从冷冻保存的体外来源血细胞中进行核分离

摘要

我们描述了一种从冷冻保存的诱导多能干细胞衍生的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单核下一代测序分析。对于多组学实验来说，产生高质量、完整的细胞核是必不可少的，但对于一些实验室来说，这可能是进入该领域的障碍。

摘要

基于诱导多能干细胞 （iPSC） 的模型是了解血液发育的绝佳平台，而 iPSC 衍生的血细胞作为临床检测试剂和可输输细胞疗法具有转化效用。多组学分析的出现和扩展，包括但不限于单核 RNA 测序 （snRNAseq） 和转座酶可及染色质测序测定 （snATACseq），有可能彻底改变我们对细胞发育的理解。这包括使用 体外 造血模型的发育生物学。然而，从培养细胞或原代细胞中分离出完整的细胞核在技术上可能具有挑战性。不同的细胞类型通常需要根据细胞的刚度和含量进行量身定制的核制备。这些技术难题会限制数据质量，并对有兴趣进行多组学研究的研究人员构成障碍。由于细胞收集和/或处理的限制，通常需要进行标本冷冻保存，而冷冻样品可能会给完整核分离带来额外的技术挑战。在这篇手稿中，我们提供了一种详细的方法，用于在 体外 造血发育的不同阶段从 iPSC 衍生细胞中分离出高质量的细胞核，用于单核多组学工作流程。我们将方法开发的重点放在从 iPSC 衍生的贴壁基质/内皮细胞和非贴壁造血祖细胞中分离细胞核，因为它们在结构和细胞身份方面代表了非常不同的细胞类型。所描述的故障排除步骤限制了核团块和碎片，从而可以回收足够数量和质量的原子核以进行下游分析。类似的方法可用于从其他冷冻保存的细胞类型中分离细胞核。

引言

造血是一个相对特征明确的发育系统，但无法在体外概括血细胞的形成表明对相关因素的理解不完整。基于诱导多能干细胞 （iPSC） 的造血模型可以帮助阐明关键的发育因素和相关生物学。iPSC 系统还为研究血液疾病提供了出色的模型，并且基于 iPSC 的血细胞已被开发用于产生转化和治疗相关的试剂 1,2,3,4。单细胞研究已被广泛用于研究基于 iPSC 的发育生物学，包括造血过程中产生的细胞类型⁵。与无法推断细胞亚群之间关系的批量RNA测序6^相比，单细胞模式允许评估细胞异质性，并有助于细胞发育的鉴定和表征^6,7。

iPSCs造血细胞的形成需要通过原始条纹、中胚层和内皮状态进行顺序分化，以形成成血性内皮细胞。成血内皮细胞是造血干细胞和祖细胞的直接前体细胞⁸。这些细胞类型具有截然不同的形态和细胞特性。对 体外衍生造血细胞模型的表观遗传学景观和发育动力学的理解有限，尽管这是释放 iPSC 系统全部治疗潜力的基本知识。在许多情况下，只有单细胞分析模式才能鉴定细胞群、转录活性、染色质景观和调节机制，这些都控制着异质细胞制备物的发育。

单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 和单核 RNA 测序 （snRNAseq） 这两种方法可以揭示单个细胞水平的转录见解⁹。决定数据有效性和可靠性的一个主要因素是对满足严格质量标准的样品的坚定需求。其中包括对细胞/细胞核密度的精确要求、最佳活力和最小聚集。单核的制备在技术上可能具有挑战性。使用先前冷冻保存的细胞可能会带来额外的挑战。

我们注意到标准scRNAseq方法的四个重要的潜在局限性。首先，用于生成细胞悬液的标准方案通常参考来自新鲜细胞或组织的制剂，而不是冷冻保存后提取的制剂¹⁰。这可能会削弱潜在宝贵资源的效用。其次，不同细胞类型的解离效率是可变的。例如，许多免疫细胞类型相对容易地发生解离。相比之下，通常嵌入细胞外基质和基底膜中的基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞具有独特的细胞特性，可能会使细胞核分离复杂化^11,12。这些特性可能需要积极的解离方案，这可能会危及更脆弱的细胞群的结构完整性。第三，一些细胞（例如，巨核细胞）的直径可以超过100μm，这给几个现有的商业单细胞平台带来了困难¹³。此外，在细胞分离的初始步骤中，处理不当会导致细胞损伤和应激反应，包括酶水解和机械解离，这会影响基因表达谱^11,14。

由于这些原因和其他原因，单细胞核方法可能是单细胞方法的更可取的替代方案¹⁵。鉴于与细胞膜相比，核膜具有优越的稳定性，即使在组织冷冻保存后，核膜也可能保持完整¹⁶。这可以促进细胞核提取，并增强适合下一代测序模式的样本类型的多样性。其次，细胞核对机械扰动表现出更强的抵抗力，并且在解离过程中往往表现出较少的转录位移¹⁴。因此，细胞核可以提供更高的 RNA 稳定性和更可重复的转录谱。单核方法的第三个值得注意的优点是没有细胞大小限制，并且适用于较大的细胞，如心肌细胞或巨核细胞¹²。第四，细胞核是多组学分析的合适底物，通过对基因表达、可访问染色质区域和其他参数的综合分析，可以提供更多的见解¹⁷，从而能够更深入地理解细胞异质性、发育和功能状态¹⁸。

通过在造血发育过程中分析iPSCs，多组学方法可以帮助定义正常或病理疾病模型中的发育过程。将 iPSC 衍生细胞与原代细胞或组织进行比较还可以评估 iPSC 模型对 体内 生物学的保真度，从而促进 iPSC 模型的改进和发现新的细胞群和驱动血液形成的因素。

尽管许多研究小组已经成功地进行了核分离和由此产生的下一代测序分析，但对于一些有兴趣进行基于单核分析的实验室来说，分离出高质量的细胞核仍然是一个障碍。该手稿详细介绍了从先前冷冻保存的 iPSC 衍生细胞中分离优质细胞核的方案。我们专注于贴壁基质/内皮细胞和非贴壁造血祖细胞，因为它们在结构和内容方面代表了非常不同的细胞类型，需要进行定制的修饰和故障排除，以提高适合下一代测序或其他实验的高质量细胞核的回收率。

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研究方案

1. 细胞的冷冻保存

1. 在 1 mL 的 90% FBS 和 10% DMSO 中冷冻每 mL >1 x 10⁶ 个分离的 iPSC 衍生细胞。将冻存管放入 -80°C 的冷冻容器中，以降低冷冻速度并优化活细胞回收率（材料表）。预计会有相当大的细胞损失，这可能因培养条件和细胞身份而异。
2. 在24小时内从-80°C移动到液氮储存。

2. 细胞解冻

1. 从液氮储存中取出冷冻管，并在37°C水浴中解冻2分钟。在小冰晶仍然可见时从水浴中取出。
2. 将细胞从冷冻管转移到空的 15 mL 管中，并缓慢加入 10 mL 预热培养基 （RPMI 1640 + 10% FBS），同时小心混合。在25°C下以400× g 离心3分钟。
3. 吸出上清液，并在补充有 2% FBS 和 1 mM CaCl₂ 的 1 mL DPBS 中复溶（材料表）。用 1000 μL 微量移液管移液 3 次小心混合。转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。

3. 去除死细胞

1. 将 50 μL 死细胞去除混合物（材料表）加入 1 mL 细胞悬液中。向细胞混合物中加入 50 μL 生物素选择混合物。在室温下孵育 3 分钟。这些步骤用生物素标记细胞悬浮液中包含的膜联蛋白 V⁺ 死细胞。
2. 剧烈涡旋 30 秒，右旋糖酐珠设计用于去除用生物素标记的不需要的细胞类型（材料表）。将 100 μL 葡聚糖珠加入细胞悬液中，并使用 1000 μL 微量移液器轻轻上下移液 2 次（材料表）混合。
3. 将含有 2% FBS 和 1 mM CaCl₂ 的 1.3 mL DPBS 加入细胞悬液中，并使用 1000 μL 微量移液管轻轻上下移液 2 次混合。将管子放入磁铁（材料表）中，在室温下孵育3分钟。
4. 将磁铁和试管倒置，将富集的活细胞悬浮液倒入新的 15 mL 锥形管中。在 4°C 下以 400 x g 离心 3 分钟。 除去大部分上清液，重悬于 1 mL DPBS + 0.04% BSA 中。用 1000 μL 微量移液管移液 3 次，轻轻混合。

4. 细胞核的分离

1. 将活细胞悬浮液在4°C下以460× g 离心5分钟，然后吸出上清液，确保细胞沉淀不被破坏。
2. 加入 100 μL 新鲜制备的 0.5x 裂解缓冲液，在冰上冷却（表 1），并用 100 μL 微量移液管移液 10 倍轻轻混合。在冰上孵育 3 分钟。
3. 将 500 μL 冷冻洗涤缓冲液（表 2）加入试管中，不混合。在4°C下以600× g 离心5分钟。

5. 细胞核的洗涤和评估

1. 吸出上清液并加入 500 μL 冷冻洗涤缓冲液以溶解剩余的完整沉淀而不混合。在4°C下以600× g 离心5分钟。 在不破坏细胞核沉淀的情况下去除所有上清液。
2. 重悬于120μL冷却稀释的细胞核缓冲液中（表3）。使用40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液（材料表）。
3. 用0.4%台盼蓝染色，并在10倍显微镜下目视评估分离细胞核的质量（材料表）。

6. 处理分离的原子核

1. 将细胞核保持在冰上。立即进行进一步处理，因为核团块可能会随着时间的推移而发生，并且需要额外的过滤步骤。

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结果

我们采用上述方案从冷冻保存的 iPSC 衍生的贴壁基质/内皮细胞和非贴壁（漂浮）造血祖细胞中提取细胞核。核分离程序的详细示意图可在 图 1 中找到。

对于形态学检查，用台盼蓝染色分离的细胞核，并在显微镜下观察。在处理之前，核形态学检查至关重要，因为碎片或聚集的细胞核会因精密微流体仪器中的堵塞而减少或阻止高质量数据的生成。从使用...

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讨论

协议中的关键步骤
分离高质量细胞核对于成功实施当前基于单细胞核的下一代测序模式至关重要，这些方法正在迅速发展。认识到对这些方法感兴趣的实验室存在存在的障碍，特别是对于冷冻保存的标本，我们的目的是为以前冷冻的细胞量身定制的核分离技术。从冷冻保存的标本中分离细胞核对于临床样本和罕见的 iPSC 衍生细胞群通常是必需的。

为特定细胞?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3