Burada, özellikle hipokampal, koku soğanı devreleri ve insan nöronal ağlarında, büyük ölçekli nöronal toplulukların hesaplama dinamiklerini araştırmak için HD-MEA'yı kullanıyoruz. Hesaplama araçlarıyla birlikte uzay-zamansal aktiviteyi yakalamak, nöronal topluluk karmaşıklığı hakkında içgörüler sağlar. Yöntem, beyin fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirir, potansiyel olarak biyobelirteçleri ve nörolojik bozukluklar için tedavileri tanımlar.
Büyük ölçekli nöronal ağlar ve bunların karmaşık dağıtılmış mikro devreleri, uzay-zamansal nöronal aktivite kalıplarından ortaya çıkan algı, biliş ve davranış oluşturmak için gereklidir. Birbirine bağlı nöronal toplulukların fonksiyonel gruplarından ortaya çıkan bu dinamik kalıplar, çok ölçekli nöral bilginin işlenmesi ve kodlanması için hassas hesaplamaları kolaylaştırır ve böylece daha yüksek beyin fonksiyonlarını yönlendirir. Bu karmaşıklığın altında yatan nöral dinamiklerin hesaplama ilkelerini araştırmak ve biyolojik süreçlerin sağlık ve hastalıktaki çok ölçekli etkisini araştırmak için, büyük ölçekli eşzamanlı kayıtlar araçsal hale geldi. Burada, nöral dinamiğin iki modalitesini incelemek için yüksek yoğunluklu bir mikroelektrot dizisi (HD-MEA) kullanılır - ex-vivo fare beyin dilimlerinden hipokampal ve koku ampul devreleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro hücre kültürlerinden nöronal ağlar. 4096 mikroelektrotlu HD-MEA platformu, yüksek uzay-zamansal çözünürlükte aynı anda binlerce nöronal topluluktan hücre dışı ateşleme modellerinin non-invaziv, çok bölgeli, etiketsiz kayıtlarını sağlar. Bu yaklaşım, tek/çok birimli spiking aktivite modelleri ve yerel alan potansiyel salınımları dahil olmak üzere çeşitli elektrofizyolojik ağ çapında özelliklerin karakterizasyonuna izin verir. Bu çok boyutlu nöral verileri incelemek için makine öğrenimi algoritmaları, otomatik olay algılama ve sınıflandırma, grafik teorisi ve diğer gelişmiş analizleri içeren çeşitli hesaplama araçları geliştirdik. Bu hesaplama boru hatlarını bu platformla destekleyerek, hücre montajlarından ağlara kadar büyük, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri incelemek için bir metodoloji sağlıyoruz. Bu, sağlık ve hastalıktaki karmaşık beyin fonksiyonları ve bilişsel süreçler hakkındaki anlayışımızı potansiyel olarak ilerletebilir. Açık bilime bağlılık ve büyük ölçekli hesaplamalı nöral dinamiklere ilişkin içgörüler, beyinden ilham alan modellemeyi, nöromorfik hesaplamayı ve nöral öğrenme algoritmalarını geliştirebilir. Ayrıca, bozulmuş büyük ölçekli nöral hesaplamaların altında yatan mekanizmaları ve bunların birbirine bağlı mikro devre dinamiklerini anlamak, spesifik biyobelirteçlerin tanımlanmasına yol açarak nörolojik bozukluklar için daha doğru teşhis araçlarının ve hedefe yönelik tedavilerin önünü açabilir.
Genellikle hücre düzenekleri olarak adlandırılan nöronal topluluklar, nöral kodlamada çok önemlidir ve çok ölçekli nöral bilgiyi işlemek için karmaşık hesaplamaları kolaylaştırır 1,2,3. Bu topluluklar, geniş nöronal ağların ve bunların nüanslı mikro devrelerinin oluşumunu destekler4. Bu tür ağlar ve salınım kalıpları, algı ve biliş dahil olmak üzere gelişmiş beyin fonksiyonlarını yönlendirir. Kapsamlı araştırmalar belirli nöronal tipleri ve sinaptik yolları araştırmış olsa da, nöronların işbirliği içinde hücre düzeneklerini nasıl oluşturduğuna ve devreler ve ağlar arasında uzay-zamansal bilgi işlemeyi nasıl etkilediğine dair daha derin bir anlayış belirsizliğini koruyor5.
Akut, ex-vivo beyin dilimleri, bozulmamış nöral devreleri incelemek için çok önemli elektrofizyolojik araçlardır ve nöral fonksiyon, sinaptik iletim ve bağlanabilirliğin salınımlı aktivite modellerini araştırmak için kontrollü bir ortam sunar, farmakolojik testler ve hastalık modellemesindeetkileri vardır 6,7,8. Bu çalışma protokolü iki temel beyin devresini vurgulamaktadır - öğrenme ve hafıza süreçlerinde yer alan hipokampal-kortikal (HC) 9,10 ve koku ayrımcılığından sorumlu koku soğanı (OB) 11,12,13. Bu iki bölgede, memeli beyinlerinde yaşam boyunca yetişkin nörojenezi tarafından sürekli olarak yeni fonksiyonel nöronlar üretilir14. Her iki devre de, mevcut sinir ağının yeniden yapılandırılmasına katılan ve gerektiğinde alternatif bilgi işleme stratejilerini kolaylaştıran çok boyutlu dinamik sinirsel aktivite kalıpları ve doğal plastisite gösterir 15,16.
Akut, ex-vivo beyin dilimi modelleri, beyin işlevselliğini araştırmak ve mikrodevre düzeyinde hastalık mekanizmalarını anlamak için vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen in vitro hücre kültürleri, hayvan deneylerinden elde edilen bulguları potansiyel insan klinik tedavisine sorunsuz bir şekilde bağlayarak umut verici bir translasyonel araştırma yolu sunar17,18. Bu insan merkezli in vitro tahliller, farmakolojik toksisiteyi değerlendirmek, hassas ilaç taramasını sağlamak ve yenilikçi hücre bazlı terapötik stratejilere yönelik araştırmaları ilerletmek için güvenilir bir platform görevi görür19,20. iPSC nöronal modelinin önemli rolünü kabul ederek, bu protokol çalışmasının üçüncü modülünü, türetilmiş ağlarının fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak ve ilişkili hücre kültürü protokollerine ince ayar yapmak için ayırdık.
Bu elektrojenik nöral modüller, kalsiyum (Ca2 + görüntüleme), yama kelepçe kayıtları ve düşük yoğunluklu mikroelektrot dizileri (LD-MEA) gibi teknikler kullanılarak yaygın olarak incelenmiştir. Ca2+ görüntüleme, tek hücreli aktivite haritalaması sunarken, düşük zamansal çözünürlüğü ve uzun süreli kayıtlardaki zorluklar nedeniyle engellenen hücre etiketleme tabanlı bir yöntemdir. LD-MEA'lar uzamsal hassasiyetten yoksunken, invaziv tek bölgeli bir teknik olan ve zahmetli olan yama klempi genellikle düşük bir başarı oranısağlar 21,22,23. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve ağ çapında aktiviteyi etkili bir şekilde araştırmak için, büyük ölçekli eşzamanlı nöral kayıtlar, beyin karmaşıklığının altında yatan nöral dinamiklerin hesaplama ilkelerini ve bunların sağlık ve hastalık üzerindeki etkilerini anlamak için çok önemli bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır24,25.
Bu JoVE protokolünde, daha önce grubumuz ve diğer meslektaşlarımız tarafından bildirilen ex-vivo fare beyni akut dilimlerinden hipokampal ve koku soğanı devreleri (Şekil 1A-C) ve in vitro insan iPSC türevi nöronal ağlar (Şekil 1D-E) dahil olmak üzere çeşitli beyin modalitelerinde uzay-zamansal nöronal aktiviteyi yakalamak için yüksek yoğunluklu MEA'ya (HD-MEA) dayalı büyük ölçekli bir nöral kayıt yöntemi gösteriyoruz26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) teknolojisi üzerine inşa edilen HD-MEA, 7 mm2 dizi boyutu36'da milisaniyenin altında kayıtlara izin veren çip üzerinde devre ve amplifikasyona sahiptir. Bu non-invaziv yaklaşım, yüksek uzay-zamansal çözünürlükte 4096 mikroelektrot kullanarak aynı anda binlerce nöronal topluluktan çok bölgeli, etiketsiz hücre dışı ateşleme modellerini yakalar ve yerel alan potansiyellerinin (LFP'ler) ve çok birimli spiking aktivitesinin (MUA) karmaşık dinamiklerini ortaya çıkarır26,29.
Bu metodoloji tarafından üretilen verilerin genişliği göz önüne alındığında, sofistike bir analitik çerçeve gereklidir, ancak zorluklar ortaya çıkarmaktadır37. Otomatik olay algılama, sınıflandırma, grafik teorisi, makine öğrenimi ve diğer gelişmiş teknikleri kapsayan hesaplama araçları geliştirdik (Şekil 1F)26,29,38,39. HD-MEA'yı bu analitik araçlarla entegre ederek, çeşitli nöral modaliteler arasında bireysel hücre gruplarından daha geniş sinir ağlarına kadar karmaşık dinamikleri araştırmak için bütünsel bir yaklaşım tasarlanmıştır. Bu birleşik yaklaşım, normal beyin fonksiyonlarındaki hesaplama dinamiklerini kavrayışımızı derinleştirir ve patolojik durumlarda mevcut olan anomaliler hakkında fikir verir28. Ayrıca, bu yaklaşımdan elde edilen içgörüler, beyinden ilham alan modelleme, nöromorfik hesaplama ve sinirsel öğrenme algoritmalarındaki ilerlemeleri hızlandırabilir. Sonuç olarak, bu yöntem, sinir ağı bozulmalarının arkasındaki temel mekanizmaları ortaya çıkarmada, potansiyel olarak biyobelirteçleri tanımlamada ve nörolojik durumlar için kesin teşhis araçlarının ve hedefe yönelik tedavilerin oluşturulmasına rehberlik etmede umut vaat ediyor.
Tüm deneyler geçerli Avrupa ve ulusal yönetmeliklere (Tierschutzgesetz) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel otorite tarafından onaylanmıştır (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).
1. HD-MEA'da hipokampal-kortikal ve koku soğanı devrelerinden ex-vivo beyin dilimleri
2. HD-MEA'da in vitro insan iPSC tabanlı nöronal ağ
NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm iPSC nöronları ticari olarak elde edilmiştir (bkz. Bu insan hücreleri, insan periferik kanından veya fibroblastlarından türetilen stabil iPS hücre hatlarından farklılaştı.
3. HD-MEA'lar ile ex-vivo ve in vitro büyük ölçekli nöral kayıtlar
4. HD-MEA'lardan büyük ölçekli nöral kayıtların analizi
NOT: Adım 4.1 Brainwave yazılımına özel olsa da, adım 4.2 her kullanıcının ticari olarak temin edilebilen HD-MEA cihaz türüne göre değiştirilebilir.
Çok modelli uzay-zamansal haritalama ve salınımlı ateşleme özelliklerinin çıkarılması
Dinamik nöronal topluluklardan ortaya çıkan ağ çapında LFP ve spike olaylarını ölçmek için, HC ve OB devrelerinde ve insan iPSC ağlarında senkron büyük ölçekli ateşleme modellerini araştırdık. Adım 3.2'den kaydedilen beyin dilimi devreleri ve adım 3.3'ten kaydedilen iPSC ağları, protokolün 4.1-4.2 adımlarına göre analiz edildi. İlk olarak, kaydedilen tüm veri kümeleri için olay algılama ve gürültü giderme gerçekleştirildi ve devre özelliklerine göre bölgesel olarak çözüldü. Daha sonra, ortalama büyük ölçekli LFP ve ani ateşleme modellerinin topografik sözde renkli uzamsal haritalaması, tespit edilen olayların rastergramları ve filtrelenmiş dalga formlarının temsili 5-s izleri çizildi (Şekil 3 A-I). Büyük ölçekli LFP'nin topografik sözde renk haritalaması ve sivri ateşleme hızı modelleri, HC (Şekil 3A), OB (Şekil 3B) ve insan iPSC nöronal ağının (Şekil 3C) ilgili mikroskopla yakalanan optik görüntüleri üzerine yerleştirildi. Bu, bireysel devre ve ağ tabanlı salınım modellerinin ve yanıtlarının araştırılmasına izin verir. HC ve OB rastergramları, HC devresinin DG, Hilus, CA3, CA1, EC ve PC katmanları ve OB ağının ONL, OCx, GL, PL ve GCL katmanları üzerinde 60 sn'lik bir zaman bölmesi üzerinde sıralanmış algılanan LFP olay sayılarını içerir (Şekil 3D,E). İnsan iPSC rastergramı, 20 sn'lik bir zaman bölmesi boyunca birbirine bağlı kültürlü ağın senkron algılanan ani artış olaylarını görüntüler (Şekil 3G). Daha sonra, büyük ölçekli HD-MEA kayıt bölgelerinden 5s temsili olay izleri, HC'de (yani, CA3'te seçilen elektrot) (Şekil 3G) ve OB'de (yani, GL'de seçilen elektrot) (Şekil 3H) bir dizi kaydedilmiş salınım frekansını ve dizideki seçilmiş dört aktif elektrottan insan iPSC ağındaki çok birimli spike patlama aktivitesini gösterir (Şekil 3I). Bu örnek sinyaller, bant geçiren filtreli δ, θ, β ve γ frekans bantlarına sahip düşük frekanslı LFP salınımları (1-100 Hz) dahil olmak üzere biyosinyal imzalarını gösterir; keskin dalga dalgalanmaları (SWR) (140-220 Hz); ve yüksek frekanslı tek ve MUA (300-3500 Hz). Son olarak, HD-MEA'dan kaydedilen birbirine bağlı HC ve OB devresinde belirli bir salınım bandının güç büyüklüğünü aynı anda ölçmek için güç spektral yoğunluğu (PSD) analizi kullanıldı (Şekil 3J,K).
Çok Modlu Ağ Çapında Fonksiyonel Konektom
Eşzamanlı olarak aktif nöronal toplulukların aynı anda ateşleme modellerinden çok katmanlı sinir ağlarının büyük ölçekli bağlantısını çıkarmak için, tespit edilen olaylarda aktif elektrot çiftleri arasındaki çapraz kovaryans, protokolün 4.2.6 adımına göre hesaplandı. Burada, korelasyon katsayısı HC ve OB devresindeki katmanlara göre sıralandı veya iPSC ağında sıralanmadı ve daha sonra simetrik bir matriste saklandı. HC ve OB devrelerinin fonksiyonel konektomları, bir zaman serisinin diğeri üzerindeki etkisini ölçmek ve farklı ağlardaki ilişkili bağlantılar içindeki yönlü bilgi akışını değerlendirmek için Çok Değişkenli Granger nedenselliği ve yönlendirilmiş transfer fonksiyonu (DTF) uygulanarak üretildi. HC (Şekil 4A) ve OB'nin (Şekil 4B) konektom haritalaması ve ağ görselleştirmesi Gephi programı 9.2 versiyonu (https://gephi.org) kullanılarak gerçekleştirildi. HC ve OB beyin dilimi devrelerini karşılaştırmak için fonksiyonel bağlantılara benzer parametre kısıtlamaları yerleştirildi ve tespit edilen LFP olaylarının fonksiyonel bağlantısının 100'ünü gösterdi. Düğümler, katman içi ve katmanlar arası bağlantıları tanımlayan katman ve bağlantı rengini gösteren düğüm rengi ile derece kuvvetine göre ölçeklendirilir. İnsan iPSC ağlarının fonksiyonel konektomları, filtrelenmiş ve normalleştirilmiş çapraz korelasyon histogramı (FNCCH) analizi uygulanarak önemli bağlantıların seçimini geliştirmek ve anlamlı bağlantıların tanımlanmasını iyileştirmek için uzamsal-zamansal filtreler (STF) ve mesafeye bağlı gecikme eşikleri (DdLT) uygulanarak oluşturulmuştur. Gephi kullanılarak gerçekleştirilen tüm HD-MEA çipi (Şekil 4C) görselleştirmesinde insan iPSC ağlarının konektom haritalaması. Düğüm rengi, uyarıcı veya inhibitör girişi gösterir ve bağlantı rengi, bağlantıları tanımlar.
Şekil 1: Büyük ölçekli HD-MEA'daki deneysel ve hesaplamalı platforma genel bakış. (A) HC, OB ve insan iPSC nöronal devrelerinden ve ağlarından nöral dinamikleri yakalamak için CMOS tabanlı HD-MEA ile gerçekleştirilen çok modlu biyohibrit nöroelektronik platformlarımızın izometrik şematik gösterimi. (B) HC ve OB dilimleri elde etmek için fare beyni dilimleme ve çalışma ortamı için şematik iş akışı. (C) Çıkarılan hücre dışı dalga biçimleri ile üst üste bindirilmiş tüm HC ve OB dilimlerinden aynı anda kaydedilen büyük ölçekli ateşleme modellerinin topografik temsilleri, dilim optik görüntülerine. (D) İnsanlardan elde edilen iPSC nöronal ağının şematik gösterimi. (E) HD-MEA çipi (solda) üzerindeki tüm insan nöronal ağının hücresel c-fos ve somatik / dendritik MAP-2'sini gösteren floresan mikrografları, tüm ortalama ateşleme aktivitesi haritası (sağda) ile eşleşti. (F) HD-MEA'lardaki büyük ölçekli kayıtlardan elde edilen çok boyutlu nöral verileri analiz etmek için gelişmiş veri analizi, bağlantı haritalama ve yapay zeka-makine öğrenimi araçlarını içeren hesaplama çerçevesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ex-vivo beyin dilimi ve in vitro insan iPSC kültürü hazırlama ve kaydetme çalışma alanları için düzenler. (A) Her çalışma alanında gerekli araç ve gereçleri içeren, HC ve OB dilimlerinin hazırlanması için kurulumu gösteren şematik iş akışı. (B) Gerekli araçlar ve cihazlar da dahil olmak üzere insan iPSC kültürü hazırlığı için şematik gösterim. Malzemelerin tam listesi 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 adımlarında ve Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ağ dinamiğinin uzay-zamansal kalıplarının haritalanması ve çıkarılması. (A-C) Mikroskop ışığı görüntüsünün üzerine bindirilmiş, beş dakikalık kayıtlar üzerinden hesaplanan ortalama LFP ve ani artış hızı uzamsal haritaları. (D-F) 60 saniyelik bir veri alt örneğinde algılanan, gürültüsü giderilmiş LFP olaylarını ve 20 saniyelik bir veri alt örneğindeki ani artışları gösteren raster grafikler. (G-I) Raster çizim verisi alt örneğinin (raster çizimde kırmızı ile vurgulanan) 5 saniyelik bir segmentinden temsili dalga biçimi izi çıkarma, ham LFP salınım bantları (1-100 Hz) olarak görüntülenir; δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) ve γ (35-100 Hz) frekans bantları; SWR (140-220 Hz); ve yüksek frekanslı tek ve MUA spiking (300-3500 Hz). (J,K) Hızlı ve yavaş salınımlı LFP'lerin (1-100 Hz) ve SWR'nin (140-220 Hz) güç spektral yoğunluk haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Çok modlu ağ çapında fonksiyonel konektomların organizasyonu. (A-C) Gephi haritaları, düğümlerin örnek renk çubuğu göstergelerinden birine (aşağıda) karşılık geldiği, bağlantıların (veya kenarların) bağlantı düğümleriyle eşleşecek şekilde gölgelendirildiği düğüm işlevsel bağlantısını gösterir. (A) HC, (B) OB ve (C) iPSC katmanları için örnek göstergeler 64 x 64 dizide görüntülenir. HC ve OB katmanları, görselleştirme amacıyla görünür düğümlerin ve bağlantıların sayısını etkili bir şekilde azaltmak için 100 sn'lik bir zaman bölmesi üzerinde çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: iPSC nöronal kültürleri için beyin dilimi hazırlama ve ortam çözümleri. (A) Ex-vivo beyin dilimi hazırlığı için yüksek sükroz kesme çözeltisi. (B) ex-vivo beyin dilimi hazırlama ve kaydetme için aCSF kayıt çözümü. (C-D) İnsan nöronal iPSC Medya Protokolü, burada (C) hücre çözme, HD-MEA çip kaplaması ve kültürlenmiş HD-MEA bakımı için kullanılan BrainPhys tam ortamı ve (D) HD-MEA hücre kaplaması için kullanılan noktalama ortamıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Yaygın HD-MEA kayıt alma sorunlarını giderme. HD-MEA yongaları, kayıt platformu, sistem gürültüsü ve yazılımla ilgili yaygın sorunların, olası nedenlerinin ve sorun giderme çözümlerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Birbirine bağlı nöronal topluluklardan ortaya çıkan uzay-zamansal nöronal aktivitenin karmaşık dinamikleri, sinirbilimde uzun zamandır bir entrika konusu olmuştur. Patch-clamp, standart MEA ve Ca2+ görüntüleme gibi geleneksel metodolojiler, beyin karmaşıklığı hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, kapsamlı ağ çapında hesaplama dinamikleriniyakalamada genellikle yetersiz kalırlar 21,22,23. Bu JoVE çalışmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, HD-MEA platformunun teknik protokolü, hücre düzeneklerinden geniş ağlara (yani, akut, ex-vivo fare beyin dilimleri ve in vitro insan iPSC ağları) kadar çeşitli modalitelerde nöral dinamiklerin panoramik bir görünümünü sunarak ileriye doğru önemli bir sıçramayı temsil eder26,29,30,32.
Akut, ex-vivo fare beyin dilimleri, moleküler ve devre düzeyinde araştırmaları kolaylaştıran, nöronal araştırmalarda temel bir araç olmuştur 6,7. Bununla birlikte, doku canlılığını korumanın zorluğu kalıcı bir darboğaz olmuştur. Bu çalışmada açıklanan protokol, HD-MEA platformundaki faydalarından yararlanmak için bu dilimlerin kalitesini ve uzun ömürlülüğünü optimize etmek için kritik değişiklikler getirmektedir. Bu protokol aşağıdakilerin önemini vurgulamaktadır: - i) Daha uzun dilimleme sürelerinden ödün verilmesine rağmen, hassasiyeti ve en aza indirilmiş doku hasarı nedeniyle bir doku kıyıcı yerine vibratom kullanımının tercih edildiği dilim homojenliğinin elde edilmesi. ii) Doku canlılığını korumak için ekstraksiyondan kayda kadar süreç boyunca sürekli karbojenasyonun sağlanması. iii) Sıcaklığın düzenlenmesi ve kayıttan önce yeterli iyileşme süresine izin verilmesi. iv) Beyni stabilize etmek, yırtılmayı önlemek ve tutkal temasını en aza indirmek için bir agaroz blok veya küf kullanmak. v) Ayrışma, gürültü ve kayma gibi sorunlardan kaçınırken dilim sağlığını sağlamak için HD-MEA rezervuarı içinde karbojene aCSF'nin optimum akış hızlarını korumak (Tablo 2).
Hem fare beyni dilimleri hem de insan iPSC preparatları için, elektrot-doku arayüz bağlantısının arttırılması çok önemlidir 30,46,47. Protokolümüz, yapışmayı teşvik edici molekül Poli-dl-ornitin (PDLO) kullanmanın önemini vurgulamaktadır. Bu molekül sadece elektrik sinyallerini algılamak için yüzey alanını genişletmekle kalmaz, aynı zamanda elektriksel iletkenliğide artırır 46. Bunu yaparak, hücresel yapışmayı, büyümeyi ve fonksiyonel ağ özelliklerinin gelişimini destekler. Bu tür bir optimizasyon, HD-MEA platformunun etkinliğini artırmada çok önemli bir rol oynar. Bu da, mikro ölçekli ex-vivo ve in-vitro konektomların ve bunların uzay-zamansal ateşleme dizilerinin doğru ve tutarlı analizini sağlar. Özellikle, PDLO'nun, nöronal kültürlerde spontan ateşleme aktivitesini ve elektriksel uyaranlara duyarlılığı teşvik etmede polietilenimin (PEI) ve poli-l-ornitin (PLO) gibi diğer substratlardan daha iyi performans gösterdiği gösterilmiştir. Ek olarak, PDLO, HD-MEA'da yüzey işlevselleştirmesi için kullanılmıştır ve elektrot-dilim birleştirme arayüzünü geliştirdiği ve hem OB hem de HC dilimlerinde sinyal-gürültü oranını arttırdığıgösterilmiştir 26,29. Özel yapım bir platin ankrajın eklenmesi, elektrot-dilim arayüz bağlantısını daha da güçlendirerek daha yüksek sinyal-gürültü oranına sahip kayıtlara yol açar.
HD-MEA'nın hem ex-vivo fare beyin dilimleri hem de in vitro insan iPSC ağları için kullanılması, kapsamlı, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri keşfetmede usta bir yöntem sunar. Ancak bu yenilikçi yaklaşım, özellikle veri yönetiminde önemli zorlukları beraberinde getirmektedir 48,49,50,51. 18 kHz/elektrot örnekleme frekansında elde edilen tek bir HD-MEA kaydı, şaşırtıcı bir şekilde 155 MB/sn veri üretir. Birden fazla dilimi, çeşitli farmakolojik koşulları veya uzun kayıt sürelerini hesaba katarken veri hacmi hızla artar. Böyle bir bilgi akışı, kolaylaştırılmış işleme için sağlam depolama altyapıları ve gelişmiş hesaplama araçları gerektirir. HD-MEA platformunun binlerce nöronal topluluktan aynı anda veri toplama yeteneği hem bir nimet hem de bir engeldir. Beyin fonksiyonlarının hesaplama dinamikleri hakkında üstün bilgiler sağlar, ancak aynı zamanda rafine bir analitik çerçeve gerektirir. Bu JoVE protokolünde, büyük ölçekli olay algılama, sınıflandırma, grafik teorisi, frekans analizi ve makine öğrenimi dahil olmak üzere hesaplama stratejilerine örnekler sağladık. Bu yöntemler, karmaşık nöral verileri analiz etmenin zorluklarının üstesinden gelmek için gösterilen yoğun çabaların altını çizmektedir. Bununla birlikte, bu çok boyutlu nöral veri kümelerini analiz etmek için daha gelişmiş hesaplama araçlarının geliştirilmesi için hala önemli bir alan var. Uygun araçlar ve metodolojilerle donanmış olan HD-MEA platformunun potansiyeli, hem sağlıklı hem de patolojik koşullarda beyin fonksiyonlarının incelikleri hakkında derin bilgiler sunarak büyütülür.
Özünde, HD-MEA platformu, tartışılan ayrıntılı protokoller ve hesaplama araçlarıyla entegre edildiğinde, beynin karmaşık işleyişini anlamak için dönüştürücü bir yaklaşım sunar. Büyük ölçekli, çok ölçekli ve çok modlu dinamikleri yakalayarak öğrenme, bellek ve bilgi işleme gibi süreçlere ilişkin paha biçilmez içgörüler sağlar. Ayrıca, in vitro insan iPSC ağlarındaki uygulaması, ilaç taraması ve kişiselleştirilmiş tıpta devrim yaratma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, bu platform sinirbilim araştırmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil etse de, doğasında var olan teknik zorlukları kabul etmek ve ele almak çok önemlidir. Devam eden iyileştirme ve gelişmiş hesaplama araçlarının entegrasyonu ile HD-MEA platformu, hassas teşhis araçları, spesifik biyobelirteçlerin tanımlanması ve nörolojik bozukluklar için hedefe yönelik tedaviler konusunda yeni bir çağı başlatmaya hazırlanıyor.
Yazarlar herhangi bir rakip veya finansal çıkar beyan etmezler.
Bu çalışma kurumsal fonlar (DZNE), Helmholtz Doğrulama Fonu (HVF-0102) bünyesindeki Helmholtz Derneği ve Dresden Uluslararası Biyotıp ve Biyomühendislik Enstitüsü (DIGS-BB) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca DZNE-Dresden'deki davranışsal hayvan testleri platformuna (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther ve Jens Bergmann) destekleri için teşekkür ederiz. Şekil 1'in bir kısmının BioRender.com platformu kullanılarak oluşturulduğunu kabul etmek isteriz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
ISSN 1940-087X
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.