从冷冻保存的体外来源血细胞中进行核分离

摘要

我们描述了一种从冷冻保存的诱导多能干细胞衍生的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单核下一代测序分析。对于多组学实验来说，产生高质量、完整的细胞核是必不可少的，但对于一些实验室来说，这可能是进入该领域的障碍。

摘要

基于诱导多能干细胞 （iPSC） 的模型是了解血液发育的绝佳平台，而 iPSC 衍生的血细胞作为临床检测试剂和可输输细胞疗法具有转化效用。多组学分析的出现和扩展，包括但不限于单核 RNA 测序 （snRNAseq） 和转座酶可及染色质测序测定 （snATACseq），有可能彻底改变我们对细胞发育的理解。这包括使用 体外 造血模型的发育生物学。然而，从培养细胞或原代细胞中分离出完整的细胞核在技术上可能具有挑战性。不同的细胞类型通常需要根据细胞的刚度和含量进行量身定制的核制备。这些技术难题会限制数据质量，并对有兴趣进行多组学研究的研究人员构成障碍。由于细胞收集和/或处理的限制，通常需要进行标本冷冻保存，而冷冻样品可能会给完整核分离带来额外的技术挑战。在这篇手稿中，我们提供了一种详细的方法，用于在 体外 造血发育的不同阶段从 iPSC 衍生细胞中分离出高质量的细胞核，用于单核多组学工作流程。我们将方法开发的重点放在从 iPSC 衍生的贴壁基质/内皮细胞和非贴壁造血祖细胞中分离细胞核，因为它们在结构和细胞身份方面代表了非常不同的细胞类型。所描述的故障排除步骤限制了核团块和碎片，从而可以回收足够数量和质量的原子核以进行下游分析。类似的方法可用于从其他冷冻保存的细胞类型中分离细胞核。

引言

造血是一个相对特征明确的发育系统，但无法在体外概括血细胞的形成表明对相关因素的理解不完整。基于诱导多能干细胞 （iPSC） 的造血模型可以帮助阐明关键的发育因素和相关生物学。iPSC 系统还为研究血液疾病提供了出色的模型，并且基于 iPSC 的血细胞已被开发用于产生转化和治疗相关的试剂 1,2,3,4。单细胞研究已被广泛用于研究基于 iPSC 的发育生物学，包括造血过程中产生的细胞类型⁵。与无法推断细胞亚群之间关系的批量RNA测序6^相比，单细胞模式允许评估细胞异质性，并有助于细胞发育的鉴定和表征^6,7。

iPSCs造血细胞的形成需要通过原始条纹、中胚层和内皮状态进行顺序分化，以形成成血性内皮细胞。成血内皮细胞是造血干细胞和祖细胞的直接前体细胞⁸。这些细胞类型具有截然不同的形态和细胞特性。对 体外衍生造血细胞模型的表观遗传学景观和发....

研究方案

1. 细胞的冷冻保存

1. 在 1 mL 的 90% FBS 和 10% DMSO 中冷冻每 mL >1 x 10⁶ 个分离的 iPSC 衍生细胞。将冻存管放入 -80°C 的冷冻容器中，以降低冷冻速度并优化活细胞回收率（材料表）。预计会有相当大的细胞损失，这可能因培养条件和细胞身份而异。
2. 在24小时内从-80°C移动到液氮储存。

2. 细胞解冻

1. 从液氮储存中取出冷冻管，并在37°C水浴中解冻2分钟。在小冰晶仍然可见时从水浴中取出。
2. 将细胞从冷冻管转移到空的 15 mL 管中，并缓慢加入 10 mL 预热培养基 （RPMI 1640 + 10% FBS），同时小心混合。在25°C下以400× g 离心3分钟。
3. 吸出上清液，并在补充有 2% FBS 和 1 mM CaCl₂ 的 1 mL DPBS 中复溶（材料表）。用 1000 μL 微量移液管移液 3 次小心混合。转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。

3. 去除死细胞

1. 将 50 μL 死细胞去除混合物（

讨论

协议中的关键步骤
分离高质量细胞核对于成功实施当前基于单细胞核的下一代测序模式至关重要，这些方法正在迅速发展。认识到对这些方法感兴趣的实验室存在存在的障碍，特别是对于冷冻保存的标本，我们的目的是为以前冷冻的细胞量身定制的核分离技术。从冷冻保存的标本中分离细胞核对于临床样本和罕见的 iPSC 衍生细胞群通常是必需的。

为特定细胞?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3