Cryopreserved In Vitro 유래 혈액 세포로부터 핵 분리

요약

당사는 단일핵 차세대 염기서열분석 분석을 지원하기 위해 동결보존, 유도만능줄기세포, 유래 기질/내피세포 및 혈액 세포 유형에서 고품질 핵을 추출하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 고품질의 온전한 핵을 생산하는 것은 멀티오믹스 실험에 필수적이지만 일부 실험실에서는 이 분야의 진입 장벽이 될 수 있습니다.

초록

유도만능줄기세포(iPSC) 기반 모델은 혈액 발달을 이해하는 데 탁월한 플랫폼이며, iPSC 유래 혈액 세포는 임상 시험 시약 및 수혈 가능한 세포 치료제로서 중개적 유용성을 가지고 있습니다. 단핵 RNA 염기서열분석(snRNAseq) 및 Transposase-Accessible Chromatin 염기서열분석(snATACseq)을 포함하되 이에 국한되지 않는 멀티오믹스 분석의 출현과 확장은 세포 발달에 대한 우리의 이해를 혁신할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 여기에는 체외 조혈 모델을 사용하는 발달 생물학이 포함됩니다. 그러나 배양된 세포 또는 일차 세포에서 온전한 핵을 분리하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 다양한 세포 유형은 종종 세포 강성과 함량에 따라 맞춤형 핵 제제를 필요로 합니다. 이러한 기술적 어려움은 데이터 품질을 제한하고 멀티오믹스 연구에 관심이 있는 연구자에게 장벽으로 작용할 수 있습니다. 세포 수집 및/또는 처리의 한계로 인해 표본 동결 보존이 필요한 경우가 많으며, 동결 샘플은 온전한 핵 분리를 위한 추가적인 기술적 문제를 야기할 수 있습니다. 이 원고에서는 단핵 다중오믹스 워크플로우에 사용하기 위해 체외 조혈 발달의 여러 단계에서 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하는 자세한 방법을 제공합니다. 우리는 iPSC 유래 부착성 기질/내피 세포와 비부착성 조혈 전구 세포에서 핵을 분리하는 데 방법을 집중적으로 개발해 왔는데, 이는 이들 세포가 구조적 및 세포 정체성과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문입니다. 설명된 문제 해결 단계는 핵 응집과 파편을 제한하여 다운스트림 분석을 위한 충분한 양과 품질로 핵을 회수할 수 있도록 했습니다. 다른 동결 보존된 세포 유형으로부터 핵을 분리하기 위해 유사한 방법을 적용할 수 있습니다.

서문

조혈은 비교적 잘 특성화된 발달 시스템이지만, 체외에서 혈액 세포 형성을 재현할 수 없다는 것은 관련 요인에 대한 이해가 불완전하다는 것을 보여줍니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기반 조혈 모델은 주요 발달 요인 및 관련 생물학을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 시스템은 또한 혈액 질환을 연구하기 위한 우수한 모델을 제공하며, iPSC 기반 혈액 세포는 번역 및 치료 관련 시약을 생산하기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4. 단세포 연구는 조혈 과정에서 생성되는 세포 유형을 포함하여 iPSC 기반 발달 생물학을 조사하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다⁵. 세포 하위집단 간의 관계를 추론할 수 없는 벌크 RNA 염기서열분석⁶과 비교하여, 단일세포 양식은 세포 이질성을 평가할 수 있게 하고 세포 발달의 식별 및 특성화를 용이하게 할 수 있습니다 ^6,7.

iPSC에서 조혈 세포를 형성하려면 혈모성 내피 세포를 형성하기 위해 원시 줄무늬, 중배엽 및 내피 상태를 통한 순차적 분화가 필요합니다. 혈인성 내피세포는 조혈모세포와 전구세포의 직접적인 전구세포이다⁸. 이러한 세포 유형은 형태학적 특성과 세포 특성이 현저하게 다릅니다. 체외 유래 조혈 세포 모델의 후성유전학적 환경과 발달 역학에 대한 이해는 제한적이지만, 이는 iPSC 시스템의 완전한 치료 잠재력을 발휘하기 위한 필수 지식입니다. 대부분의 경우, 단일 세포 분석 양식만이 세포 집단, 전사 활성, 염색질 환경 및 이질적인 세포 제제 간의 발달을 제어하는 조절 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNAseq)과 단일 핵 RNA 염기서열 분석(snRNAseq)의 두 가지 방법론은 개별^{세포 수준9}에서 전사 통찰력을 제공할 수 있습니다. 데이터 유효성과 신뢰성을 결정하는 주요 요인은 엄격한 품질 기준을 충족하는 샘플에 대한 타협하지 않는 요구입니다. 여기에는 셀/핵 밀도, 최적의 생존력 및 최소 응집에 대한 정확한 요구 사항이 포함됩니다. 단일 핵의 준비는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이전에 동결 보존된 세포의 사용과 관련된 추가적인 문제가 있을 수 있습니다.

표준 scRNAseq 접근법에 대한 4가지 중요한 잠재적 한계에 주목합니다. 첫째, 세포 현탁액을 생성하기 위한 표준 프로토콜은 종종 냉동 보존 후 회수된 것보다 신선한 세포 또는 조직에서 추출한 제제를 참조합니다¹⁰. 이로 인해 잠재적으로 가치 있는 자원의 유용성이 줄어들 수 있습니다. 둘째, 다양한 세포 유형의 해리 효율은 가변적입니다. 예를 들어, 많은 면역 세포 유형은 비교적 쉽게 해리를 겪습니다. 대조적으로, 기질 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 일반적으로 세포외 기질과 기저막에 내장되어 있으며, 핵 분리를 복잡하게 만들 수 있는 고유한 세포 특성을 가지고 있습니다^11,12. 이러한 특성은 공격적인 해리 프로토콜을 필요로 할 수 있으며, 이는 더 섬세한 세포 집단의 구조적 무결성을 위태롭게 할 수 있습니다. 셋째, 일부 세포(예: 거핵세포)는 직경이 100μm를 초과할 수 있어 기존의 여러 상업용 단세포 플랫폼에 어려움을 초래할 수 있다⁽¹³). 또한, 부적절한 취급은 효소 가수분해 및 기계적 해리를 포함하는 세포 분리의 초기 단계에서 세포 손상 및 스트레스 반응을 유발할 수 있으며, 이는 유전자 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있습니다^11,14.

이러한 이유와 다른 이유로, 단일핵 접근법은 단일세포 방법(single cell method)에 대한 바람직한 대안이 될 수^{있다 15}. 세포막에 비해 핵막의 우수한 안정성을 감안할 때, 핵 외피는 조직 동결 보존 후에도 온전한 상태로 유지될 수^{있다 16}. 이는 핵 추출을 촉진하고 차세대 염기서열분석 양식에 적합한 시료 유형의 다양성을 향상시킬 수 있습니다. 둘째, 핵은 기계적 섭동에 대한 저항력이 높아지고 해리 동안 전사 이동이 적게 나타나는 경향이 있다¹⁴. 따라서 핵은 더 큰 RNA 안정성과 더 재현성 있는 전사 프로필을 제공할 수 있습니다. 단일핵 분석법의 세 번째 주목할 만한 장점은 세포 크기 제약이 없고 심근세포 또는 거핵세포와 같은 더 큰 세포에 적용할 수 있다는 점이다¹². 넷째, 핵은 유전자 발현, 접근 가능한 염색질 영역 및 기타 매개변수(¹⁷)에 대한 통합 분석을 통해 확장된 통찰력을 제공하는 멀티오믹스 분석에 적합한 기질 역할을 하여 세포 이질성, 발달 및 기능 상태에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다¹⁸.

조혈 발달 중 iPSC를 프로파일링함으로써 멀티오믹스 접근법은 정상 또는 병리학적 질환 모델에서 발달 과정을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 유래 세포를 일차 세포 또는 조직과 비교하면 생체 내 생물학에 대한 iPSC 모델 충실도를 평가할 수 있으며, 이를 통해 iPSC 모델을 개선하고 새로운 세포 집단 및 혈액 형성을 유도하는 요인을 발견할 수 있습니다.

많은 그룹이 핵 분리와 그에 따른 차세대 염기서열분석 분석을 성공적으로 수행했지만, 단일 핵 기반 분석을 수행하는 데 관심이 있는 일부 실험실에서는 고품질 핵을 분리하는 것이 여전히 장벽으로 남아 있습니다. 이 원고는 이전에 동결 보존된 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하기 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 부착 기질/내피 세포와 비부착 조혈 전구 세포에 초점을 맞추었는데, 이는 이들 세포가 구조 및 함량과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문에 차세대 염기서열 분석 또는 기타 실험에 적합한 고품질 핵의 회수율을 높이기 위해 맞춤형 수정 및 문제 해결이 필요하기 때문입니다.

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프로토콜

1. 세포의 동결 보존

1. 90% FBS 및 10% DMSO의 1mL에서 mL당 >1 x 10⁶ 개의 분리된 iPSC 유래 세포를 동결합니다. -80°C의 냉동 용기에 극저온을 넣어 동결 속도를 줄이고 생존 가능한 세포 회수를 최적화합니다(재료 표). 상당한 세포 손실이 예상되며, 이는 배양 조건과 세포 정체성에 따라 달라질 수 있습니다.
2. -80 °C에서 24시간 이내에 액체 질소 저장으로 이동합니다.

2. 세포의 해동

1. 액체 질소 저장고에서 극저온을 회수하고 37°C 수조에서 2분 동안 해동합니다. 작은 얼음 결정이 여전히 보일 때 수조에서 제거하십시오.
2. cryovial에서 빈 15mL 튜브로 세포를 옮기고 조심스럽게 혼합하면서 10mL의 사전 예열된 배지(RPMI 1640 + 10% FBS)를 천천히 추가합니다. 400 x g 에서 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 2% FBS 및 1mM CaCl₂ (재료 표)가 보충된 DPBS 1mL로 재구성합니다. 1000 μL 마이크로피펫으로 3회 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.

3. 죽은 세포 제거

1. 50μL의 데드 셀 제거 칵테일(Table of Materials)을 1mL의 세포 현탁액에 추가합니다. 세포 혼합물에 50μL의 비오틴 선택 칵테일을 추가합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이 단계는 세포 현탁액 내에 포함된 Annexin V⁺ 죽은 세포를 비오틴으로 라벨링합니다.
2. 30초 동안 격렬하게 소용돌이치는 덱스트란 비드는 비오틴으로 표시된 원치 않는 세포 유형의 고갈을 위해 설계되었습니다(재료 표). 세포 현탁액에 100μL의 덱스트란 비드를 추가하고 1000μL 마이크로피펫으로 위아래로 2번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다(재료 표).
3. 2% FBS 및 1mM CaCl₂ 를 함유한 DPBS 1.3mL를 세포 현탁액에 추가하고 1000μL 마이크로피펫으로 2배 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 자석(재료 표)에 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
4. 자석과 튜브를 뒤집어 농축된 라이브 셀 현탁액을 새로운 15mL 코니컬 튜브에 붓습니다. 400 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다. 대부분의 상층액을 제거하고 DPBS + 0.04% BSA 1mL에 재현탁합니다. 1000 μL 마이크로피펫으로 3번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

4. 핵의 분리

1. 460 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 활세포 현탁액을 원심분리한 다음 상층액을 흡입하여 세포 펠릿이 파괴되지 않도록 합니다.
2. 얼음에 냉각하여 갓 준비한 0.5x 용해 완충액 100μL를 추가하고(표 1) 100μL 마이크로피펫으로 10배 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
3. 500μL의 냉각 세척 버퍼(표 2)를 혼합하지 않고 튜브에 추가합니다. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.

5. 핵의 세척 및 평가

1. 상층액을 흡입하고 500μL의 냉각 세척 완충액을 추가하여 혼합하지 않고 남아 있는 온전한 펠릿을 용해시킵니다. 600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거합니다.
2. 120 μL의 냉각된 희석된 핵 완충액에 재현탁합니다(표 3). 40μm 셀 스트레이너를 사용하여 셀 현탁액을 필터링합니다(재료 표).
3. 0.4% 트리판 블루로 염색하고 10x 현미경에서 분리된 핵의 품질을 육안으로 평가합니다(재료 표).

6. 고립된 핵 처리

1. 핵을 얼음 위에 유지하십시오. 시간이 지남에 따라 핵 응집이 발생할 수 있고 추가 여과 단계가 필요할 수 있으므로 즉시 추가 처리를 진행하십시오.

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결과

우리는 앞서 언급한 프로토콜을 사용하여 냉동 보존된 iPSC 유래 부착 기질/내피 세포 및 비부착(부동) 조혈 전구 세포에서 핵을 추출했습니다. 핵 격리 절차의 자세한 개략도는 그림 1에서 확인할 수 있습니다.

형태학적 검사를 위해 분리된 핵을 트리판 블루로 염색하고 현미경으로 시각화했습니다. 핵 형태학적 검사는 처리 직전에 매우 중요한데, 파편?...

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토론

프로토콜 내의 중요한 단계
고품질 핵을 분리하는 것은 빠르게 발전하고 있는 현재의 단일 핵 기반 차세대 염기서열분석 기법을 성공적으로 구현하는 데 필수적입니다. 이러한 접근 방식, 특히 동결 보존된 표본에 관심이 있는 실험실에 대한 기존 장벽을 인식하여 우리의 의도는 이전에 동결된 세포에 적합한 핵 분리 기술을 만드는 것이었습니다. 냉동 보존된 검체에서 핵을 분리?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3