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摘要

在这里，我们利用HD-MEA来深入研究大规模神经元集合的计算动力学，特别是在海马体、嗅球回路和人类神经元网络中。捕获时空活动，结合计算工具，可以深入了解神经元集成的复杂性。该方法增强了对大脑功能的理解，有可能识别神经系统疾病的生物标志物和治疗方法。

摘要

大规模神经元网络及其复杂的分布式微电路对于产生从时空神经元活动模式中产生的感知、认知和行为至关重要。这些从相互连接的神经元集合的功能组中出现的动态模式有助于处理和编码多尺度神经信息的精确计算，从而推动更高的大脑功能。为了探究这种复杂性背后的神经动力学的计算原理，并研究生物过程对健康和疾病的多尺度影响，大规模同步记录已成为工具。在这里，采用高密度微电极阵列 （HD-MEA） 研究两种神经动力学模式——来自 离体 小鼠脑切片的海马和嗅球电路以及来自人诱导多能干细胞 （iPSC） 体外 细胞培养物的神经元网络。HD-MEA 平台具有 4096 个微电极，能够以高时空分辨率同时对数千个神经元集合的细胞外放电模式进行非侵入性、多位点、无标记的记录。这种方法可以表征几个电生理网络范围的特征，包括单/多单元尖峰活动模式和局部场电位振荡。为了仔细研究这些多维神经数据，我们开发了几种计算工具，结合了机器学习算法、自动事件检测和分类、图论和其他高级分析。通过用这个平台补充这些计算管道，我们提供了一种研究从细胞组件到网络的大型、多尺度和多模态动力学的方法。这有可能促进我们对健康和疾病中复杂的大脑功能和认知过程的理解。对开放科学的承诺和对大规模计算神经动力学的见解可以增强受脑启发的建模、神经形态计算和神经学习算法。此外，了解受损的大规模神经计算的潜在机制及其相互关联的微电路动力学可能导致特定生物标志物的识别，为更准确的诊断工具和神经系统疾病的靶向治疗铺平道路。

引言

神经元集合，通常称为细胞组装，在神经编码中起着关键作用，有助于处理多尺度神经信息的复杂计算1,2,3。这些集合支撑着广阔的神经元网络及其细微微电路的形成4。这种网络及其振荡模式驱动着高级大脑功能，包括感知和认知。虽然广泛的研究已经探索了特定的神经元类型和突触通路，但对神经元如何协同形成细胞组装并影响跨电路和网络的时空信息处理的更深入理解仍然难以捉摸5.

急性离体脑切片是研究完整神经回路的关键电生理学工具，为探测神经功能、突触传递和连接的振荡活动模式提供了受控环境，对药理学测试和疾病建模具有重要意义6,7,8。该研究方案强调了两个关键的大脑回路 - 参与学习和记忆过程的海马皮质 （HC） 9,10，以及负责气味辨别的嗅球 （OB） 11,12,13。在这两个区域中，在哺乳动物大脑中，成年神经发生会持续产生新的功能神经元14。这两种电路都展示了多维动态神经活动模式和固有的可塑性，它们参与对现有神经网络的重新布线，并在需要时促进替代信息处理策略15,16。

急性离体脑切片模型对于在微电路水平上深入研究大脑功能和理解疾病机制是必不可少的。然而，源自人类诱导多能干细胞 （iPSC） 神经元网络的体外细胞培养物为转化研究提供了一条有前途的途径，将动物实验结果与潜在的人类临床治疗无缝连接起来 17,18。这些以人为中心的体外检测是评估药理学毒性的可靠平台，可实现精确的药物筛选，并进一步研究基于细胞的创新治疗策略19,20。认识到iPSC神经元模型的关键作用，我们将该协议研究的第三个模块专门用于彻底研究其衍生网络的功能特征，并微调相关的细胞培养方案。

这些电生神经模块通常使用钙（Ca2+ 成像）、膜片钳记录和低密度微电极阵列 （LD-MEA） 等技术进行研究。虽然 Ca2+ 成像提供单细胞活性图谱，但它是一种基于细胞标记的方法，其时间分辨率低且在长期记录中面临挑战。LD-MEA缺乏空间精度，而膜片钳是一种侵入性的单位点技术，而且费力，通常成功率较低21,22,23。为了应对这些挑战并有效地探测全网络活动，大规模同步神经记录已成为理解大脑复杂性背后的神经动力学计算原理及其对健康和疾病的影响的关键方法24,25。

在这个JoVE协议中，我们展示了一种基于高密度MEA（HD-MEA）的大规模神经记录方法，用于捕获各种大脑模式的时空神经元活动，包括来自离体小鼠脑急性切片的海马和嗅球回路（图1A-C）和体外人类iPSC衍生的神经元网络（图1D-E），我们小组和其他同事之前报道了26，27,28,29,30,31,32,33,34,35。HD-MEA 基于互补金属氧化物半导体 （CMOS） 技术构建，具有片上电路和放大功能，可在 7mm2 阵列尺寸36 上进行亚毫秒级记录。这种非侵入性方法使用 4096 个微电极以高时空分辨率同时捕获来自数千个神经元集合的多位点、无标记细胞外放电模式，揭示了局部场电位 （LFP） 和多单元尖峰活动 （MUA） 的复杂动力学26,29。

鉴于这种方法产生的数据量很大，一个复杂的分析框架是必不可少的，但也带来了挑战37.我们开发了包含自动事件检测、分类、图论、机器学习和其他先进技术的计算工具（图 1F）26、29、38、39。将HD-MEA与这些分析工具集成在一起，设计了一种整体方法来探索从单个细胞组装到不同神经模式的更广泛神经网络的复杂动态。这种组合方法加深了我们对正常大脑功能中计算动力学的掌握，并提供了对病理状况中存在的异常的见解28。此外，这种方法的见解可以推动类脑建模、神经形态计算和神经学习算法的进步。最终，这种方法有望揭示神经网络中断背后的核心机制，潜在地识别生物标志物，并指导创建精确的诊断工具和针对神经系统疾病的靶向治疗。

研究方案

所有实验均按照适用的欧洲和国家法规（Tierschutzgesetz）进行，并得到地方当局的批准（Landesdirektion Sachsen;25-5131/476/14）。

1. HD-MEA 上海马皮质和嗅球回路的 离体 脑切片

  1. 实验切割和记录溶液的制备（图2A）
    1. 实验日，制备高蔗糖切割液0.5L和人工脑脊液（aCSF）记录液1L（表1A、B）。
      1. 将所有固体化学品加入干燥的容量瓶中，然后用双蒸 （dd） 水填充部分。
      2. 从 1 M 储备溶液中加入 MgCl2 和 CaCl2 ，然后用 dd 水填充剩余部分。开始用磁力搅拌器不断搅拌，直到可见固体溶解~5分钟。
    2. 使用凝固点渗透压计验证高蔗糖切割溶液的渗透压在 350-360 mOsm 和 aCSF 记录溶液的 315-325 mOsm 之间。
    3. 使用pH计验证高蔗糖切割溶液的pH值在7.3-7.4之间，aCSF记录溶液的pH值在7.25-7.35之间。开始用 95% 的 O2 和 5% 的 CO2 连续冒泡。
    4. 切片前将高蔗糖切割溶液放在冰上至少 30 分钟，并开始用 95% O2 和 5% CO2 连续冒泡。
    5. 碳化10分钟后，用30mL切割溶液填充50mL烧杯，并将其储存在冰箱（-20°C）中20-30分钟或直到部分冷冻。
      注意：所有溶液都应为每个实验准备新鲜的溶液。这里使用的 dd 水是在室温 （RT） 下储存的高压灭菌超纯水。准备的溶液量应根据具体的研究问题量身定制。
  2. 脑切片工作区的准备（图2A）
    1. 将动物带入实验室。
      注意：在该方案中，如前所述使用8-16周龄的C57BL / J6雌性小鼠26,29,32。运输后应让动物适应至少 30 分钟。应避免在实验的同一天进行长途转移（即机构间转移）。动物的年龄、性别和品系必须根据具体的研究问题来确定。
    2. 当动物适应环境并且高蔗糖溶液冷却时，将所需的工具放置在每个指定的工作空间中（参见 材料表）。
    3. 准备 脑切片恢复和维护工作区。用碳化aCSF记录溶液填充切片回收室，并将室置于设置为32°C的水浴中。 在整个实验过程中保持连续的碳化。
    4. 准备 脑切片准备工作区。设置振动切片机 - 将刀片放入振动切片机刀片支架中，并将振动切片校准到正确的设置（刀片行进速度：0.20 mm/s，高度振幅：95 μm，刀片角度：45°）。用冰块填充振动切口机冰盘，用高蔗糖切割溶液填充缓冲盘，然后开始在缓冲盘中碳化溶液。
    5. 准备 大脑准备工作区。在150毫米的玻璃培养皿中加入冰块，并在里面放置一个装有滤纸的90毫米塑料培养皿。用高蔗糖切割溶液填充塑料培养皿并开始碳化。在冷却的试样板上加入一滴强力胶，并连接琼脂糖模具。
      注意：琼脂糖霉菌至少在前一天在定制的小鼠脑模具中用3%琼脂糖的水溶液制备。
    6. 最后，准备 大脑提取工作区。用薄纸覆盖铝箔，取出装有高蔗糖切割溶液泥浆的 50 mL 烧杯，并将异氟醚加入麻醉室。
      注意：麻醉剂将在动物放置前 ~1 分钟添加到麻醉室中。在斩首前~2分钟，将从-20°C冰箱中取出装有30mL高蔗糖切割溶液泥浆的50mL烧杯。
  3. 小鼠脑的提取和切片
    注意：整个过程应尽快执行，以避免大脑缺氧。从斩首到浸入高蔗糖切割溶液泥浆中，脑切除只需 1-2 分钟。
    1. 用适当剂量的异氟醚（0.5mL / 1L麻醉室）麻醉动物。通过捏爪子确定麻醉深度;在继续之前确认缺乏爪子退缩反射。
    2. 将动物转移到脑提取工作区的薄纸上，并用手术剪刀将其斩首。
    3. 将虹膜剪刀插入脑干，并保持底部剪刀与颅骨齐平。沿着矢状缝线切割，直到到达冠状缝合线。将虹膜剪刀放入眼眶中，然后剪开中位缝合线。使用弯曲的镊子向下移动颅骨的两侧，暴露整个大脑。
      注意： 使用虹膜剪刀和镊子时要小心，以免在剪断缝合线时刺穿大脑。
    4. 用弯曲镊子的钝边将大脑滑入装有 30 mL 高蔗糖切割溶液泥的 50 mL 烧杯中。让它保持 1 分钟。
    5. 在大脑制备工作区中，用冷却的碳化切割溶液将大脑转移到 90 mm 塑料培养皿中。定向大脑以在琼脂糖模具中定位。
    6. 在琼脂糖模具的喙端加入一小点强力胶。用刮刀将大脑放入模具中。确保将大脑背侧朝下放置以进行水平切片。
      注意：胶水在模具中的位置会根据感兴趣的区域 （ROI） 而变化。对于海马皮质 （HC） 和嗅球 （OB） 切片，确保产科稳定并且大脑两侧没有胶水。过多的胶水会影响切片质量，并在振动切片过程中导致撕裂。
    7. 将标本板移入缓冲托盘，以正确的角度将刀片移动到位，并增加缓冲盘高度，使刀片尽可能靠近大脑。
    8. 以 0.20 mm / s 的速度以 300 μm 的间隔切片 HC 和 OB 组织，然后在每次切片后用玻璃巴斯德移液管收集它们。
    9. 将切片留在充满aCSF的回收室中，在32°C水浴中放置45分钟，然后在室温下放置1小时。
      注意：确保保持所有溶液和任何提及的含有溶液的腔室的连续碳化。压力调节器可用于维持一致的碳化。

2. 基于HD-MEA的 体外 人类iPSC神经元网络

注意：本研究中使用的所有iPSC神经元都是商业获得的（参见 材料表）。这些人细胞从源自人外周血或成纤维细胞的稳定 iPS 细胞系分化而来。

  1. 用于 体外 人iPSC细胞培养的HD-MEA芯片包被（图2B）
    1. 将HD-MEA芯片放在采集记录平台上，用PBS填充储液罐，并在涂层前测试芯片。启动 Brainwave 软件。选择 “文件”>“新建录制会话”。将记录参数设置为记录 频率 为 50 Hz， 采样频率 为 18 kHz/电极。更改 放大器偏移 以校准芯片。有关故障排除提示，请参阅 表 2 。
      注意：记录频率和采样频率参数将取决于数据类型和各个系统要求。
    2. 对HD-MEA进行灭菌和预处理。
      1. 在引擎盖下，用用96%乙醇（EtOH）润湿的组织擦拭芯片和玻璃环，然后将每个设备放入无菌的100mm×20mm培养皿中，并用70%EtOH填充MEA储液器20分钟。
      2. 吸入 EtOH 并用无菌过滤的 dd-水清洗储液罐 3 次。加入 1 mL 预处理培养基，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜。
        注意：预处理介质需要是盐基溶液，以使HD-MEA表面更具亲水性。这可以包括先前制备的 BrainPhys （BP） 完全培养基（不是 >3 个月大）（表 1C）。
    3. 涂覆 HD-MEA。第二天，吸出预处理介质。加入 1 mL 0.1 mg/mL 聚-dl-鸟氨酸 （PDLO） 以覆盖整个活性区域。在37°C下在培养箱中孵育过夜。
    4. 准备培养基并将其加热到室温。这里的方案利用了来自两个商业来源的功能性人类iPSC神经元;因此，每个供应商的介质组件各不相同。（表1C，D）中描述了一种协议。
    5. 吸出 PDLO，用 dd-水洗涤 3 次，让薯片在引擎盖下干燥 10 分钟。
    6. 用无菌过滤的dd-水填充35 mm x 10 mm培养皿，并将其放在芯片旁边，以保持适当的湿度，并避免接种细胞在接下来的步骤中蒸发。
  2. HD-MEA中人iPSC神经元的电镀和维持（图2B）
    1. 每微升浓度（即 1000 个细胞/μL 以在 HD-MEA 上滴 50 μL 获得 50,000 个细胞密度）解冻并稀释至所需细胞（表 1C）。
    2. 使用高层粘连蛋白点介质将细胞悬浮液移液到芯片活性区域表面（表1D）。
    3. 在37°C与5%CO2孵育45-60分钟。
    4. 在HD-MEA储液槽中轻轻填充2 mL培养基（表1C）。
    5. 使用RT培养基在接种后第1天（DIV1）进行100%培养基更换（表1C）。每 3-4 天更换 50% 的培养基。在整个实验过程中，将HD-MEAs保持在37°C下与5%CO2 一起孵育。
      注意： 轻轻移液以避免细胞脱落。检查介质的颜色是否有任何污染。培养基更换的间隔和量可以通过单个研究问题或细胞需求/规格来确定。
    6. 可选：用 >70% EtOH 清洁载物台后，在正置微分干涉对比 （DIC） 显微镜下检查 DIV4-DIV8 之间的细胞培养生长进展。

3. 使用HD-MEA进行体 外 和 体外 大规模神经记录

  1. 脑切片记录工作区的准备（图2A）
    1. 在脑切片恢复时，将所需的工具放置在每个指定的工作区中（参见 材料表）。
      注意：必须在脑切片实验日之前对主系统设置进行优化和测试。灌注系统（入口管路、泵出口管路、管道和接地）需要在记录平台上使用 PBS 或 aCSF 和 HD-MEA 进行测试，以确保信号干净、信噪比增加和没有灌注噪声。
    2. 用0.1mg / mL的PDLO涂覆HD-MEA芯片以增强组织 - 芯片偶联，并在37°C孵育20分钟。
    3. 在芯片孵育期间，用记录的 aCSF 填充基于重力的灌注系统和管系。确保灌注系统的连续碳化。设置流速为 4.5 mL/min，温度为 37 °C。
    4. 将 HD-MEA 芯片放在采集记录平台上，用 aCSF 填充储液槽，测试灌注系统，并排除任何残留的系统噪声。
      1. 启动 Brainwave 软件。选择 文件>新建录制会话。将记录参数设置为记录 频率 为 1 Hz， 采样频率 为 14 kHz/电极。更改 放大器偏移 以校准芯片。有关故障排除提示，请参阅 表 2 。
        注意：记录频率和采样频率参数将取决于数据类型和各个系统要求。
    5. 通过房间照明系统或光学台上的阴影笼子确保记录区域是黑暗的。
    6. 将体视显微镜与HD-MEA芯片存储器和有效区域对齐，以进行图像采集。
    7. 将锚栓放入芯片储液器中进行平衡。
      注意： Anchor 是一种定制的铂金竖琴，具有最少的电线以促进氧合;但是，有一些商业的。
    8. 将药理学化合物加入适当的灌注管中。
      注意：在该方案中，如前所述，获得了自发和100μM 4-氨基吡啶（4-AP）药理学诱导的记录。药理学化合物可以根据特定的研究问题进行定制。
    9. 在脑切片制备工作区中，将一个新的 90 mm 塑料培养皿放入 150 mm 玻璃培养皿中。加入 aCSF 并开始碳化。
  2. 使用 HD-MEA 从 HC 和 OB 切片进行全电路录制
    注意：切片耦合应尽快进行，以避免切片缺氧。从将显微解剖切片初始放置在芯片活性区域到最终灌注系统启动，偶联只需 ~1 分钟。
    1. 用玻璃移液管将切片从脑切片恢复室中取出，并将其放入连续碳化的 90 mm 塑料培养皿中。使用显微解剖工具，将HC或OB与周围的脑切片组织分离。
    2. 用玻璃移液管将分离的HC或OB急性切片移至HD-MEA储液槽中。用细刷轻轻对准 MEA 活动区域上的切片。使用抽吸系统从 HD-MEA 芯片中吸出所有溶液。
    3. 用镊子将锚轻轻地放在切片的顶部。
      注意： 锚栓放置时应不切片移动，以免失去联轴器。
    4. 轻轻地将溶液加入芯片储液器中，然后启动灌注系统。
      注意： 确保来自灌注入口和泵出口的层流，以获得最佳记录参数。
    5. 确保通过房间照明系统或光学台设置上的阴影笼子将记录区域充分调暗。
    6. 在开始记录或额外的药理学调节之前，让切片适应 10 分钟。
    7. 启动 Brainwave 软件。选择 “文件”>“新建录制会话”。将记录参数设置为记录 频率 为 1 Hz， 采样频率 为 14 kHz/电极。更改 放大器偏移 以校准芯片。
      注意：如前面的第 3.1.4.1 节所述，在执行系统测试时，请确保应用这些相同的记录参数。
    8. 按 记录 以预设的实验条件开始采集。
    9. 在最终记录之后，立即捕获急性脑切片的光成像。将切片移回切片回收室，用刷子去除与切片耦合的任何有机材料，然后继续下一个切片。按照第 3.4 节中的说明清洁 HD-MEA。
  3. 在HD-MEA上准备人类iPSC记录工作区和全网记录（图2B）
    注意：在记录前一天或人 iPSC 记录后立即更换培养基（表 1C）。在使用功能神经元的研究中，每 4 天更换一次培养基，并在 4、8、16 和 24 上立即更换 iPSC 记录后的 DIV 培养基。
    1. 通过用 >70% 的 EtOH 清洁 HD-MEA 采集平台，确保无菌的工作环境。
    2. 轻轻地将聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 基帽放在引擎盖下方的 HD-MEA 环上。将 HD-MEA 芯片移至 iPSC 记录工作区，并将 HD-MEA 芯片连接到采集平台。
    3. 确保通过房间照明系统或光学桌上的阴影笼子将记录区域充分调暗。
    4. 在开始记录或额外的药理学调节之前，让 HD-MEA 芯片平衡 10 分钟。
    5. 启动 Brainwave 软件。选择 “文件”>“新建录制会话”。将记录参数设置为记录 频率 为 50 Hz， 采样频率 为 18 kHz/电极。更改 放大器偏移 以校准芯片。
      注意： 如前面第 2.1.1 节所述，在涂层和电镀之前执行系统测试时，请确保应用这些相同的记录参数。
    6. 记录 实验计划每天（即 4、8、16、24 个 DIV）来自人类 iPSC 网络的自发放电活动或药理学诱导的反应。
      注意：不要让芯片在培养箱外停留 >30 分钟，以保持稳定的温度和湿度，并防止对细胞产生任何温度冲击。
    7. 在实验过程中，在37°C下用5%CO2孵育HD-MEA。
    8. 实验完成后，将神经元网络固定在芯片上并染色以进行进一步的光学成像，或直接清洁HD-MEA，如步骤3.4所述。
  4. HD-MEA芯片的清洗
    1. 实验结束后，根据适当的废物处理丢弃溶液并用dd-water冲洗。
    2. 添加所选的清洁剂，用 Q 型喷嘴清洁有效区域和整个储液罐，然后丢弃清洁剂。重新装满洗涤剂，孵育 20 分钟，然后丢弃洗涤剂。
    3. 用实验室级水彻底冲洗。然后，用 dd-water 冲洗 3-4 次。
    4. 使用气压彻底干燥 HD-MEA 芯片。

4. HD-MEA的大规模神经记录分析

注意：虽然步骤 4.1 是特定于 Brainwave 软件的，但可以根据每个用户的商用 HD-MEA 设备类型修改步骤 4.2。

  1. 原始数据预处理和事件检测
    1. 在 Brainwave 软件中打开记录的原始数据文件 （.brw）。选择“ 分析”>“LFP 检测 ”或 “尖峰检测”。
      注意：LFP 检测采用 IIR 滤波和低通 4阶 巴特沃斯滤波器 （1-100 Hz）。硬阈值算法包括 150 μV 的高阈值、-150 μV 的低阈值、70-120 ms 的能量窗口、10 ms 的不应期和 1 s 的最大事件持续时间。单脉峰检测和 MUA 尖峰检测采用 IIR 滤波和高通 4阶 巴特沃斯滤波器 （300-3500 Hz）。应用 PTSD 算法的标准差因子为 8，峰值寿命周期为 2 ms，不应期为 1 ms。
    2. 对于 HC 和 OB 电路记录，请在检测到的事件文件 （.bxr） 中添加 “高级工作区 ”选项，以导入从体视显微镜捕获的结构光图像。在检查大规模 HC 回路时，创建包含齿状回 （DG）、肺门、角氨 1 （CA1）、角氨 3 （CA3）、内嗅皮层 （EC） 和鼻周皮层 （PC） 的结构层。在检查大规模产科回路时，创建包含嗅神经层 （ONL）、肾小球层 （GL）、外部丛状层 （EPL）、二尖瓣细胞层 （MCL） 和颗粒细胞层 （GCL） 的结构层。将 EPL 和 MCL 视为投射层 （PL），包括嗅觉皮层 （OCx）。
  2. 使用自定义 Python 计算管道进行数据处理
    1. 去噪
      1. 使用自定义编写的 Python 脚本26、29、32 和 h5py 3.6.0 python 包读取 .bxr 文件。
      2. 提取与 iPSC 网络记录相关的尖峰序列以及与 HC 和 OB 脑切片电路记录相关的 LFP 事件序列。
      3. 将每个平均事件的有源电极总数小于平均有源电极的 0.1% 或 10% 的事件或检测到的事件超出统计上合理的发射速率范围的事件表征为随机事件并删除它们。此外，应用振幅和事件持续时间阈值。
        注意：对于射速范围，考虑 0.1-15 峰值/秒和 0.1-60 LFP 事件/分钟。这些是用于分析数据集的示例速率阈值。速率、振幅和持续时间阈值将取决于单个数据。
      4. 以 .npy 文件格式保存生成的事件训练数据以及随附的时空信息。
    2. 光栅图
      1. 读取筛选的事件 .npy 和 .bxr 文件，并使用 Matplotlib pyplot 函数 （https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html） 生成栅格图。
      2. 此外，对于具有层特异性的脑切片记录，根据步骤 4.1.2 中生成的层对电极 ID 进行排序和分组。
    3. 平均烧发活动
      1. 处理 .bxr 文件中的时间序列数据，计算每个电极的平均点火速率（事件数/记录时间）。
      2. 构建一个数据矩阵，其中行和列表示 HD-MEA 64 x 64 阵列中电极的坐标，其中每个矩阵值表示平均发射速率。
      3. 在 Python 中使用绘图库，例如 Matplotlib 的 imshow 或 Seaborn 的热图函数。
      4. 在这里使用“热”色图，创建一个信息丰富的热图，直观地封装了整个电极阵列中平均发射速率的空间分布。
    4. 具有代表性的波形迹线
      1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并使用 Matplotlib pyplot 函数生成波形跟踪。（https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html）。
      2. 输入所需的电极ID、时间箱和频带，以获得具有代表性的波形迹线。这些分析中定义的频带包括低频LFP振荡（1-100 Hz），带通滤波δ、θ、β和γ频段;尖锐波纹 （SWR） （140-220 Hz）;以及高频单频和 MUA （300-3500 Hz）。频段 δ、θ、β 和 γ 分别为 1-4 Hz、5-12 Hz、13-35 Hz 和 35-100 Hz。
    5. 功率谱密度
      1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据并计算周期图，以辨别每个时间序列中振荡活动背后的主频率。
      2. 构建频率-时间动态的伪彩色频谱图。
        注：频谱是使用 Welch 方法计算的，方法是利用记录的 LFP 的快速傅里叶变换来估计频谱功率密度41。
      3. 输入所需的电极 ID、时间箱和频带以绘制光谱密度图。这些分析中定义的频段包括步骤4.2.4中描述的频段。
    6. 功能连接
      1. 对于脑切片电路记录，请按照步骤 4.2.6.2-4.2.6.4 操作。
      2. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并使用 Pearson 相关系数 （PCC）42 计算 64 x 64 阵列中有源电极对之间的交叉协方差。
      3. 使用多元格兰杰因果关系将向量自回归模型拟合到时间序列，以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响。
      4. 应用定向传递函数 （DTF） 来评估相关链路内的方向信息流。
        注：多层网络中的功能连通性是通过设置相关值阈值来建立的，该阈值基于所有交叉协方差值 43,44 的均值和两个标准差。
      5. 对于iPSC记录，请按照步骤4.2.6.6-4.2.6.8操作。
      6. 从 .bxr 文件中读取尖峰列车数据，并使用spike_train_correlation函数 （https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html） 计算所有分箱棘标列车组合之间的 PCC 相关系数矩阵。
        注：多层网络中的功能连通性是通过设置基于所有交叉协方差值的均值和两个标准差的相关值阈值来建立的。
      7. 此外，在连通性矩阵上实施时空滤波器 （STF） 和距离相关延迟阈值 （DdLT） 滤波程序，以消除超过最大传播速度（设置为 400 mm/s）45 的潜在配对连接。
      8. 使用滤波和阈值操作从生成的互相关矩阵中提取负峰，以使用滤波和归一化互相关直方图 （FNCCH） 算法45 识别抑制性连接。
      9. 将每个连通性矩阵转换为动态图形 （.gexf） 文件。
    7. 网络连接图
      1. Gephi 程序 9.2 版本 （https://gephi.org） 中的开放 数据实验室 ，用于绘制特定时间条柱的动态图。
      2. 在布局窗口中应用 地理布局 以进行空间制图。
      3. 在 “度范围”（Degree Range ） 和 “边权重”（Edge Weight ） 上放置参数约束以进行比较。
      4. 指定 节点颜色、边大小 和 度大小 以获得更好的可视化效果。

代表性结果

振荡点火特征的多模式时空映射与提取
为了量化从动态神经元集合中出现的全网络LFP和尖峰事件，我们研究了HC和OB电路以及人类iPSC网络中的同步大规模放电模式。根据协议的步骤 4.1-4.2 分析了步骤 3.2 中记录的脑切片电路和步骤 3.3 中记录的 iPSC 网络。首先，对所有记录的数据集进行事件检测和去噪，并根据电路规格进行区域分辨。接下来，绘制了平均大尺度LFP和尖峰发射模式的地形伪彩色空间映射、检测到的事件的栅格图以及滤波波形的代表性5-s轨迹（图3 A-I）。大规模LFP和尖峰发射速率模式的地形伪彩色映射叠加在HC（图3A），OB（图3B）和人类iPSC神经元网络（图3C）的显微镜捕获的光学图像上。这允许研究单个电路和基于网络的振荡模式和响应。HC 和 OB 光栅图包含检测到的 LFP 事件计数，这些事件计数在 60 秒的时间箱内在 HC 电路的 DG、Hilus、CA3、CA1、EC 和 PC 层以及 OB 网络的 ONL、OCx、GL、PL 和 GCL 层上排序（图 3D、E）。人类 iPSC 光栅图显示 20 秒时间箱内互连培养网络的同步检测到的尖峰事件（图 3G）。接下来，来自大规模 HD-MEA 记录站点的 5s 代表性事件迹线显示了 HC（即 CA3 中的选定电极）（图 3G）和 OB（即 GL 中的选定电极）（图 3H）电路中记录的振荡频率范围，以及阵列中四个选定有源电极的人 iPSC 网络中的多单元尖峰爆发活动（图 3I）).这些示例信号显示了生物信号特征，包括带通滤波δ、θ、β和γ频带的低频LFP振荡（1-100 Hz）;尖锐波纹 （SWR） （140-220 Hz）;以及高频单频和 MUA （300-3500 Hz）。最后，采用功率谱密度（PSD）分析，同时量化HD-MEA记录的互连HC和OB电路中特定振荡带的功率幅度（图3J，K）。

多模态全网功能连接组
为了从同时激活的神经元集合的同步发射模式推断多层神经网络的大规模连接，根据协议的步骤 4.2.6 计算了检测到的事件中活动电极对之间的交叉协方差。在这里，相关系数根据 HC 和 OB 电路中的层进行排序，或在 iPSC 网络中未排序，然后存储在对称矩阵中。通过应用多变量格兰杰因果关系和定向传递函数（DTF）来量化一个时间序列对另一个时间序列的影响，并评估不同网络中相关链接内的方向信息流，从而生成了HC和OB电路的功能连接组。HC（图4A）和OB的连接组映射（图4B）和网络可视化使用Gephi程序9.2版本（https://gephi.org）进行。在功能链接上放置了类似的参数约束，以比较 HC 和 OB 脑切片电路，并说明了检测到的 LFP 事件的 100 秒功能连接。节点根据度强度进行缩放，节点颜色指示层和链接颜色，用于标识层内和层间连接。通过应用时空滤波器（STF）和距离依赖性潜伏阈值（DdLT）来生成人类iPSC网络的功能连接组，以增强重要链接的选择，并通过应用滤波和归一化互相关直方图（FNCCH）分析来完善有意义连接的识别。使用Gephi在整个HD-MEA芯片上执行人类iPSC网络的连接组映射（图4C）可视化。节点颜色表示兴奋性或抑制性输入，链接颜色表示连接。

figure-representative results-2008
图1：大规模HD-MEA的实验和计算平台概述。 （A） 使用基于CMOS的HD-MEA实现的多模态生物混合神经电子平台的等距示意图，以捕获来自HC、OB和人类iPSC神经元回路和网络的神经动力学。（B） 小鼠脑切片的工作原理图及其获得 HC 和 OB 切片的工作场景。（C） 从整个 HC 和 OB 切片与提取的细胞外波形叠加到切片光学图像上同时记录的大规模发射模式的形貌表示。（D） 从人类获得的 iPSC 神经元网络示意图。（E） 荧光显微照片显示 HD-MEA 芯片上整个人类神经元网络的细胞 c-fos 和体细胞/树突状 MAP-2（左）与整个平均放电活动图（右）相匹配。（F） 计算框架，包括高级数据分析、连接映射和人工智能机器学习工具，用于分析从HD-MEA上的大规模记录中获得的多维神经数据。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2： 离体 脑切片和 体外 人 iPSC 培养制备和记录工作区的布局。 （A） 工作流程示意图，说明准备 HC 和 OB 切片的设置，包括每个工作区中必要的工具和设备。（B） 人iPSC培养物制备的示意图，包括必要的工具和设备。完整的材料清单包含在步骤 1.2.2、2.1、2.2、3.1.1、3.3 和 材料表中。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3：绘制和提取网络动力学的时空模式。 （A-C） 平均LFP和尖峰率空间图，在五分钟的记录中计算，叠加在显微镜光图像上。（D-F）栅格图描绘了 60 秒数据子样本中检测到的去噪 LFP 事件和 20 秒数据子样本中的峰值。（G-I）从栅格图数据子样本的 5 秒段（在栅格图中突出显示为红色）中提取代表性波形迹线，显示为原始 LFP 振荡带 （1-100 Hz）;δ （1-4 Hz）、θ （5-12 Hz）、β （13-35 Hz） 和 γ （35-100 Hz） 频段;驻波比（140-220赫兹）;以及高频单频和 MUA 尖峰 （300-3500 Hz）。（J，K）快慢振荡LFP（1-100 Hz）和SWR（140-220 Hz）的功率谱密度图。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4：多模态网络功能连接组的组织。（A-C） Gephi 地图说明了节点功能连通性，其中节点对应于示例颜色条图例之一（如下图），而链接（或边）则被着色以匹配连接节点。（A） HC、（B） OB 和 （C） iPSC 层的示例图例显示在 64 x 64 阵列上。HC 和 OB 层在 100 秒的时间箱内绘制，以有效减少可见节点和链接的数量，以实现可视化目的。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1：用于 iPSC 神经元培养物的脑切片制备和培养基的解决方案。 （A）用于离体脑切片制备的高蔗糖切割液。（B）用于离体脑切片制备和记录的aCSF记录解决方案。（C-D）人神经元 iPSC 培养基实验方案，其中 （C） 是用于细胞解冻、HD-MEA 芯片包被和培养的 HD-MEA 维持的 BrainPhys 完整培养基，以及 （D） 用于 HD-MEA 细胞接种的点状培养基。请按此下载此表格。

表 2：常见 HD-MEA 录制采集问题疑难解答。 与HD-MEA芯片、录制平台、系统噪声和软件相关的常见问题、潜在原因和故障排除解决方案列表。 请按此下载此表格。

讨论

从相互连接的神经元集合中出现的时空神经元活动的复杂动力学长期以来一直是神经科学中感兴趣的主题。传统方法，如膜片钳、标准 MEA 和 Ca2+ 成像，为大脑复杂性提供了宝贵的见解。然而，它们往往无法捕获全面的全网络计算动态21,22,23。正如本JoVE研究中详述的那样，HD-MEA平台的技术方案代表了一次重大飞跃，提供了从细胞组装到扩展网络（即急性离体小鼠脑切片和体外人类iPSC网络）的神经动力学的全景图26,29,30,32。

急性离体小鼠脑切片一直是神经元研究的基础工具，促进了分子和电路水平的研究6,7。然而，维持组织活力的挑战一直是一个持续的瓶颈。本研究中描述的协议引入了关键修改，以优化这些切片的质量和寿命，以利用它们在 HD-MEA 平台上的优势。该协议强调了 - i） 实现切片均匀性的重要性，尽管需要更长的切片时间，但使用振动切片机比组织切碎机更受欢迎，因为它的精度和最小的组织损伤。ii） 确保从提取到记录的整个过程中持续的碳化，以保持组织活力。iii） 在记录前调节温度并留出足够的恢复时间。iv） 利用琼脂糖块或模具来稳定大脑，防止撕裂，并尽量减少胶水接触。v） 在HD-MEA储液槽内保持碳化aCSF的最佳流速，以确保切片健康，同时避免解耦、噪音和漂移等问题（表2）。

对于小鼠脑切片和人 iPSC 制剂，增强电极-组织界面耦合至关重要 30,46,47。我们的方案强调了利用粘附促进分子聚-dl-鸟氨酸（PDLO）的重要性。该分子不仅增加了检测电信号的表面积，而且还提高了电导率46。通过这样做，它促进了细胞粘附、生长和功能网络特性的发展。这种优化在提高HD-MEA平台的功效方面起着关键作用。这反过来又确保了对微尺度离体和体外连接组及其时空放电序列的准确和一致的分析。值得注意的是，PDLO已被证明在促进神经元培养物中的自发放电活性和对电刺激的反应方面优于其他底物，如聚乙烯亚胺（PEI）和聚-l-鸟氨酸（PLO）。此外，PDLO还被用于HD-MEA的表面功能化，并被证明可以增强电极-切片耦合界面，并提高OB和HC切片的信噪比26,29。定制铂锚的加入进一步增强了电极-切片界面耦合，从而使记录具有更高的信噪比。

将HD-MEA用于离体小鼠脑切片和体外人类iPSC网络，引入了一种擅长探索广泛、多尺度和多模态动力学的方法。然而，这种创新方法带来了相当大的挑战，特别是在数据管理方面48,49,50,51。以 18 kHz/电极采样频率采集的单个 HD-MEA 记录可生成惊人的 155 MB/s 数据。当考虑到多个切片、不同的药理学条件或较长的记录周期时，数据量会迅速增加。这种信息的涌入需要强大的存储基础架构和先进的计算工具来简化处理。HD-MEA平台能够同时从数千个神经元集合中收集数据，这既是一个福音，也是一个障碍。它为大脑功能的计算动力学提供了至高无上的见解，但它也需要一个精致的分析框架。在这个JoVE协议中，我们提供了计算策略的例子，包括大规模事件检测、分类、图论、频率分析和机器学习。这些方法强调了为应对分析复杂神经数据的挑战而做出的大量努力。尽管如此，开发更先进的计算工具来分析这些多维神经数据集仍有相当大的空间。有了适当的工具和方法，HD-MEA平台的潜力被放大，为健康和病理条件下大脑功能的复杂性提供了深刻的见解。

从本质上讲，HD-MEA平台与所讨论的详细协议和计算工具集成在一起时，为理解大脑的复杂工作提供了一种变革性的方法。通过捕获大规模、多尺度和多模态动态，它提供了对学习、记忆和信息处理等过程的宝贵见解。此外，它在体外人类iPSC网络中的应用有可能彻底改变药物筛选和个性化医疗。然而，虽然这个平台代表了神经科学研究的重大进步，但承认和解决固有的技术挑战至关重要。随着先进计算工具的不断完善和集成，HD-MEA平台有望开创一个精确诊断工具、特定生物标志物识别和神经系统疾病靶向治疗的新时代。

披露声明

作者声明没有竞争或经济利益。

致谢

这项研究得到了机构基金 （DZNE）、亥姆霍兹验证基金 （HVF-0102） 内亥姆霍兹协会和德累斯顿国际生物医学和生物工程研究生院 （DIGS-BB） 的支持。我们还要感谢德累斯顿DZNE的行为动物试验平台（Alexander Garthe、Anne Karasinsky、Sandra Günther 和 Jens Bergmann）的支持。我们要确认，图 1 的一部分是使用平台 BioRender.com 创建的。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
150 mm Glass Petri DishgenericgenericBrain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
0.22 μm Sterile Filter Unit AssortedAssortedAssorted
90 mm Plastic Culture DishTPP93100Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
AgaroseRoth6351.5Brain Preparation Workspace
Agarose MoldCUSTOMCUSTOMBrain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Aluminum FoilgenericgenericBrain Extraction Workspace
Anesthesia chambergenericgenericBrain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc
Ascorbic AcidSigma AldrichA4544-25GSolution Preparation Workspace
Assorted BeakersgenericgenericSolution Preparation Workspace; 50 mL
Assorted LuersCole Parmer45511-00Brain Slice Recording Workspace
Assorted Volumetric flasksgenericgenericSolution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L
B27 SupplementLife Technologies17504-044BrainXell Commercial Supplier Protocol
BDNFPeprotech450-02BrainXell Commercial Supplier Protocol
Biological Safety Cabinet with UV LampAssortedAssortedHD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
BrainPhys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol
Brainwave Software3Brain AGVersion 4Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay BrainXell BX-0300 BrainXell Commercial Supplier Protocol
CaCl2Sigma Aldrich21115-100MLSolution Preparation Workspace
CarbogengenericgenericAll Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture
Cell Culture Incubator AssortedAssortedAssorted
CMOS-based HD-MEA chip3Brain AGCUSTOMBrain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) STEMCELL Technologies 38010 CDI Commerical Supplier Protocol
Crocodile Clip Grounding CablesJWQIDIB06WGZG17WBrain Slice Recording Workspace
Curved ForcepsFST11052-10Brain Extraction Workspace
DMEM/F12 MediumLife Technologies 11330-032BrainXell Commercial Supplier Protocol
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS)STEMCELL Technologies 37350 CDI Commerical Supplier Protocol
Filter PaperMacherey-Nagel531 011Brain Preparation Workspace
Fine BrushLeonhardy773Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
ForcepsVITLAB67895Brain Slice Recording Workspace
GDNFPeprotech450-10BrainXell Commercial Supplier Protocol
GeltrexLife TechnologiesA1413201BrainXell Commercial Supplier Protocol
Glass pasteur pipetteRoth4518Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
GlucoseSigma AldrichG7021-1KGSolution Preparation Workspace
GlutaMAXLife Technologies35050-061BrainXell Commercial Supplier Protocol
Gravity-based Perfusion SystemALAVC3-8xGBrain Slice Recording Workspace
HD-MEA Recording platform3Brain AGCUSTOMBrain Slice and Human iPSC Recording Workspace
HeaterWarner InstrumentsTC-324CBrain Slice Recording Workspace
Hemocytometer or Automated Cell CounterAssortedAssortedHD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Hypo NeedlesWarner Instruments641489Brain Slice Recording Workspace
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 CDIR1061 CDI Commerical Supplier Protocol
Iris ScissorsVantageV95-304Brain Extraction Workspace
IsofluraneBaxterHDG9623Brain Extraction Workspace
KClSigma AldrichP5405-250GSolution Preparation Workspace
Laminin Sigma-Aldrich L2020 CDI Commerical Supplier Protocol
Liquid Nitrogen Storage Unit AssortedAssortedHD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Magnetic StirrergenericgenericSolution Preparation Workspace
Metal ScrewsThorlabsHW-KIT2/MBrain Slice Recording Workspace
MgCl2Sigma AldrichM1028-100MLSolution Preparation Workspace
MgSO4Sigma Aldrich63138-250GSolution Preparation Workspace
Microdissection Tool Holder Braun4606108VBrain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Microdissection Tool NeedleBraun 9186166Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Modular StereomicroscopeLeicaCUSTOMBrain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications
N2 SupplementLife Technologies17502-048CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol
NaClSigma AldrichS3014-1KGSolution Preparation Workspace
NaH2PO4Sigma AldrichS0751-100GSolution Preparation Workspace
NaHCO3Sigma AldrichS5761-500GSolution Preparation Workspace
Neurobasal Medium Life Technologies21103-049BrainXell Commercial Supplier Protocol
Optical Cage SystemThorlabsAssortedBrain Slice Recording Workspace
Optical Table w/BreadboardThorlabsSDA7590Brain Slice Recording Workspace
PDLOSigma AldrichP0671HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace
Penicillin-streptomycin, 100x Thermo Fisher Scientific 15140-122 CDI Commerical Supplier Protocol
Pipette tipsTipONES1120-8810Brain Slice Recording Workspace
Pipettors AssortedAssortedAssorted
Platinum AnchorCUSTOMCUSTOMBrain Slice Recording Workspace
Polyethylene TubingAssortedAssortedBrain Slice Recording Workspace
PumpMasterFlex78018-22Brain Slice Recording Workspace
Razor BladeApollo10179960Brain Preparation Workspace
Reference Electrode Cell Culture CapCUSTOMCUSTOMHuman iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Rubber Pipette BulbDuran Wheaton Kimble292000205Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mLAssortedAssortedAssorted
Slice Recovery ChamberCUSTOMCUSTOMBrain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
SpatulaISOLAB047.06.150Brain Preparation Workspace
SucroseSigma Aldrich84100-1KGSolution Preparation Workspace
Super GlueUHU358221Brain Slice Preparation Workspace
Surgical ScissorsPeters InstrumentsBC 344Brain Extraction Workspace
Tabletop Centrifuge AssortedAssortedAssorted
TGF-β1Peprotech100-21CBrainXell Commercial Supplier Protocol
Tissue PapergenericgenericBrain Extraction Workspace
Trypan BlueSTEMCELL Technologies 07050 CDI Commerical Supplier Protocol
Upright MicroscopeOlympusCUSTOMImaging Workspace; Custom specifications and modifications
VacusipIntegra159010Brain Slice Recording Workspace
VibratomeLeicaVT1200sBrain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool
Vibratome BladePersonnaN/ABrain Slice Preparation Workspace
Water BathLaudaL000595Brain Slice Recovery Workspace

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