כאן, אנו משתמשים ב- HD-MEA כדי להתעמק בדינמיקה חישובית של הרכבים עצביים בקנה מידה גדול, במיוחד בהיפוקמפוס, מעגלי פקעות ריח ורשתות נוירונים אנושיות. לכידת פעילות מרחבית-זמנית, בשילוב עם כלים חישוביים, מספקת תובנות לגבי מורכבות ההרכב העצבי. השיטה משפרת את ההבנה של תפקודי המוח, ועשויה לזהות סמנים ביולוגיים וטיפולים להפרעות נוירולוגיות.
רשתות עצביות בקנה מידה גדול והמיקרו-מעגלים המבוזרים המורכבים שלהן חיוניים ליצירת תפיסה, קוגניציה והתנהגות הנובעות מדפוסים של פעילות עצבית מרחבית-זמנית. דפוסים דינמיים אלה הנובעים מקבוצות תפקודיות של הרכבים עצביים מקושרים מאפשרים חישובים מדויקים לעיבוד וקידוד מידע עצבי בקנה מידה רב, ובכך מניעים תפקודי מוח גבוהים יותר. כדי לחקור את העקרונות החישוביים של דינמיקה עצבית העומדת בבסיס מורכבות זו ולחקור את ההשפעה הרב-ממדית של תהליכים ביולוגיים בבריאות ובמחלות, הקלטות סימולטניות בקנה מידה גדול הפכו לאינסטרומנטליות. כאן, מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEA) משמש לחקר שתי שיטות של דינמיקה עצבית - מעגלי פקעות ההיפוקמפוס וחוש הריח מפרוסות מוח של עכבר ex-vivo ורשתות עצביות מתרביות תאים במבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs). פלטפורמת HD-MEA, עם 4096 מיקרואלקטרודות, מאפשרת הקלטות לא פולשניות, מרובות אתרים, נטולות תוויות של דפוסי ירי חוץ-תאיים מאלפי הרכבים עצביים בו זמנית ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. גישה זו מאפשרת אפיון של מספר תכונות אלקטרופיזיולוגיות ברחבי הרשת, כולל דפוסי פעילות דוקרנים יחידים/מרובי יחידות ותנודות פוטנציאליות בשדה המקומי. כדי לבחון נתונים עצביים רב-ממדיים אלה, פיתחנו מספר כלים חישוביים המשלבים אלגוריתמים של למידת מכונה, זיהוי וסיווג אירועים אוטומטיים, תורת הגרפים וניתוחים מתקדמים אחרים. על ידי השלמת צינורות חישוביים אלה עם פלטפורמה זו, אנו מספקים מתודולוגיה לחקר הדינמיקה הגדולה, הרב-ממדית והרב-מודאלית ממכלולי תאים לרשתות. זה עשוי לקדם את ההבנה שלנו של תפקודי מוח מורכבים ותהליכים קוגניטיביים בבריאות ובחולי. מחויבות למדע פתוח ותובנות לגבי דינמיקה עצבית חישובית בקנה מידה גדול יכולה לשפר מודלים בהשראת המוח, מחשוב נוירומורפי ואלגוריתמים של למידה עצבית. יתר על כן, הבנת המנגנונים הבסיסיים של חישובים עצביים לקויים בקנה מידה גדול ודינמיקת המיקרו-מעגלים המקושרים ביניהם עשויה להוביל לזיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים, ולסלול את הדרך לכלי אבחון מדויקים יותר ולטיפולים ממוקדים להפרעות נוירולוגיות.
הרכבים עצביים, המכונים לעתים קרובות מכלולי תאים, הם מרכזיים בקידוד עצבי, ומאפשרים חישובים מורכבים לעיבודמידע עצבי בקנה מידה 1,2,3. הרכבים אלה עומדים בבסיס היווצרותן של רשתות נוירונים נרחבות והמיקרו-מעגלים הניואנסיים שלהן4. רשתות כאלה ודפוסי התנודה שלהן מניעים תפקודי מוח מתקדמים, כולל תפיסה וקוגניציה. בעוד מחקר מקיף בחן סוגים עצביים ספציפיים ומסלולים סינפטיים, הבנה עמוקה יותר של האופן שבו נוירונים יוצרים בשיתוף פעולה הרכבות תאים ומשפיעים על עיבוד מידע מרחבי-זמני בין מעגלים ורשתות נותרה חמקמקה5.
פרוסות מוח חריפות ואקס-ויו הן כלים אלקטרופיזיולוגיים מרכזיים לחקר מעגלים עצביים שלמים, המציעות סביבה מבוקרת לבדיקת דפוסי פעילות תנודתית של תפקוד עצבי, שידור סינפטי וקישוריות, עם השלכות בבדיקות פרמקולוגיות ובמודלים של מחלות 6,7,8. פרוטוקול מחקר זה מדגיש שני מעגלים מרכזיים במוח - ההיפוקמפוס-קליפת המוח (HC) המעורבת בתהליכי למידה וזיכרון 9,10, ופקעת הריח (OB) האחראית להבחנה בריח 11,12,13. בשני האזורים האלה, נוירונים תפקודיים חדשים נוצרים ברציפות על-ידי נוירוגנזה בוגרת לאורך כל החיים במוחות של יונקים14. שני המעגלים מדגימים דפוסי פעילות עצבית דינמית רב-ממדית ופלסטיות מובנית המשתתפים בחיווט מחדש של הרשת העצבית הקיימת ומאפשרים אסטרטגיות עיבוד מידע חלופיות בעת הצורך15,16.
מודלים חריפים של פרוסות מוח ex-vivo הם הכרחיים להתעמקות בתפקוד המוח ולהבנת מנגנוני מחלה ברמת המיקרו-מעגל. עם זאת, תרביות תאים חוץ-גופיות שמקורן ברשתות עצביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מציעות אפיק מבטיח של מחקר תרגומי, המקשר בצורה חלקה בין ממצאים מניסויים בבעלי חיים לטיפול קליני פוטנציאלי בבני אדם17,18. בדיקות מבחנה אלה הממוקדות בבני אדם משמשות פלטפורמה אמינה להערכת רעילות פרמקולוגית, מאפשרות סינון תרופות מדויק, ומקדמת מחקר באסטרטגיות טיפוליות חדשניות מבוססות תאים19,20. מתוך הכרה בתפקיד המרכזי של המודל העצבי iPSC, הקדשנו את המודול השלישי של מחקר פרוטוקול זה כדי לחקור ביסודיות את המאפיינים הפונקציונליים של הרשתות הנגזרות ממנו ולכוונן את פרוטוקולי תרביות התאים הקשורים.
מודולים עצביים אלקטרוגניים אלה נחקרו בדרך כלל באמצעות טכניקות כמו סידן (הדמיית Ca2+), רישומי מהדק טלאי ומערכי מיקרואלקטרודות בצפיפות נמוכה (LD-MEA). בעוד שהדמיית Ca2+ מציעה מיפוי פעילות של תא יחיד, זוהי שיטה מבוססת תיוג תאים המעוכבת על ידי הרזולוציה הטמפורלית הנמוכה שלה והאתגרים בהקלטות ארוכות טווח. LD-MEAs חסרים דיוק מרחבי, בעוד שמהדק טלאי, בהיותה טכניקה פולשנית באתר יחיד ומייגעת, מניבה לעתים קרובות שיעור הצלחה נמוך 21,22,23. כדי להתמודד עם אתגרים אלה ולחקור ביעילות פעילות ברחבי הרשת, הקלטות עצביות סימולטניות בקנה מידה גדול התפתחו כגישה מרכזית להבנת העקרונות החישוביים של דינמיקה עצבית העומדת בבסיס מורכבות המוח והשלכותיהם על בריאות ומחלות24,25.
בפרוטוקול JoVE זה, אנו מדגימים שיטת הקלטה עצבית בקנה מידה גדול המבוססת על MEA (HD-MEA) בצפיפות גבוהה ללכידת פעילות עצבית מרחבית-טמפורלית בשיטות מוח שונות, כולל מעגלי פקעות בהיפוקמפוס ובפקעות הריח מפרוסות חדות במוח עכבר ex-vivo (איורים 1A-C) ורשתות נוירונים אנושיות שמקורן במבחנה iPSC (איורים 1D-E), שדווחו בעבר על-ידי הקבוצה שלנו ועמיתים אחרים26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. ה-HD-MEA, הבנוי על טכנולוגיית מוליכים למחצה (CMOS) משלימים של מתכת-תחמוצת-תחמוצת, מתגאה במעגלים חשמליים על שבב ובהגברה, המאפשרים הקלטות של תת-אלפיות השנייה על פני מערךשל 7 מ"מ בגודל2 בגודל 36. גישה לא פולשנית זו לוכדת דפוסי ירי חוץ-תאיים מרובי אתרים, נטולי תוויות, מאלפי הרכבים עצביים בו זמנית באמצעות 4096 מיקרואלקטרודות ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, וחושפת את הדינמיקה המורכבת של פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) ופעילות דוקרנים רב-יחידתיים (MUA)26,29.
בהתחשב בהיקף הנתונים העצום שנוצר על ידי מתודולוגיה זו, מסגרת אנליטית מתוחכמת היא חיונית, אך מציבה אתגרים37. פיתחנו כלים חישוביים הכוללים זיהוי אירועים אוטומטי, סיווג, תורת הגרפים, למידת מכונה וטכניקות מתקדמות אחרות (איור 1F)26,29,38,39. בשילוב HD-MEA עם כלים אנליטיים אלה, פותחה גישה הוליסטית כדי לחקור את הדינמיקה המורכבת ממכלולי תאים בודדים לרשתות עצביות רחבות יותר על פני שיטות עצביות מגוונות. גישה משולבת זו מעמיקה את אחיזתנו בדינמיקה החישובית בתפקודי מוח נורמליים ומציעה תובנות לגבי אנומליות הקיימות בתנאים פתולוגיים28. יתר על כן, תובנות מגישה זו יכולות להניע התקדמות במודלים בהשראת המוח, מחשוב נוירומורפי ואלגוריתמים של למידה עצבית. בסופו של דבר, שיטה זו טומנת בחובה הבטחה בחשיפת מנגנוני הליבה מאחורי שיבושים ברשת העצבית, זיהוי פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים, והנחיית יצירת כלי אבחון מדויקים וטיפולים ממוקדים למצבים נוירולוגיים.
כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות האירופיות והלאומיות הרלוונטיות (Tierschutzgesetz) ואושרו על ידי הרשות המקומית (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).
1. פרוסות מוח Ex-vivo ממעגלי פקעות ההיפוקמפוס-קליפת המוח וחוש הריח ב-HD-MEA
2. רשת עצבית אנושית מבוססת iPSC במבחנה על HD-MEA
הערה: כל תאי העצב iPSC ששימשו במחקר זה מתקבלים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). תאים אנושיים אלה התמינו משורות תאי iPS יציבים שמקורם בדם היקפי אנושי או בפיברובלסטים.
3. הקלטות עצביות בקנה מידה גדול Ex-vivo ו - in-vitro עם HD-MEAs
4. ניתוח הקלטות עצביות בקנה מידה גדול מ- HD-MEAs
הערה: בעוד שלב 4.1 הוא ספציפי לתוכנת Brainwave, ניתן לשנות את שלב 4.2 בהתבסס על סוג התקן HD-MEA הזמין מסחרית של כל משתמש.
מיפוי מרחבי-זמני רב-מודלי וחילוץ של תכונות ירי מתנודדות
כדי לכמת אירועי LFP וספייק ברחבי הרשת שהופיעו מהרכבים עצביים דינמיים, חקרנו דפוסי ירי סינכרוניים בקנה מידה גדול במעגלי HC ו-OB וברשתות iPSC אנושיות. מעגלי פרוסת מוח מוקלטים משלב 3.2 ורשתות iPSC מוקלטות משלב 3.3 נותחו בהתאם לשלבים 4.1-4.2 של הפרוטוקול. ראשית, זיהוי אירועים וזיהוי בוצעו עבור כל מערכי הנתונים המוקלטים ונפתרו באופן אזורי בהתאם למפרטי המעגלים. לאחר מכן, שורטטו מיפוי מרחבי פסאודו-צבעוני טופוגרפי של תבניות ירי LFP וספייק בקנה מידה גדול, רסטרגרמות של אירועים שזוהו ועקבות מייצגות של 5-s של צורות גל מסוננות (איורים 3 A-I). מיפוי פסאודו-צבעוני טופוגרפי של תבניות LFP בקנה מידה גדול וקצב ירי ספייק הונחו על התמונות האופטיות שצולמו במיקרוסקופ בהתאמה של HC (איור 3A), OB (איור 3B) ורשת תאי עצב iPSC אנושית (איור 3C). זה מאפשר חקירה של מעגלים בודדים ודפוסי תנודה מבוססי רשת ותגובות. רסטרגרמות HC ו-OB מכילות ספירות אירועי LFP שזוהו ממוינות על פני שכבות DG, Hilus, CA3, CA1, EC ו-PC של מעגל HC ושכבות ONL, OCx, GL, PL ו-GCL של רשת OB על פני סל זמן של 60 שניות (איורים 3D,E). רסטרגרם iPSC אנושי מציג אירועי ספייק סינכרוניים שזוהו ברשת התרבית המחוברת על פני סל זמן של 20 שניות (איור 3G). לאחר מכן, עקבות אירועים מייצגים של 5s מאתרי הקלטה בקנה מידה גדול של HD-MEA מראים טווח של תדרי תנודה מוקלטים במעגלים HC (כלומר, אלקטרודה נבחרת ב-CA3) (איור 3G) ו-OB (כלומר, אלקטרודה נבחרת ב-GL) (איור 3H) ופעילות מתפרצת ספייק רב-יחידתית ברשת iPSC האנושית מארבע אלקטרודות פעילות נבחרות במערך (איור 3I)). אותות מופתיים אלה מראים חתימות של אותות ביולוגיים, כולל תנודות LFP בתדר נמוך (1-100 הרץ) עם פסי פסים מסוננים δ, θ, β ו-γ תדרים; אדוות גל חד (SWR) (140-220 הרץ); וסינגל בתדר גבוה ו- MUA (300-3500 הרץ). לבסוף, נעשה שימוש בניתוח צפיפות ספקטרלית של הספק (PSD) כדי לכמת בו-זמנית את עוצמת העוצמה של פס תנודה מסוים במעגל HC ו-OB המחוברים זה לזה שנרשם מ-HD-MEA (איורים 3J,K).
קונקטום פונקציונלי רב-מודאלי ברחבי הרשת
כדי להסיק את הקישוריות בקנה מידה גדול של רשתות עצביות רב-שכבתיות מדפוסי ירי בו זמנית של הרכבים עצביים פעילים בו-זמנית, השונות הצולבת בין זוגות אלקטרודות פעילות באירועים שזוהו חושבה על פי שלב 4.2.6 של הפרוטוקול. כאן, מקדם המתאם מוין על בסיס שכבות במעגל HC ו- OB או לא ממוין ברשת iPSC ולאחר מכן מאוחסן במטריצה סימטרית. קונקטומים פונקציונליים של מעגלי HC ו-OB נוצרו על ידי יישום סיבתיות גריינג'ר רב-משתנית ופונקציית העברה מכוונת (DTF) כדי לכמת את ההשפעה של סדרת זמן אחת על אחרת ולהעריך את זרימת המידע הכיוונית בתוך הקשרים המתואמים ברשתות הנפרדות. מיפוי קונקטום של HC (איור 4A) ו-OB (איור 4B) והדמיית רשת בוצעו באמצעות תוכנת Gephi גרסה 9.2 (https://gephi.org). אילוצי פרמטרים דומים הוטלו על הקישורים הפונקציונליים כדי להשוות את מעגלי פרוסת המוח HC ו- OB והמחישו 100 שניות של הקישוריות התפקודית של אירועי LFP שזוהו. גודל הצמתים משתנה בהתאם לחוזק הדרגה, כאשר צבע הקשרית מציין צבע שכבה וקישור המזהה את הקשרים התוך-שכבתיים והבין-שכבתיים. קונקטום פונקציונלי של רשתות iPSC אנושיות נוצר על ידי החלת מסננים מרחביים-זמניים (STF) וספי השהיה תלויי מרחק (DdLT) כדי לשפר את הבחירה של קישורים משמעותיים ולחדד את הזיהוי של קשרים משמעותיים על ידי יישום ניתוח היסטוגרמה מסוננת ומנורמלת של מתאם צולב (FNCCH). מיפוי קונקטום של רשתות iPSC אנושיות על כל התצוגה החזותית של שבב HD-MEA (איור 4C) שבוצעה באמצעות Gephi. צבע נודאלי מציין קלט מעורר או מעכב, וצבע קישור מזהה קשרים.
איור 1: סקירה כללית של הפלטפורמה הניסויית והחישובית ב-HD-MEA בקנה מידה גדול. (A) ייצוג סכמטי איזומטרי של הפלטפורמות הנוירו-אלקטרוניות הביו-היברידיות הרב-מודאליות שלנו, שמומשו באמצעות HD-MEA מבוסס CMOS, כדי ללכוד דינמיקה עצבית ממעגלים עצביים ורשתות של HC, OB ו-iPSC אנושיים. (B) זרימת עבודה סכמטית עבור חיתוך מוח עכבר ונוף העבודה שלו להשגת פרוסות HC ו- OB. (C) ייצוגים טופוגרפיים של תבניות הירי בקנה מידה גדול שתועדו בו זמנית מכל פרוסות HC ו-OB המונחות על גבי צורות הגל החוץ-תאיות שחולצו לתמונות האופטיות של הפרוסה. (D) ייצוג סכמטי של רשת עצבית iPSC המתקבלת מבני אדם. (E) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים המראים c-fos תאי ו-MAP-2 סומטי/דנדריטי של כל הרשת העצבית האנושית על שבב HD-MEA (משמאל) תואמים לכל מפת פעילות הירי הממוצעת (מימין). (F) מסגרת חישובית הכוללת ניתוח נתונים מתקדם, מיפוי קישוריות וכלי AI-Machine Learning לניתוח נתונים עצביים רב-ממדיים המתקבלים מהקלטות בקנה מידה גדול ב-HD-MEAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פריסות עבור פרוסות מוח ex-vivo וסביבות עבודה של תרבית iPSC אנושית במבחנה . (A) זרימת עבודה סכמטית הממחישה את ההתקנה להכנת פרוסות HC ו- OB, הכוללת את הכלים והציוד הדרושים בכל סביבת עבודה. (B) ייצוג סכמטי להכנת תרבית iPSC אנושית, כולל הכלים והמכשירים הדרושים. רשימה מלאה של חומרים כלולה בשלבים 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 ובטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיפוי וחילוץ דפוסים מרחביים-זמניים של דינמיקת רשת. (A-C) מפות מרחביות LFP וקצב ספייק ממוצע, מחושבות על פני הקלטות של חמש דקות, על גבי תמונת האור במיקרוסקופ. (ד-ו) תרשימי רסטר המתארים אירועי LFP מזוהים ונקובים בתת-דגימת נתונים של 60 שניות וזינוקים בתת-דגימת נתונים של 20 שניות. (ז-י) חילוץ עקבות מייצג של צורת גל מקטע בן 5 שניות של תת-דגימת נתוני תרשים הרסטר (מסומן באדום בתרשים הרסטר), המוצג כפסי תנודות LFP גולמיים (1-100 הרץ); δ (1-4 הרץ), θ (5-12 הרץ), β (13-35 הרץ) ו-γ (35-100 הרץ); SWR (140-220 הרץ); וספייקינג יחיד ו-MUA בתדר גבוה (300-3500 הרץ). (י,ק) מפות צפיפות ספקטרלית של LFPs מתנדנדים מהירים ואיטיים (1-100 הרץ) ו- SWR (140-220 הרץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ארגון של קונקטומים פונקציונליים רב-מודאליים ברחבי הרשת. (א-ג) מפות Gephi המדגימות קישוריות פונקציונלית של צמתים, כאשר הצמתים תואמים לאחת ממקרא סרגל הצבע לדוגמה (להלן), בעוד שהקישורים (או הקצוות) מוצללים כך שיתאימו לצמתים המחברים. מקרא לדוגמה עבור שכבות (A) HC, (B) OB ו- (C) iPSC מוצגות במערך של 64 x 64. שכבות HC ו- OB משורטטות על פני סל זמן של 100 שניות כדי להפחית ביעילות את מספר הצמתים והקישורים הגלויים למטרות הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: פתרונות להכנת פרוסות מוח ומדיה עבור תרביות נוירונים iPSC. (A) תמיסת חיתוך עתירת סוכרוז להכנת פרוסת מוח ex-vivo. (B) פתרון הקלטה aCSF להכנה והקלטה של פרוסות מוח ex-vivo. (ג-ד) פרוטוקול המדיה iPSC העצבי האנושי, כאשר (C) הוא המדיה המלאה של BrainPhys המשמשת להפשרת תאים, ציפוי שבב HD-MEA ותחזוקת HD-MEA בתרבית, ו-(D) מדיית הניקוד המשמשת לציפוי תאי HD-MEA. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: פתרון בעיות נפוצות ברכישת הקלטות HD-MEA. רשימה של בעיות נפוצות, הגורמים האפשריים שלהן ופתרונות פתרון בעיות הקשורים לשבבי HD-MEA, פלטפורמת הקלטה, רעשי מערכת ותוכנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
הדינמיקה המורכבת של הפעילות העצבית המרחבית-זמנית, הנובעת מהרכבים עצביים מקושרים, הייתה מזה זמן רב נושא לתככים במדעי המוח. מתודולוגיות מסורתיות, כגון מהדק טלאים, MEA סטנדרטי והדמיית Ca2+, סיפקו תובנות חשובות לגבי מורכבות המוח. עם זאת, לעתים קרובות הם נכשלים בלכידת הדינמיקה החישובית המקיפה ברחבי הרשת 21,22,23. הפרוטוקול הטכני של פלטפורמת HD-MEA, כפי שמפורט במחקר JoVE זה, מייצג קפיצת מדרגה משמעותית, ומציע מבט פנורמי על דינמיקה עצבית בשיטות מגוונות, החל ממכלולי תאים ועד רשתות נרחבות (כלומר, פרוסות מוח חריפות של עכברי ex-vivo ורשתות iPSC אנושיות במבחנה)26,29,30,32.
פרוסות מוח חריפות של עכברי ex-vivo היו כלי בסיסי במחקר עצבי, וסייעו לחקירות מולקולריות ומעגליות 6,7. עם זאת, האתגר של שמירה על כדאיות הרקמה היה צוואר בקבוק מתמשך. הפרוטוקול המתואר במחקר זה מציג שינויים קריטיים כדי למטב את האיכות ואת תוחלת החיים של פרוסות אלה כדי לנצל את היתרונות שלהם על פלטפורמת HD-MEA. פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של - i) השגת אחידות פרוסות, שעבורה השימוש בויברטומה מועדף על פני מסוק רקמות בשל דיוקו ומזעור הנזק לרקמות, למרות הפשרה של זמני חיתוך ארוכים יותר. ii) הבטחת קרבוגניזציה מתמדת לאורך כל התהליך, מהמיצוי ועד ההקלטה, כדי לשמור על כדאיות הרקמות. iii) ויסות הטמפרטורה ומתן זמן התאוששות הולם לפני ההקלטה. 4) שימוש בגוש אגרוז או עובש לייצוב המוח, למניעת קריעה ולמזעור מגע דבק. v) שמירה על קצבי זרימה אופטימליים של aCSF קרבוגני בתוך מאגר HD-MEA כדי להבטיח את בריאות הפרוסה תוך הימנעות מבעיות כמו ניתוק, רעש וסחף (טבלה 2).
הן עבור פרוסות מוח של עכבר והן עבור תכשירי iPSC אנושיים, שיפור צימוד ממשק אלקטרודה-רקמה הוא בעל חשיבות עליונהשל 30,46,47. הפרוטוקול שלנו מדגיש את החשיבות של שימוש במולקולה מעודדת הדבקה Poly-dl-ornithine (PDLO). מולקולה זו לא רק מגדילה את שטח הפנים לגילוי אותות חשמליים, אלא גם מגבירה את המוליכות החשמלית46. בכך הוא מקדם היצמדות תאית, גדילה ופיתוח תכונות רשת פונקציונליות. אופטימיזציה כזו ממלאת תפקיד מרכזי בשיפור היעילות של פלטפורמת HD-MEA. זה, בתורו, מבטיח ניתוח מדויק ועקבי של קונקטום ex-vivo ו- in-vitro בקנה מידה מיקרוסקולרי ורצפי הירי המרחבי-זמני שלהם. יש לציין כי PDLO הוכח כבעל ביצועים טובים יותר ממצעים אחרים כמו פוליאתילניאמין (PEI) ופולי-ל-אורניתין (אש"ף) בקידום פעילות ירי ספונטנית והיענות לגירויים חשמליים בתרביות עצביות. בנוסף, PDLO שימש לפונקציונליות פני השטח ב- HD-MEA והוכח כמשפר את ממשק הצימוד של פרוסת אלקטרודה ומגביר את יחס האות לרעש הן בפרוסות OB והן בפרוסות HC26,29. התוספת של עוגן פלטינה שנבנה בהתאמה אישית מגדילה עוד יותר את צימוד ממשק פרוסת האלקטרודה, מה שמוביל להקלטות עם יחס אות לרעש גבוה יותר.
השימוש ב-HD-MEA הן עבור פרוסות מוח של עכברי ex-vivo והן עבור רשתות iPSC אנושיות במבחנה מציג שיטה המיומנת בחקר דינמיקה נרחבת, רב-ממדית ורב-מודאלית. גישה חדשנית זו, עם זאת, מביאה אתגרים משמעותיים, במיוחד בניהול נתונים 48,49,50,51. הקלטת HD-MEA אחת הנרכשת בתדר דגימה של 18 קילוהרץ/אלקטרודה מפיקה כמות מדהימה של נתונים בנפח 155 מגה-בתים לשנייה. נפח הנתונים עולה במהירות כאשר משקללים פרוסות מרובות, מצבים פרמקולוגיים מגוונים או תקופות הקלטה ממושכות. זרם כזה של מידע דורש תשתיות אחסון איתנות וכלי חישוב מתקדמים לייעול העיבוד. היכולת של פלטפורמת HD-MEA לאסוף בו זמנית נתונים מאלפי הרכבים עצביים היא גם ברכה וגם משוכה. הוא מספק תובנות עילאיות על הדינמיקה החישובית של תפקודי המוח, אך הוא גם דורש מסגרת אנליטית מעודנת. בפרוטוקול JoVE זה, סיפקנו דוגמאות לאסטרטגיות חישוביות, כולל זיהוי אירועים בקנה מידה גדול, סיווג, תורת הגרפים, ניתוח תדרים ולמידת מכונה. שיטות אלה מדגישות את המאמצים האינטנסיביים שנעשו כדי להתמודד עם האתגרים של ניתוח נתונים עצביים מורכבים. עם זאת, עדיין יש מקום רב לפיתוח כלים חישוביים מתקדמים יותר לניתוח מערכי נתונים עצביים רב-ממדיים אלה. חמושה בכלים ובמתודולוגיות המתאימים, הפוטנציאל של פלטפורמת HD-MEA גדל, ומציעה תובנות מעמיקות על המורכבות של תפקודי המוח במצבים בריאים ופתולוגיים כאחד.
בעיקרו של דבר, פלטפורמת HD-MEA, כאשר היא משולבת עם הפרוטוקולים המפורטים והכלים החישוביים שנדונו, מציעה גישה טרנספורמטיבית להבנת פעולתו המורכבת של המוח. על-ידי לכידת דינמיקות בקנה מידה גדול, רב-ממדי ורב-מודאלי, הוא מספק תובנות יקרות ערך לגבי תהליכים כגון למידה, זיכרון ועיבוד מידע. יתר על כן, היישום שלה ברשתות iPSC אנושיות במבחנה יש פוטנציאל לחולל מהפכה בסינון תרופות וברפואה מותאמת אישית. עם זאת, בעוד פלטפורמה זו מייצגת התקדמות משמעותית במחקר מדעי המוח, חיוני להכיר ולטפל באתגרים הטכניים הטבועים. עם שכלול מתמשך ושילוב של כלים חישוביים מתקדמים, פלטפורמת HD-MEA עומדת לפתוח עידן חדש של כלי אבחון מדויקים, זיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים וטיפולים ממוקדים להפרעות נוירולוגיות.
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.
מחקר זה נתמך על ידי קרנות מוסדיות (DZNE), אגודת הלמהולץ במסגרת קרן התיקוף של הלמהולץ (HVF-0102), ובית הספר הבינלאומי למוסמכים בדרזדן לביו-רפואה וביו-הנדסה (DIGS-BB). ברצוננו גם להודות לפלטפורמה לניסויים התנהגותיים בבעלי חיים ב- DZNE-Dresden (אלכסנדר גארת, אן קרסינסקי, סנדרה גינתר וינס ברגמן) על תמיכתם. ברצוננו להכיר בכך שחלק מאיור 1 נוצר באמצעות BioRender.com הפלטפורמה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved