴. La formazione di nuovo osso si verifica sui fronti osteogenici su entrambi i lati delle suture, mentre le cellule all'interno delle suture mantengono uno stato mesenchimale indifferenziato, garantendo un'espansione equilibrata del cranio insieme alla crescita del cervello¹. La perdita di suture craniche in questo momento si traduce in una discrepanza tra la crescita del cranio e del cervello, portando a gravi problemi come lesioni cerebrali, idrocefalo, aumento della pressione intracranica e disfunzione cognitiva ^3,9.

Inoltre, le suture craniche svolgono un ruolo cruciale nel determinare la prognosi dei difetti calvariari ^5,7,10. Il potenziale rigenerativo su tutta la superficie calvariale è distribuito in modo non uniforme, con suture craniche che mostrano capacità notevolmente superiori rispetto alle regioni non di sutura^10,11. Uno studio indica che la velocità di guarigione del difetto calvariale è inversamente correlata alla distanza tra la sutura cranica e il sito della lesione¹⁰. In particolare, la rimozione delle suture coronali e sagittali porta alla mancata guarigione dei difetti ossei parietali⁷, sottolineando la necessità della rigenerazione della sutura nei difetti calvariali. Tuttavia, l'attenzione degli studi attuali è prevalentemente sul ripristino della struttura ossea cranica trascurando la rigenerazione del mesenchima di sutura.

Per quanto riguarda i progressi nella rigenerazione della sutura, sono stati osservati risultati promettenti con il trapianto di lembi ossei contenenti sutura, cellule staminali mesenchimali (MSC) e biomateriali artificiali. Quando i lembi ossei con suture sono stati trapiantati in difetti calvariali, si sono integrati e guariti con successo, a differenza di quelli senza suture che mostravano non unione e incapacità di formare periostio, dura madre o osteociti⁵. Allo stesso modo, l'impianto di MSC derivate dal midollo osseo in difetti compositi di sutura sagittale e ossea ha facilitato la formazione di lacune simili a suture¹². Da notare, uno studio recente ha evidenziato la realizzazione della rigenerazione della sutura con le MSC Gli1⁺, che consentono il controllo della pressione intracranica, la correzione delle deformità del cranio e una migliore funzione neurocognitiva¹³. Con lo sviluppo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria biomedica, i ricercatori si concentrano sempre più sui biomateriali di ingegneria tissutale grazie alle loro caratteristiche adattabili e personalizzabili¹⁴. In particolare, le membrane in politetrafluoroetilene si sono dimostrate efficaci nella ricostruzione simultanea dell'osso cranico e del mesenchima di sutura^15,16.

Tuttavia, la ricerca craniofacciale manca di modelli consolidati per esplorare le terapie rigenerative mesenchimali di sutura, a differenza dei modelli relativamente maturi nella riparazione di altri tessuti come ossa, pelle, cartilagine e muscoli¹⁷. L'assenza di un modello standardizzato limita lo studio delle terapie rigenerative di sutura e rende difficile l'esecuzione di analisi comparative tra diversi studi. Pertanto, il nostro studio ha stabilito un difetto pratico e riproducibile del composito sutura calvario-osso di ratto. Attraverso questa metodica, miriamo a sviluppare interventi clinici appropriati per la ricostruzione della sutura cranica, offrendo nuove prospettive sulla riparazione funzionale dei difetti calvari e diminuendo gli esiti sfavorevoli derivanti dalla perdita di sutura.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Un totale di 12 (3 ratti in ciascuno dei quattro punti temporali) ratti Sprague-Dawley (SD) (maschi, 300 g, 8 settimane) sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione prechirurgica

1. Articoli chirurgici
   1. Preparare gli strumenti chirurgici mostrati nella Figura 1A, tra cui una pinza curva, un bisturi sterile monouso, un elevatore periostale, un ago per l'irrigazione, batuffoli di cotone, un manipolo a bassa velocità, un motore chirurgico, frese rotonde dentali a bassa velocità (Figura 1B, rispettivamente 1,2 mm e 0,8 mm di diametro), un portaago, suture monofilamento 3-0 e una forbice diritta.
2. Sterilizzazione e disinfezione
   1. Sterilizzare preventivamente gli strumenti mediante sterilizzazione a vapore (125-135 °C, 20-25 min).
   2. Usa l'etanolo per sterilizzare apparecchiature mediche sensibili al calore, come i rasoi elettrici.
   3. Utilizzare tessuti non tessuti medicali sterili per coprire la piattaforma operativa e disinfettare l'ambiente circostante con etanolo al 75%.
3. Anestesia
   1. Preparare gli animali per l'intervento chirurgico con un periodo di acclimatazione di 1 settimana.
   2. Iniettare nei ratti per via intraperitoneale xilazina (10 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg) 20 minuti prima dell'intervento chirurgico per l'anestesia o utilizzare qualsiasi protocollo anestetico adatto per ottenere l'anestesia generale.
      NOTA: Il cocktail anestetico ketamina-xilazina somministrato per via intraperitoneale nei ratti ha tipicamente effetto entro 10-15 minuti, raggiungendo il picco di anestesia circa 35-40 minuti dopo l'iniezione. Per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia, è meglio posizionare i ratti su un termoforo.
   3. Somministrare un'iniezione sottocutanea preoperatoria di carprofene a 5 mg/kg per fornire analgesia.
   4. Usa il "metodo del pizzicamento delle dita" per determinare se i ratti sono coscienti e reattivi.

2. Processo chirurgico

1. Preparazione del sito
   1. Posizionare il ratto in posizione prona con la testa che si estende naturalmente verticalmente, senza richiedere dispositivi speciali o restrizioni per mantenere questa postura (Figura 2A).
   2. Applicare un unguento veterinario, cioè vaselina, sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza corneale.
   3. Rimuovere i peli dal cuoio capelluto tra il ponte nasale e l'articolazione del rachide cervicale con un rasoio elettrico (Figura 2B). Disinfettare l'area chirurgica con movimenti circolari irradiandosi dal centro con una soluzione di iodoforo al 2% seguita da etanolo al 75%. Utilizzare un telo chirurgico per coprire il dorso dell'animale e il pelo che circonda l'incisione.
2. Apertura del sito chirurgico
   1. Partendo dal punto medio dell'osso nasale, praticare un'incisione cutanea longitudinale di 2 cm con un bisturi monouso seguendo la linea mediana del cranio (Figura 2C).
   2. Praticare un'incisione periostale sulla linea mediana che rispecchi il punto iniziale e l'estensione dello strato cutaneo con un bisturi (Figura 2D). Quindi, sollevare delicatamente il periostio su entrambi i lati dell'incisione con un elevatore periostale (Figura 2E1) per esporre le ossa parietali, le ossa frontali e le suture coronali (Figura 2E2).
      NOTA: Quando si incide il periostio, fare attenzione a non danneggiare le suture craniche per evitare un sanguinamento eccessivo durante il taglio. Un'adeguata esposizione della sutura coronale è della massima importanza per le seguenti procedure.
   3. Sciacquare la ferita con soluzione salina e asciugare l'area chirurgica con batuffoli di cotone.
3. Istituzione del modello di difetto composito sutura-osso
   1. Impostare il motore chirurgico a 35.000 giri/min ruotando la manopola (Figura 1A, freccia gialla), quindi accendere l'interruttore (Figura 1A, freccia bianca).
   2. Partendo da qualsiasi punto della sutura coronale, applicare una forza verticale utilizzando una fresa rotonda di 1,2 mm di diametro fino a quando non si avverte un senso di sfondamento.
      NOTA: Raccomandare il punto medio della sutura coronale (indicato dalle frecce gialle nella Figura 2E2) come punto di partenza per la penetrazione. Durante la molatura, i trapani dentali devono essere mantenuti perpendicolari alla superficie cranica. Prestare attenzione a non continuare a perforare dopo aver penetrato l'intero spessore del cranio per evitare ulteriori danni ai ratti, inclusi danni cerebrali o emorragie cerebrali.
   3. Dal punto di penetrazione, spostare la fresa lateralmente lungo la sutura coronale per creare un solco di posizionamento lungo circa 4 mm (Figura 2F1). Rimuovere il tessuto osseo con la fresa su entrambi i lati della scanalatura di posizionamento per formare inizialmente un difetto rettangolare a tutto spessore (Figura 2F2).
   4. Utilizzare una fresa rotonda di 0,8 mm di diametro per rifinire i dettagli (Figura 2G1), coinvolgendo la rettifica degli angoli retti e la levigatura dei margini dei difetti, ottenendo infine un difetto rettangolare standard di 2 mm di larghezza e 4,5 mm di lunghezza (Figura 2G2).
      NOTA: Per ottenere la rimozione completa della sutura coronale preservando le suture sagittale e frontale in ratti SD da 300 g, la lunghezza massima possibile del difetto è di circa 4,5 mm. Considerando la larghezza della sutura coronale in direzione antero-posteriore (Figura supplementare S1), la larghezza del difetto è stata fissata a 2 mm.
   5. Creare due difetti sulle metà sinistra e destra della sutura coronale per l'autoconfronto.
   6. Mantenere l'irrigazione continua della soluzione salina durante la procedura di perforazione per evitare lesioni termiche al cranio e al cervello. Nel frattempo, usa batuffoli di cotone per asciugare l'area operativa.
4. Verifica della dimensione del campione
   1. Verificare regolarmente la lunghezza e la larghezza dei difetti utilizzando un calibro a corsoio (Figura 2H1, H2) per garantire la coerenza in tutti i campioni.
5. Chiusura del sito chirurgico
   1. Chiudere la pelle con suture monofilamento 3-0 (Figura 2I).
6. Tomografia microcomputerizzata in vivo ( μCT) postoperatoria immediata
   1. Se possibile, eseguire scansioni μCT in vivo su tutti i ratti subito dopo l'intervento chirurgico per confermare il successo della procedura chirurgica e monitorare le tendenze di recupero dei difetti per ciascun individuo.

3. Cure post-chirurgiche

1. Secondo i protocolli di cura degli animali, somministrare analgesici consolidati se necessario dopo l'intervento chirurgico, ad esempio il carprofene (5 mg/kg, uso sottocutaneo).
2. Trasferire i ratti su un termoforo costante (37 °C) per il recupero postoperatorio.
3. Una volta completamente coscienti, trasferisci i ratti nella loro gabbia contenente lettiera pulita.
   NOTA: Monitorare continuamente i ratti dopo l'intervento chirurgico. Non lasciarli incustoditi fino a quando non riescono a mantenere la decubito sternale. Tenere i ratti operati isolati dagli altri fino a quando non si sono completamente ripresi.
4. Condurre la gestione dell'analgesia e il monitoraggio postoperatorio per 24 ore, seguiti da valutazioni quotidiane durante la prima settimana dopo l'intervento. Successivamente monitorare i ratti almeno 1-2 volte a settimana.

4. Raccolta dei campioni e analisi dei dati

1. Preparazione del campione
   1. Raccogli i campioni di cranio al giorno 0 postoperatorio, alla settimana 2, alla settimana 6 e alla settimana 12. Eutanasia dei ratti utilizzando l'inalazione di CO₂ .
   2. Fissare i campioni in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore prima di ulteriori analisi.
2. Valutazione μCT
   1. Eseguire scansioni μCT su ossa craniche del giorno 0, settimana 6, settimana 12 postoperatoria con i seguenti parametri di scansione: potenziale del tubo a raggi X, 70 kVp; Intensità dei raggi X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tempo di integrazione, 1 x 300 ms; e dimensione del voxel, 10 μm.
   2. Ottenere immagini di ricostruzione 3D e sezioni trasversali con il software di elaborazione delle immagini (vedi Tabella dei materiali).
   3. Misurare il volume residuo dei difetti ed eseguire analisi statistiche con il software corrispondente (vedere la tabella dei materiali).
3. Colorazione istologica
   1. Decalcificare le ossa craniche in una soluzione di acido etilendiammina tetraacetico al 12% (p/v) (pH = 7,2) a 4 °C per 6 settimane.
      NOTA: Decalcificare i campioni con cambi di soluzione ogni 3 giorni. Utilizza uno shaker per accelerare il processo. Il completamento è indicato quando un ago da 25 G penetra facilmente nel campione.
   2. Procedere con la disidratazione, l'inclusione in paraffina e la preparazione di sezioni da 6 μm utilizzando i protocolli standard¹⁸.
   3. Condurre l'analisi istologica utilizzando ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson seguendo il protocollo^{del kit 18}.

Risultati

In questo studio, il difetto composito della sutura calvariale del ratto è stato stabilito praticando un foro rettangolare di 4,5 mm x 2 mm attraverso la sutura coronale. L'illustrazione schematica chirurgica e il diagramma di flusso della ricerca sono illustrati nella Figura 3. L'immagine 3D e la vista in sezione trasversale dei campioni postoperatori 0-day, ovvero i campioni raccolti immediatamente dopo l'intervento chirurgico, hanno confermato la creazio...

Discussione

I modelli convenzionali di difetto calvariano, che coinvolgano o meno suture craniche, si concentrano principalmente sulla riparazione dei tessuti duri, spesso trascurando la rigenerazione vitale del mesenchima di sutura^19,20. Nella ricerca sulla rigenerazione della sutura, modelli precedenti, come quelli di Mardas et ^al.15,16, che utilizzavano una fresa a trefina per cre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
2% Iodophor solution	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
75% Ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	None
Cotton swabs	Lakong Medical Devices Co.,	None
Curved forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Dataviewer and Ctan software for residual defect volume assessments	Bruker	None
Dental low-speed round burs	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012 RA1-008
Disposable sterile scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None
Disposable syringes (22 G)	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	SB1-089(IX)
Electric shaver	JASE	BM320210
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340GR500
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Irrigation needle (23 G)	Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.	None
Low-speed handpiece	Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.	None
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical non-woven fabrics	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	None
Micro-computed tomography (µCT)	Scanco Medical AG	µCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional images	Materialise	None
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Periosteal elevator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Saline solution	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Scanco medical visualizer software for 3D image reconstruction	Scanco Medical AG	None
SPSS Statistics 20.0 for statistical analysis	IBM	None
Sprague-Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None
Straight Scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Surgical Motor	MARATHON	N3-140232
Surgical sutures (3-0 monofilament)	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None