Die Etablierung von kalvarialen, naht-knöchernen Kompositdefekten bei Ratten: Ein standardisiertes Modell für die Untersuchung der nahtregenerativen Therapie

Zusammenfassung

Wir beschreiben die detaillierten chirurgischen Abläufe von Schädeldach-Naht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten und untersuchen die kurz- und langfristigen Prognosen des Modells. Unser Ziel ist es, ein standardisiertes Modell für die Entwicklung nahtregenerativer Therapien zu entwickeln.

Zusammenfassung

Großflächige Schädelbaddefekte fallen oft mit einer Rissbildung der Schädelnaht zusammen, was zu Beeinträchtigungen bei der Wiederherstellung der Schädeldefekte und der Schädelentwicklung führt (letztere tritt im sich entwickelnden Schädel auf). Das Fehlen eines standardisierten Modells behindert jedoch den Fortschritt bei der Erforschung nahtregenerativer Therapien und stellt eine Herausforderung für die Durchführung vergleichender Analysen über verschiedene Studien hinweg dar. Um dieses Problem zu lösen, beschreibt das aktuelle Protokoll den detaillierten Modellierungsprozess von kalvarialen Naht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten.

Das Modell wurde erstellt, indem rechteckige Löcher in voller Dicke von 4,5 mm × 2 mm über die koronalen Nähte gebohrt wurden. Die Ratten wurden euthanasiert und die Schädelproben wurden postoperativ an Tag 0, Woche 2, Woche 6 und Woche 12 entnommen. μCT-Ergebnisse von Proben, die unmittelbar nach der Operation entnommen wurden, bestätigten die erfolgreiche Etablierung des Naht-Knochen-Kompositdefekts, bei dem die koronale Naht und das angrenzende Knochengewebe entfernt wurden.

Daten aus der 6^. und 12^. postoperativen Woche zeigten eine natürliche Heilungstendenz, damit sich der Defekt schließt. Die histologische Färbung bestätigte diesen Trend weiter, indem sie vermehrt mineralisierte Fasern und neuen Knochen im Defektzentrum zeigte. Diese Befunde deuten auf eine fortschreitende Nahtfusion im Laufe der Zeit nach Schädelmarksdefekten hin, was die Bedeutung therapeutischer Interventionen für die Nahtregeneration unterstreicht. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll die Entwicklung von nahtregenerativen Therapien erleichtern wird, indem es neue Einblicke in die funktionelle Wiederherstellung von Schädelbergdefekten bietet und unerwünschte Folgen im Zusammenhang mit Nahtverlust reduziert.

Einleitung

Schädelnähte sind dichte faserige Verbindungen zwischen Schädelknochen, die als Gelenke dienen, um leichte Schädelbewegungen zu erleichtern und ein schützendes Polster für das Gehirn unter Druck zu bieten¹. In den letzten Jahren hat die Forschung verstärkt die zentrale Rolle von Schädelnähten bei der Schädelentwicklung, der kraniofazialen Homöostase und dem inhärenten osteoreparativen Potenzial hervorgehoben 2,3,4,5,6,7,8. Während der Wachstums- und Entwicklungsphasen fungieren Schädelnähte als Hauptwachstumszentren im Schädel⁴. Die Knochenneubildung findet an den osteogenen Fronten auf beiden Seiten der Nähte statt, während die Zellen in den Nähten einen undifferenzierten mesenchymalen Zustand beibehalten, was eine ausgewogene Schädelexpansion neben dem Gehirnwachstum gewährleistet¹. Der Verlust der Schädelnähte zu diesem Zeitpunkt führt zu einer Diskrepanz zwischen dem Wachstum des Schädels und des Gehirns, was zu schwerwiegenden Problemen wie Hirnverletzungen, Hydrozephalus, erhöhtem Hirndruck und kognitiver Dysfunktion führt ^3,9.

Darüber hinaus spielen Schädelnähte eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Prognose von Schädeldachdefekten ^5,7,10. Das Regenerationspotenzial über die Schädeloberfläche ist ungleichmäßig verteilt, wobei die Schädelnähte im Vergleich zu nicht nahten Regionen bemerkenswert überlegene Fähigkeiten aufweisen^10,11. Eine Studie zeigt, dass die Geschwindigkeit der Heilung des Schädeldefekts umgekehrt mit dem Abstand zwischen der Schädelnaht und der Verletzungsstelle korreliert¹⁰. Insbesondere führt die Entfernung von koronalen und sagittalen Nähten zur Nichtheilung von parietalen Knochendefekten⁷, was die Notwendigkeit einer Nahtregeneration bei Schädeldachdefekten unterstreicht. Der Fokus der aktuellen Studien liegt jedoch überwiegend auf der Wiederherstellung der kranialen Knochenstruktur unter Vernachlässigung der Regeneration des Nahtmesenchyms.

Was die Fortschritte bei der Nahtregeneration betrifft, so wurden vielversprechende Ergebnisse bei der Transplantation von nahthaltigen Knochenlappen, mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und künstlichen Biomaterialien beobachtet. Wenn Knochenlappen mit Nähten in Schädeldachdefekte transplantiert wurden, integrierten und heilten sie erfolgreich, im Gegensatz zu solchen ohne Nähte, die eine Pseudarthrose und die Unfähigkeit zeigten, Periost, Dura mater oder Osteozyten zu bilden⁵. Ebenso erleichterte die Implantation von MSCs aus dem Knochenmark in sagittale Naht-Knochen-Kompositdefekte die Bildung nahtartiger Lücken¹². Bemerkenswert ist, dass eine kürzlich durchgeführte Studie die Realisierung der Nahtregeneration mit Gli1⁺ MSCs hervorhob, die eine intrakranielle Druckkontrolle, eine Korrektur der Schädeldeformität und eine verbesserte neurokognitive Funktion ermöglichen¹³. Mit der Entwicklung der regenerativen Medizin und der biomedizinischen Technik konzentrieren sich die Forscher aufgrund ihrer anpassungsfähigen und anpassbaren Eigenschaften zunehmend auf Tissue Engineering-Biomaterialien¹⁴. Insbesondere haben sich Polytetrafluorethylenmembranen bei der gleichzeitigen Rekonstruktion von Schädelknochen- und Nahtmesenchym als wirksam erwiesen^15,16.

In der kraniofazialen Forschung fehlen jedoch etablierte Modelle für die Erforschung mesenchymaler regenerativer Nahttherapien, im Gegensatz zu relativ ausgereiften Modellen zur Reparatur anderer Gewebe wie Knochen, Haut, Knorpel und Muskeln¹⁷. Das Fehlen eines standardisierten Modells schränkt die Untersuchung von nahtregenerativen Therapien ein und macht es schwierig, vergleichende Analysen über verschiedene Studien hinweg durchzuführen. Daher wurde in unserer Studie ein praktikabler und reproduzierbarer Defekt zwischen Schädeldach und Knochen der Ratte festgestellt. Mit dieser Methode wollen wir geeignete klinische Interventionen für die Rekonstruktion von Schädelnaht entwickeln, die neue Perspektiven für die funktionelle Reparatur von Schädelmarksdefekten bieten und ungünstige Ergebnisse durch Nahtverlust verringern.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2021-597). Insgesamt 12 (3 Ratten zu jedem der vier Zeitpunkte) Sprague-Dawley (SD) Ratten (männlich, 300 g, 8 Wochen alt) wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Präoperative Vorbereitung

1. Chirurgische Artikel
   1. Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor, die in Abbildung 1A dargestellt sind, einschließlich einer gebogenen Pinzette, eines sterilen Einwegskalpells, eines Periostlifts, einer Spülnadel, Wattebäuschen, eines Handstücks mit niedriger Geschwindigkeit, eines chirurgischen Motors, zahnärztlicher Rundbohrer mit niedriger Geschwindigkeit (Abbildung 1B, Durchmesser 1,2 mm bzw. 0,8 mm), eines Nadelhalters, 3-0 monofiler Nähte und einer geraden Schere.
2. Sterilisation und Desinfektion
   1. Sterilisieren Sie die Instrumente vorab durch Dampfsterilisation (125-135 °C, 20-25 min).
   2. Verwenden Sie Ethanol, um hitzeempfindliche medizinische Geräte wie Elektrorasierer zu sterilisieren.
   3. Verwenden Sie sterile medizinische Vliesstoffe, um die Operationsplattform abzudecken und die Umgebung mit 75 % Ethanol zu desinfizieren.
3. Anästhesie
   1. Bereiten Sie die Tiere mit einer 1-wöchigen Eingewöhnungsphase auf die Operation vor.
   2. Injizieren Sie den Ratten intraperitoneal Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) 20 Minuten vor der Operation zur Anästhesie oder verwenden Sie ein geeignetes Anästhesieprotokoll, um eine Vollnarkose zu erreichen.
      HINWEIS: Der Ketamin-Xylazin-Anästhesie-Cocktail, der bei Ratten intraperitoneal verabreicht wird, wirkt in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten und erreicht etwa 35-40 Minuten nach der Injektion die maximale Anästhesie. Um eine Unterkühlung während der Narkose zu verhindern, werden Ratten am besten auf ein Heizkissen gelegt.
   3. Verabreichen Sie eine präoperative subkutane Injektion von Carprofen in einer Dosis von 5 mg/kg, um eine Analgesie zu verabreichen.
   4. Verwenden Sie die "Zehenkneifmethode", um festzustellen, ob die Ratten bei Bewusstsein und ansprechbar sind oder nicht.

2. Chirurgischer Ablauf

1. Vorbereitung der Baustelle
   1. Bringen Sie die Ratte in eine Bauchlage, wobei sich ihr Kopf natürlich vertikal ausstreckt, ohne dass spezielle Vorrichtungen oder Fesseln erforderlich sind, um diese Haltung beizubehalten (Abbildung 2A).
   2. Tragen Sie Veterinärsalbe, d.h. Vaseline, auf die Augen der Ratte auf, um Hornhauttrockenheit zu verhindern.
   3. Entfernen Sie die Haare von der Kopfhaut zwischen dem Nasenrücken und dem Halswirbelsäulengelenk mit einem Elektrorasierer (Abbildung 2B). Desinfizieren Sie den Operationsbereich in kreisenden Bewegungen, die von der Mitte ausgehen, mit 2 % Iodophorlösung, gefolgt von 75 % Ethanol. Verwenden Sie ein chirurgisches Tuch, um den Rücken des Tieres und das Fell um den Schnitt herum zu bedecken.
2. Öffnung der Operationsstelle
   1. Ausgehend von der Mitte des Nasenbeins wird mit einem Einwegskalpell ein 2 cm langer Längsschnitt in die Haut vorgenommen, der der Mittellinie des Schädels folgt (Abbildung 2C).
   2. Machen Sie mit einem Skalpell einen periostalen Schnitt in der Mittellinie, der den Anfangspunkt und die Ausdehnung der Hautschicht widerspiegelt (Abbildung 2D). Heben Sie dann das Periost auf beiden Seiten des Schnitts vorsichtig mit einem Periostlift an (Abbildung 2E1), um Parietalknochen, Stirnknochen und koronale Nähte freizulegen (Abbildung 2E2).
      HINWEIS: Achten Sie beim Einschneiden des Periosts darauf, die Schädelnähte nicht zu beschädigen, um übermäßige Blutungen beim Schneiden zu vermeiden. Eine adäquate Freilegung der Koronalnaht ist für die folgenden Eingriffe von größter Bedeutung.
   3. Spülen Sie die Wunde mit Kochsalzlösung aus und trocknen Sie den Operationsbereich mit Wattebällchen.
3. Etablierung eines Nahtknöchel-Kompositdefektmodells
   1. Stellen Sie den chirurgischen Motor auf 35.000 U/min ein, indem Sie den Knopf drehen (Abbildung 1A, gelber Pfeil), und schalten Sie dann den Schalter ein (Abbildung 1A, weißer Pfeil).
   2. Üben Sie von einem beliebigen Punkt auf der Koronalnaht aus eine vertikale Kraft mit einem runden Bohrer mit einem Durchmesser von 1,2 mm aus, bis ein Gefühl des Durchbruchs zu spüren ist.
      HINWEIS: Empfehlen Sie den Mittelpunkt der Koronalnaht (gekennzeichnet durch gelbe Pfeile in Abbildung 2E2) als Ausgangspunkt für die Penetration. Beim Schleifen sollten Zahnbohrer senkrecht zur Schädeloberfläche gehalten werden. Seien Sie vorsichtig, um nicht weiter zu bohren, nachdem Sie die volle Dicke des Schädels durchdrungen haben, um weitere Schäden an den Ratten zu vermeiden, einschließlich Hirnschäden oder Hirnblutungen.
   3. Bewegen Sie den Bohrer vom Penetrationspunkt aus seitlich entlang der Kronennaht, um eine ca. 4 mm lange Positionierungsrille zu erzeugen (Abbildung 2F1). Entfernen Sie Knochengewebe mit dem Bohrer auf beiden Seiten der Positionierungsnut, um zunächst einen rechteckigen Defekt in voller Dicke zu bilden (Abbildung 2F2).
   4. Verwenden Sie einen runden Bohrer mit einem Durchmesser von 0,8 mm, um Details zu verfeinern (Abbildung 2G1), wobei rechte Winkel geschliffen und Fehlerränder geglättet werden, um schließlich einen rechteckigen Standardfehler mit einer Breite von 2 mm und einer Länge von 4,5 mm zu erzielen (Abbildung 2G2).
      HINWEIS: Um eine vollständige Entfernung der koronalen Naht unter Beibehaltung der sagittalen und frontalen Nähte bei 300 g SD-Ratten zu erreichen, beträgt die maximal mögliche Defektlänge ca. 4,5 mm. Unter Berücksichtigung der Breite der koronalen Naht in anterior-posteriorer Richtung (Ergänzende Abbildung S1) wurde die Defektbreite auf 2 mm festgelegt.
   5. Erstellen Sie zwei Defekte in der linken und rechten Hälfte der Koronalnaht zum Selbstvergleich.
   6. Halten Sie während des Bohrvorgangs eine kontinuierliche Spülung mit Kochsalzlösung aufrecht, um sich vor thermischen Verletzungen des Schädels und des Gehirns zu schützen. Verwenden Sie in der Zwischenzeit Wattebällchen, um den Operationsbereich zu trocknen.
4. Überprüfung der Probenabmessungen
   1. Überprüfen Sie regelmäßig die Länge und Breite der Defekte mit einem Messschieber (Abbildung 2H1, H2), um die Konsistenz aller Proben zu gewährleisten.
5. Verschluss der Operationsstelle
   1. Verschließen Sie die Haut mit 3-0 monofilen Nähten (Abbildung 2I).
6. Sofortige postoperative in vivo Mikro-Computertomographie (μCT)
   1. Wenn möglich, führen Sie unmittelbar nach der Operation In-vivo-μCT-Scans an allen Ratten durch, um den Erfolg des chirurgischen Eingriffs zu bestätigen und die Trends bei der Wiederherstellung des Defekts für jedes Individuum zu überwachen.

3. Nachsorge

1. Gemäß den Tierpflegeprotokollen sind nach der Operation bei Bedarf etablierte Analgetika zu verabreichen, z. B. Carprofen (5 mg/kg, subkutane Anwendung).
2. Übertragen Sie die Ratten zur postoperativen Erholung auf ein konstantes Heizkissen (37 °C).
3. Sobald Sie bei vollem Bewusstsein sind, bringen Sie die Ratten in ihren Käfig mit sauberer Einstreu.
   HINWEIS: Überwachen Sie die Ratten nach der Operation kontinuierlich. Lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie das Brustbein aufrecht erhalten können. Operierte Ratten von anderen isoliert halten, bis sie vollständig genesen sind.
4. Führen Sie 24 Stunden lang ein Analgesiemanagement und eine postoperative Überwachung durch, gefolgt von täglichen Untersuchungen in der ersten Woche nach der Operation. Überwachen Sie die Ratten danach mindestens 1-2x pro Woche.

4. Probenentnahme und Datenanalyse

1. Probenvorbereitung
   1. Entnahme von Schädelproben am postoperativen Tag 0, in Woche 2, Woche 6 und Woche 12. Euthanasieren Sie die Ratten durch Inhalation von CO₂ .
   2. Fixieren Sie die Proben vor der weiteren Analyse 24 h lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C.
2. μCT-Auswertung
   1. Durchführung von μCT-Scans an Schädelknochen am postoperativen Tag 0, Woche 6, Woche 12 mit den folgenden Scanparametern: Röntgenröhrenpotential, 70 kVp; Röntgenintensität, 0,2 mA; Filter, AL 0,5 mm; Integrationszeit, 1 x 300 ms; und Voxelgröße, 10 μm.
   2. Erhalten Sie 3D-Rekonstruktionen und Schnittbilder mit einer Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).
   3. Messen Sie das Restfehlervolumen und führen Sie statistische Analysen mit entsprechender Software durch (siehe Materialtabelle).
3. Histologische Färbung
   1. Entkalken Sie die Schädelknochen in 12 % (w/v) Ethylendiamin-Tetraessigsäurelösung (pH = 7,2) bei 4 °C für 6 Wochen.
      HINWEIS: Entkalken Sie die Proben alle 3 Tage mit Lösungswechsel. Verwenden Sie einen Shaker, um den Prozess zu beschleunigen. Die Fertigstellung ist angezeigt, wenn eine 25-G-Nadel leicht in die Probe eindringt.
   2. Fahren Sie mit der Dehydratisierung, der Paraffineinbettung und der Vorbereitung von 6-μm-Schnitten unter Verwendung der Standardprotokolle^{fort 18}.
   3. Führen Sie eine histologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und der Trichrom-Färbung nach Masson gemäß dem Kit-Protokoll¹⁸ durch.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde der Kompositdefekt zwischen Schädeldach und Knochen der Ratte durch Bohren eines 4,5 mm x 2 mm großen rechteckigen Lochs durch die koronale Naht festgestellt. Die schematische Darstellung des chirurgischen Schemas und das Flussdiagramm der Forschung sind in Abbildung 3 dargestellt. Die 3D-Aufnahme und die Schnittansicht der postoperativen 0-Tage-Proben, d.h. der Proben, die unmittelbar nach der Operation entnommen wurden, bestätigte...

Diskussion

Konventionelle Modelle von Schädeldefekten, unabhängig davon, ob sie Schädelnähte beinhalten oder nicht, konzentrieren sich in erster Linie auf die Reparatur von Hartgewebe und vernachlässigen oft die vitale Regeneration des Nahtmesenchyms^19,20. In der Nahtregenerationsforschung führten frühere Modelle, wie die von Mardas et ^al.15,16, die einen Trepanbohrer verwend...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
2% Iodophor solution	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
75% Ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.	None
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	None
Cotton swabs	Lakong Medical Devices Co.,	None
Curved forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Dataviewer and Ctan software for residual defect volume assessments	Bruker	None
Dental low-speed round burs	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012 RA1-008
Disposable sterile scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None
Disposable syringes (22 G)	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	SB1-089(IX)
Electric shaver	JASE	BM320210
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340GR500
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Irrigation needle (23 G)	Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.	None
Low-speed handpiece	Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.	None
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical non-woven fabrics	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	None
Micro-computed tomography (µCT)	Scanco Medical AG	µCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional images	Materialise	None
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Periosteal elevator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Saline solution	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Scanco medical visualizer software for 3D image reconstruction	Scanco Medical AG	None
SPSS Statistics 20.0 for statistical analysis	IBM	None
Sprague-Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None
Straight Scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None
Surgical Motor	MARATHON	N3-140232
Surgical sutures (3-0 monofilament)	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	None