O Estabelecimento de Defeitos Compostos Calvariais de Sutura-Osso em Ratos: Um Modelo Padronizado para Investigação de Terapia Regenerativa de Sutura

Resumo

Descrevemos os procedimentos cirúrgicos detalhados de defeitos compostos ósseo-sutura da calvária em ratos, juntamente com as investigações sobre os prognósticos de curto e longo prazo do modelo. Nosso objetivo é construir um modelo padronizado para o desenvolvimento de terapias regenerativas de sutura.

Resumo

Defeitos da calvária em grande escala geralmente coincidem com a ruptura da sutura craniana, levando a prejuízos na restauração do defeito da calvária e no desenvolvimento do crânio (este último ocorre no crânio em desenvolvimento). No entanto, a falta de um modelo padronizado dificulta o progresso na investigação de terapias regenerativas de sutura e apresenta desafios para a realização de análises comparativas em estudos distintos. Para resolver esse problema, o protocolo atual descreve o processo de modelagem detalhada de defeitos compostos ósseos de sutura calvarial em ratos.

O modelo foi gerado por meio da perfuração de furos retangulares de espessura total medindo 4,5 mm × 2 mm nas suturas coronais. Os ratos foram sacrificados e as amostras de crânio foram colhidas no pós-operatório no dia 0, semana 2, semana 6 e semana 12. Os resultados da TC de amostras coletadas imediatamente após a cirurgia confirmaram o estabelecimento bem-sucedido do defeito composto sutura-osso, envolvendo a remoção da sutura coronal e dos tecidos ósseos adjacentes.

Os dados da^6ª e^12ª semanas de pós-operatório demonstraram uma tendência natural de cicatrização para o fechamento do defeito. A coloração histológica validou ainda mais essa tendência, mostrando aumento de fibras mineralizadas e osso novo no centro do defeito. Esses achados indicam fusão progressiva da sutura ao longo do tempo após defeitos da calvária, ressaltando a importância das intervenções terapêuticas para a regeneração da sutura. Prevemos que este protocolo facilitará o desenvolvimento de terapias regenerativas de sutura, oferecendo novos insights sobre a restauração funcional de defeitos da calvária e reduzindo os resultados adversos associados à perda de sutura.

Introdução

As suturas cranianas são conexões fibrosas densas entre os ossos cranianos, atuando como articulações para facilitar o leve movimento do crânio e fornecendo uma almofada protetora para o cérebro sob pressão¹. Nos últimos anos, o aumento da pesquisa destacou o papel fundamental das suturas cranianas no desenvolvimento do crânio, na homeostase craniofacial e no potencial osteo-reparador inerente 2,3,4,5,6,7,8. Durante os períodos de crescimento e desenvolvimento, as suturas cranianas atuam como os principais centros de crescimento do crânio⁴. A formação de novos ossos ocorre nas frentes osteogênicas em ambos os lados das suturas, enquanto as células dentro das suturas mantêm um estado mesenquimal indiferenciado, garantindo a expansão equilibrada do crânio junto com o crescimento do cérebro¹. A perda de suturas cranianas neste momento resulta em uma discrepância entre o crescimento do crânio e do cérebro, levando a problemas graves como lesões cerebrais, hidrocefalia, aumento da pressão intracraniana e disfunção cognitiva ^3,9.

Além disso, as suturas cranianas desempenham um papel crucial na determinação do prognóstico dos defeitos da calvária ^5,7,10. O potencial regenerativo na superfície da calvária é distribuído de forma desigual, com suturas cranianas mostrando capacidades notavelmente superiores em comparação com regiões sem sutura^10,11. Um estudo indica que a velocidade de cicatrização do defeito da calvária se correlaciona inversamente com a distância entre a sutura craniana e o local da lesão¹⁰. Especificamente, a remoção de suturas coronais e sagitais leva à não cicatrização de defeitos ósseos parietais⁷, enfatizando a necessidade de regeneração de sutura em defeitos da calvária. No entanto, o foco dos estudos atuais é predominantemente na restauração da estrutura óssea craniana, negligenciando a regeneração do mesênquima de sutura.

Em relação aos avanços na regeneração de suturas, resultados promissores têm sido observados com o transplante de retalhos ósseos contendo sutura, células-tronco mesenquimais (CTMs) e biomateriais artificiais. Quando os retalhos ósseos com suturas foram transplantados para defeitos da calvária, eles se integraram e cicatrizaram com sucesso, em contraste com aqueles sem suturas que apresentavam não união e incapacidade de formar periósteo, dura-máter ou osteócitos⁵. Da mesma forma, o implante de CTMs derivadas da medula óssea em defeitos compostos ósseos de sutura sagital facilitou a formação de lacunas semelhantes a suturas¹². Digno de nota, um estudo recente destacou a realização da regeneração da sutura com Gli1⁺ MSCs, permitindo o controle da pressão intracraniana, correção da deformidade craniana e melhora da função neurocognitiva¹³. À medida que a medicina regenerativa e a engenharia biomédica se desenvolvem, os pesquisadores se concentram cada vez mais em biomateriais de engenharia de tecidos devido às suas características adaptáveis e personalizáveis¹⁴. Notavelmente, as membranas de politetrafluoretileno provaram ser eficazes na reconstrução do osso craniano e na sutura do mesênquima simultaneamente^15,16.

No entanto, a pesquisa craniofacial carece de modelos estabelecidos para explorar terapias regenerativas mesenquimais de sutura, ao contrário de modelos relativamente maduros na reparação de outros tecidos, como osso, pele, cartilagem e músculos¹⁷. A ausência de um modelo padronizado restringe o estudo de terapias regenerativas de sutura e torna desafiador realizar análises comparativas em diferentes estudos. Portanto, nosso estudo estabeleceu um defeito composto ósseo-sutura calvarial de rato praticável e reprodutível. Por meio desse método, pretendemos desenvolver intervenções clínicas apropriadas para a reconstrução da sutura craniana, oferecendo novas perspectivas sobre o reparo funcional dos defeitos da calvária e diminuindo os resultados desfavoráveis resultantes da perda de sutura.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Um total de 12 (3 ratos em cada um dos quatro pontos de tempo) ratos Sprague-Dawley (SD) (macho, 300 g, 8 semanas de idade) foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Itens cirúrgicos
   1. Prepare os instrumentos cirúrgicos exibidos na Figura 1A, incluindo pinças curvas, bisturi estéril descartável, elevador de periósteo, agulha de irrigação, bolas de algodão, peça de mão de baixa rotação, motor cirúrgico, brocas redondas odontológicas de baixa velocidade (Figura 1B, 1,2 mm e 0,8 mm de diâmetro, respectivamente), porta-agulhas, suturas de monofilamento 3-0 e tesoura reta.
2. Esterilização e desinfecção
   1. Esterilize os instrumentos por esterilização a vapor (125-135 °C, 20-25 min) com antecedência.
   2. Use etanol para esterilizar equipamentos médicos sensíveis ao calor, como barbeadores elétricos.
   3. Use tecidos não tecidos médicos estéreis para cobrir a plataforma de operação e desinfetar o ambiente circundante com etanol a 75%.
3. Anestesia
   1. Prepare os animais para a cirurgia com um período de aclimatação de 1 semana.
   2. Injete os ratos por via intraperitoneal com xilazina (10 mg / kg) e cetamina (100 mg / kg) 20 minutos antes da cirurgia para anestesia ou utilize qualquer protocolo anestésico adequado para obter anestesia geral.
      NOTA: O coquetel anestésico cetamina-xilazina administrado por via intraperitoneal em ratos normalmente faz efeito dentro de 10-15 minutos, atingindo o pico da anestesia cerca de 35-40 minutos após a injeção. Para evitar a hipotermia durante a anestesia, os ratos devem ser colocados em uma almofada de aquecimento.
   3. Administre uma injeção subcutânea pré-operatória de carprofeno a 5 mg / kg para fornecer analgesia.
   4. Use o "método de beliscar o dedo do pé" para determinar se os ratos estão ou não conscientes e responsivos.

2. Processo cirúrgico

1. Preparação do site
   1. Coloque o rato em decúbito ventral com a cabeça naturalmente estendida verticalmente, sem a necessidade de dispositivos especiais ou restrições para manter essa postura (Figura 2A).
   2. Aplique pomada veterinária, ou seja, vaselina, nos olhos do rato para evitar o ressecamento da córnea.
   3. Remova o cabelo do couro cabeludo entre a ponte nasal e a articulação da coluna cervical com um barbeador elétrico (Figura 2B). Desinfetar a área cirúrgica em movimentos circulares irradiando do centro com solução de iodóforo a 2% seguida de etanol a 75%. Empregue uma cortina cirúrgica para cobrir o dorso do animal e o pelo ao redor da incisão.
2. Abertura do sítio cirúrgico
   1. Partindo do ponto médio do osso nasal, fazer uma incisão longitudinal na pele de 2 cm com bisturi descartável seguindo a linha média do crânio (Figura 2C).
   2. Faça uma incisão periosteal na linha média espelhando o ponto inicial e a extensão da camada de pele com um bisturi (Figura 2D). Em seguida, levante suavemente o periósteo em ambos os lados da incisão com um elevador periosteal (Figura 2E1) para expor os ossos parietais, ossos frontais e suturas coronais (Figura 2E2).
      NOTA: Ao incisar o periósteo, tome cuidado para não danificar as suturas cranianas para evitar sangramento excessivo durante o corte. A exposição adequada da sutura coronal é de extrema importância para os procedimentos a seguir.
   3. Enxágue a ferida com soro fisiológico e seque a área cirúrgica com bolas de algodão.
3. Estabelecimento do modelo de defeito composto ósseo-sutura
   1. Ajuste o motor cirúrgico para 35,000 rpm girando o botão (Figura 1A, seta amarela) e, em seguida, ligue o interruptor (Figura 1A, seta branca).
   2. Começando de qualquer ponto da sutura coronal, aplique força vertical usando uma broca redonda de 1,2 mm de diâmetro até sentir uma sensação de ruptura.
      NOTA: Recomende o ponto médio da sutura coronal (indicado por setas amarelas na Figura 2E2) como ponto de partida para a penetração. Ao afiar, as brocas dentárias devem ser mantidas perpendiculares à superfície craniana. Tenha cuidado para não continuar perfurando depois de penetrar em toda a espessura do crânio para evitar mais danos aos ratos, incluindo danos cerebrais ou hemorragia cerebral.
   3. A partir do ponto de penetração, mova a broca lateralmente ao longo da sutura coronal para criar um sulco de posicionamento de aproximadamente 4 mm de comprimento (Figura 2F1). Remova o tecido ósseo com a broca em ambos os lados da ranhura de posicionamento para formar inicialmente um defeito retangular de espessura total (Figura 2F2).
   4. Empregue uma broca redonda de 0,8 mm de diâmetro para refinar os detalhes (Figura 2G1), envolvendo a retificação de ângulos retos e a suavização das margens do defeito, alcançando um defeito retangular padrão medindo 2 mm de largura e 4,5 mm de comprimento (Figura 2G2).
      NOTA: Para obter a remoção completa da sutura coronal, preservando as suturas sagital e frontal em ratos SD de 300 g, o comprimento máximo viável do defeito é de aproximadamente 4,5 mm. Considerando a largura da sutura coronal no sentido ântero-posterior (Figura Suplementar S1), a largura do defeito foi fixada em 2 mm.
   5. Crie dois defeitos nas metades esquerda e direita da sutura coronal para autocomparação.
   6. Mantenha a irrigação contínua da solução salina durante o procedimento de perfuração para proteger contra lesões térmicas no crânio e no cérebro. Enquanto isso, use bolas de algodão para secar a área de operação.
4. Verificação da dimensão da amostra
   1. Verifique regularmente o comprimento e a largura dos defeitos usando um paquímetro (Figura 2H1, H2) para garantir a consistência em todas as amostras.
5. Fechamento do sítio cirúrgico
   1. Fechar a pele com pontos de monofilamento 3-0 (Figura 2I).
6. Microtomografia computadorizada in vivo (μCT) pós-operatória imediata
   1. Se possível, realize exames de μCT in vivo em todos os ratos imediatamente após a cirurgia para confirmar o sucesso do procedimento cirúrgico e monitorar as tendências de recuperação de defeitos para cada indivíduo.

3. Cuidados pós-cirúrgicos

1. De acordo com os protocolos de cuidados com os animais, administre analgésicos estabelecidos conforme necessário após a cirurgia, por exemplo, carprofeno (5 mg/kg, uso subcutâneo).
2. Transfira os ratos para uma almofada de aquecimento constante (37 ° C) para recuperação pós-operatória.
3. Uma vez totalmente consciente, reposicione os ratos para sua gaiola contendo roupas de cama limpas.
   NOTA: Monitore continuamente os ratos após a cirurgia. Não os deixe sem vigilância até que possam manter a decúbito esternal. Mantenha os ratos operados isolados dos outros até que estejam totalmente recuperados.
4. Realizar o manejo da analgesia e monitoramento pós-operatório por 24 horas, seguido de avaliações diárias durante a primeira semana após a cirurgia. Monitore os ratos pelo menos 1-2x por semana a partir de então.

4. Coleta de amostras e análise de dados

1. Preparação da amostra
   1. Colete amostras de crânio no dia 0 pós-operatório, semana 2, semana 6 e semana 12. Eutanasiar os ratos usando inalação de CO₂ .
   2. Fixe as amostras em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 h antes de uma análise posterior.
2. Avaliação por TC de μ
   1. Realizar varreduras μCT em ossos cranianos do dia 0 pós-operatório, semana 6, semana 12 com os seguintes parâmetros de varredura: potencial do tubo de raios-X, 70 kVp; intensidade de raios-X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tempo de integração, 1 x 300 ms; e tamanho do voxel, 10 μm.
   2. Obtenha reconstrução 3D e imagens transversais com software de processamento de imagem (consulte Tabela de Materiais).
   3. Meça o volume de defeitos residuais e realize análises estatísticas com o software correspondente (consulte a Tabela de Materiais).
3. Coloração histológica
   1. Descalcifique os ossos cranianos em solução de ácido etilenodiamina tetracético a 12% (p / v) (pH = 7,2) a 4 ° C por 6 semanas.
      NOTA: Descalcifique as amostras com trocas de solução a cada 3 dias. Utilize um shaker para agilizar o processo. A conclusão é indicada quando uma agulha de 25 G penetra facilmente na amostra.
   2. Prossiga com a desidratação, inclusão de parafina e preparação de cortes de 6 μm usando protocolos padrão¹⁸.
   3. Realize a análise histológica usando hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrômica de Masson seguindo o protocolo do kit¹⁸.

Resultados

Neste estudo, o defeito composto ósseo de sutura calvarial de rato foi estabelecido perfurando um orifício retangular de 4,5 mm x 2 mm na sutura coronal. A ilustração esquemática cirúrgica e o fluxograma da pesquisa estão representados na Figura 3. A imagem 3D e a visão transversal das amostras de 0 dias de pós-operatório, ou seja, amostras coletadas imediatamente após a cirurgia, confirmaram a criação bem-sucedida de um defeito de calvária de ...

Discussão

Os modelos convencionais de defeitos da calvária, envolvendo ou não suturas cranianas, concentram-se principalmente no reparo de tecidos duros, muitas vezes negligenciando a regeneração vital do mesênquima de sutura^19,20. Na pesquisa de regeneração de sutura, modelos anteriores, como os de Mardas et ^al.15,16, utilizando uma broca trefina para criar um defeito circu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
2% Iodophor solution	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
75% Ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	None
Cotton swabs	Lakong Medical Devices Co.,	None
Curved forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Dataviewer and Ctan software for residual defect volume assessments	Bruker	None
Dental low-speed round burs	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012 RA1-008
Disposable sterile scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None
Disposable syringes (22 G)	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	SB1-089(IX)
Electric shaver	JASE	BM320210
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340GR500
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Irrigation needle (23 G)	Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.	None
Low-speed handpiece	Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.	None
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical non-woven fabrics	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	None
Micro-computed tomography (µCT)	Scanco Medical AG	µCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional images	Materialise	None
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Periosteal elevator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Saline solution	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Scanco medical visualizer software for 3D image reconstruction	Scanco Medical AG	None
SPSS Statistics 20.0 for statistical analysis	IBM	None
Sprague-Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None
Straight Scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Surgical Motor	MARATHON	N3-140232
Surgical sutures (3-0 monofilament)	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None