Cryopreserved In Vitro 유래 혈액 세포로부터 핵 분리

요약

당사는 단일핵 차세대 염기서열분석 분석을 지원하기 위해 동결보존, 유도만능줄기세포, 유래 기질/내피세포 및 혈액 세포 유형에서 고품질 핵을 추출하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 고품질의 온전한 핵을 생산하는 것은 멀티오믹스 실험에 필수적이지만 일부 실험실에서는 이 분야의 진입 장벽이 될 수 있습니다.

초록

유도만능줄기세포(iPSC) 기반 모델은 혈액 발달을 이해하는 데 탁월한 플랫폼이며, iPSC 유래 혈액 세포는 임상 시험 시약 및 수혈 가능한 세포 치료제로서 중개적 유용성을 가지고 있습니다. 단핵 RNA 염기서열분석(snRNAseq) 및 Transposase-Accessible Chromatin 염기서열분석(snATACseq)을 포함하되 이에 국한되지 않는 멀티오믹스 분석의 출현과 확장은 세포 발달에 대한 우리의 이해를 혁신할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 여기에는 체외 조혈 모델을 사용하는 발달 생물학이 포함됩니다. 그러나 배양된 세포 또는 일차 세포에서 온전한 핵을 분리하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 다양한 세포 유형은 종종 세포 강성과 함량에 따라 맞춤형 핵 제제를 필요로 합니다. 이러한 기술적 어려움은 데이터 품질을 제한하고 멀티오믹스 연구에 관심이 있는 연구자에게 장벽으로 작용할 수 있습니다. 세포 수집 및/또는 처리의 한계로 인해 표본 동결 보존이 필요한 경우가 많으며, 동결 샘플은 온전한 핵 분리를 위한 추가적인 기술적 문제를 야기할 수 있습니다. 이 원고에서는 단핵 다중오믹스 워크플로우에 사용하기 위해 체외 조혈 발달의 여러 단계에서 iPSC 유래 세포에서 고품질 핵을 분리하는 자세한 방법을 제공합니다. 우리는 iPSC 유래 부착성 기질/내피 세포와 비부착성 조혈 전구 세포에서 핵을 분리하는 데 방법을 집중적으로 개발해 왔는데, 이는 이들 세포가 구조적 및 세포 정체성과 관련하여 매우 다른 세포 유형을 나타내기 때문입니다. 설명된 문제 해결 단계는 핵 응집과 파편을 제한하여 다운스트림 분석을 위한 충분한 양과 품질로 핵을 회수할 수 있도록 했습니다. 다른 동결 보존된 세포 유형으로부터 핵을 분리하기 위해 유사한 방법을 적용할 수 있습니다.

서문

조혈은 비교적 잘 특성화된 발달 시스템이지만, 체외에서 혈액 세포 형성을 재현할 수 없다는 것은 관련 요인에 대한 이해가 불완전하다는 것을 보여줍니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기반 조혈 모델은 주요 발달 요인 및 관련 생물학을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. iPSC 시스템은 또한 혈액 질환을 연구하기 위한 우수한 모델을 제공하며, iPSC 기반 혈액 세포는 번역 및 치료 관련 시약을 생산하기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4. 단세포 연구는 조혈 과정에서 생성되는 세포 유형을 포함하여 iPSC 기반 발달 생물학을 조사하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다⁵. 세포 하위집단 간의 관계를 추론할 수 없는 벌크 RNA 염기서열분석⁶과 비교하여, 단일세포 양식은 세포 이질성을 평가할 수 있게 하고 세포 발달의 식별 및 특성화를 용이하게 할 수 있습니다 ^6,7.....

프로토콜

1. 세포의 동결 보존

1. 90% FBS 및 10% DMSO의 1mL에서 mL당 >1 x 10⁶ 개의 분리된 iPSC 유래 세포를 동결합니다. -80°C의 냉동 용기에 극저온을 넣어 동결 속도를 줄이고 생존 가능한 세포 회수를 최적화합니다(재료 표). 상당한 세포 손실이 예상되며, 이는 배양 조건과 세포 정체성에 따라 달라질 수 있습니다.
2. -80 °C에서 24시간 이내에 액체 질소 저장으로 이동합니다.

2. 세포의 해동

1. 액체 질소 저장고에서 극저온을 회수하고 37°C 수조에서 2분 동안 해동합니다. 작은 얼음 결정이 여전히 보일 때 수조에서 제거하십시오.
2. cryovial에서 빈 15mL 튜브로 세포를 옮기고 조심스럽게 혼합하면서 10mL의 사전 예열된 배지(RPMI 1640 + 10% FBS)를 천천히 추가합니다. 400 x g 에서 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 2% FBS 및 1mM CaCl₂ (재료 표)가 보충된 DPBS 1mL로 재구성합니....

토론

프로토콜 내의 중요한 단계
고품질 핵을 분리하는 것은 빠르게 발전하고 있는 현재의 단일 핵 기반 차세대 염기서열분석 기법을 성공적으로 구현하는 데 필수적입니다. 이러한 접근 방식, 특히 동결 보존된 표본에 관심이 있는 실험실에 대한 기존 장벽을 인식하여 우리의 의도는 이전에 동결된 세포에 적합한 핵 분리 기술을 만드는 것이었습니다. 냉동 보존된 검체에서 핵을 분리?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3