Isolamento nucleare da cellule del sangue derivate in vitro crioconservate

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per l'estrazione di nuclei di alta qualità da cellule staminali stromali/endoteliali e ematiche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte crioconservate per supportare le analisi di sequenziamento di nuova generazione a singolo nucleo. La produzione di nuclei intatti di alta qualità è fondamentale per gli esperimenti multiomici, ma può essere una barriera all'ingresso nel campo per alcuni laboratori.

Abstract

I modelli basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono piattaforme eccellenti per comprendere lo sviluppo del sangue e le cellule ematiche derivate da iPSC hanno utilità traslazionale come reagenti per test clinici e terapie cellulari trasfusibili. L'avvento e l'espansione dell'analisi multiomica, che include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNAseq) e il saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATACseq), offrono il potenziale per rivoluzionare la nostra comprensione dello sviluppo cellulare. Ciò include la biologia dello sviluppo utilizzando modelli ematopoietici in vitro . Tuttavia, può essere tecnicamente difficile isolare nuclei intatti da cellule coltivate o primarie. Diversi tipi di cellule spesso richiedono preparazioni nucleari su misura a seconda della rigidità e del contenuto cellulare. Queste difficoltà tecniche possono limitare la qualità dei dati e fungere da barriera per i ricercatori interessati a perseguire studi multiomici. La crioconservazione dei campioni è spesso necessaria a causa delle limitazioni con la raccolta e/o l'elaborazione delle cellule e i campioni congelati possono presentare ulteriori sfide tecniche per l'isolamento nucleare intatto. In questo manoscritto, forniamo un metodo dettagliato per isolare nuclei di alta qualità da cellule derivate da iPSC in diverse fasi dello sviluppo ematopoietico in vitro per l'uso in flussi di lavoro multiomici a nucleo singolo. Abbiamo focalizzato lo sviluppo del metodo sull'isolamento di nuclei da cellule stromali/endoteliali aderenti derivate da iPSC e da cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti, in quanto queste rappresentano tipi cellulari molto diversi per quanto riguarda l'identità strutturale e cellulare. Le fasi di risoluzione dei problemi descritte hanno limitato l'aggregazione nucleare e i detriti, consentendo il recupero di nuclei in quantità e qualità sufficienti per le analisi a valle. Metodi simili possono essere adattati per isolare nuclei da altri tipi di cellule crioconservate.

Introduzione

L'emopoiesi è un sistema di sviluppo relativamente ben caratterizzato, ma l'incapacità di ricapitolare la formazione delle cellule del sangue in vitro dimostra una comprensione incompleta dei fattori correlati. I modelli di emopoiesi basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aiutare a chiarire i fattori chiave dello sviluppo e la biologia correlata. Il sistema iPSC offre anche un eccellente modello per studiare le malattie del sangue e le cellule del sangue basate su iPSC sono state sviluppate per produrre reagenti traslazionali e terapeuticamente rilevanti 1,2,3,4. Gli studi su singole cellule sono stati ampiamente utilizzati per studiare la biologia dello sviluppo basata sulle iPSC, compresi i tipi di cellule prodotte durante l'emopoiesi⁵. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di massa, che non può dedurre relazioni tra sottopopolazioni cellulari⁶, le modalità a singola cellula consentono valutazioni dell'eterogeneità cellulare e possono facilitare l'identificazione e la caratterizzazione dello sviluppo cellulare ^6,7.

La formazione di cellule ematopoietiche da iPSC richiede una differenziazione sequenziale attraverso striature primitive, mesoderma e stati endoteliali per formare cellule endoteliali emogeniche. Le cellule endoteliali emogeniche sono precursori diretti delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici⁸. Questi tipi di cellule hanno proprietà morfologiche e cellulari notevolmente diverse. C'è una comprensione limitata del panorama epigenetico e delle dinamiche di sviluppo dei modelli cellulari ematopoietici derivati in vitro, sebbene questa sia una conoscenza essenziale per sbloccare il pieno potenziale terapeutico del sistema iPSC. In molti casi, solo le modalità di analisi di singole cellule consentono l'identificazione di popolazioni cellulari, attività trascrizionali, paesaggi della cromatina e meccanismi regolatori che governano lo sviluppo tra preparazioni cellulari eterogenee.

Due metodologie, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNAseq), possono rivelare intuizioni trascrizionali a livello di singola cellula⁹. Uno dei fattori principali che determinano la validità e l'affidabilità dei dati è la necessità senza compromessi di campioni che soddisfino rigorosi criteri di qualità. Questi includono requisiti precisi per la densità cellulare/nucleare, la vitalità ottimale e l'aggregazione minima. La preparazione di singoli nuclei può essere tecnicamente impegnativa. Ci possono essere ulteriori sfide associate all'uso di celle precedentemente crioconservate.

Notiamo quattro importanti potenziali limitazioni agli approcci standard di scRNAseq. In primo luogo, i protocolli standard per la generazione di sospensioni cellulari spesso fanno riferimento a preparati da cellule o tessuti freschi, piuttosto che a quelli recuperati dopo la crioconservazione¹⁰. Ciò può ridurre l'utilità di risorse potenzialmente preziose. In secondo luogo, l'efficienza di dissociazione dei diversi tipi di cellule è variabile. Ad esempio, molti tipi di cellule immunitarie subiscono la dissociazione con relativa facilità. Al contrario, le cellule stromali, i fibroblasti e le cellule endoteliali, che sono normalmente incorporate nella matrice extracellulare e nella membrana basale, hanno proprietà cellulari uniche che possono complicare l'isolamento dei nuclei^11,12. Queste proprietà possono richiedere protocolli di dissociazione aggressivi, che possono mettere a repentaglio l'integrità strutturale delle popolazioni cellulari più delicate. In terzo luogo, alcune cellule (ad esempio, i megacariociti) possono superare i 100 μm di diametro e porre difficoltà a diverse piattaforme commerciali a singola cellula esistenti¹³. Inoltre, una manipolazione impropria può portare a danni cellulari e risposte allo stress durante le fasi iniziali dell'isolamento cellulare, che coinvolgono l'idrolisi enzimatica e la dissociazione meccanica, che possono influire sui profili di espressione genica^11,14.

Per questi e altri motivi, un approccio a nucleo singolo può essere un'alternativa preferibile ai metodi a singola cellula¹⁵. Data la stabilità superiore della membrana nucleare rispetto alla membrana cellulare, l'involucro nucleare può rimanere intatto anche dopo la crioconservazione tissutale¹⁶. Ciò può facilitare l'estrazione nucleare e migliorare la diversità dei tipi di campioni adatti alle modalità di sequenziamento di nuova generazione. In secondo luogo, i nuclei mostrano un'elevata resistenza alle perturbazioni meccaniche e tendono a manifestare meno spostamenti trascrizionali durante la dissociazione¹⁴. Pertanto, i nuclei possono fornire una maggiore stabilità dell'RNA e profili trascrizionali più riproducibili. Un terzo vantaggio degno di nota dei metodi a singolo nucleo è l'assenza di vincoli di dimensione cellulare e l'applicabilità per cellule più grandi, come i cardiomiociti o i megacariociti¹². In quarto luogo, i nuclei fungono da substrati adatti per le analisi multiomiche, che offrono informazioni estese dall'analisi integrata dell'espressione genica, delle regioni della cromatina accessibili e di altri parametri¹⁷, consentendo una comprensione più profonda dell'eterogeneità cellulare, dello sviluppo e degli stati funzionali¹⁸.

Profilando le iPSC durante lo sviluppo ematopoietico, gli approcci multiomici possono aiutare a definire i processi di sviluppo in modelli di malattia normali o patologici. Il confronto tra cellule derivate da iPSC e cellule o tessuti primari può anche fornire una valutazione della fedeltà del modello di iPSC alla biologia in vivo , facilitando il miglioramento del modello di iPSC e la scoperta di nuove popolazioni cellulari e fattori che guidano la formazione del sangue.

Sebbene molti gruppi abbiano affrontato con successo l'isolamento nucleare e la conseguente analisi di sequenziamento di nuova generazione, l'isolamento di nuclei di alta qualità rimane un ostacolo per alcuni laboratori interessati a eseguire analisi basate su singoli nuclei. Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo per isolare nuclei di qualità da cellule derivate da iPSC precedentemente crioconservate. Ci siamo concentrati sulle cellule stromali/endoteliali aderenti e sulle cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti, poiché queste rappresentano tipi di cellule molto diversi per quanto riguarda la struttura e il contenuto che richiedono modifiche e risoluzione dei problemi su misura per aumentare il recupero di nuclei di alta qualità suscettibili per il sequenziamento di nuova generazione o altri esperimenti.

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Protocollo

1. Crioconservazione delle cellule

1. Congelare >1 x 10⁶ cellule isolate derivate da iPSC per mL in 1 mL di FBS al 90% e DMSO al 10%. Mettere i crioviali in un contenitore di congelamento a -80°C per ridurre la velocità di congelamento e ottimizzare il recupero delle cellule vitali (Tabella dei materiali). Prevedere una notevole perdita cellulare, che può variare in base alle condizioni di coltura e all'identità cellulare.
2. Passare da -80 °C allo stoccaggio di azoto liquido entro 24 ore.

2. Scongelamento delle cellule

1. Recuperare il crioviale dalla conservazione di azoto liquido e scongelarlo in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Togliere dal bagnomaria mentre sono ancora visibili piccoli cristalli di ghiaccio.
2. Trasferire le cellule dal crioviale in una provetta vuota da 15 mL e aggiungere lentamente 10 mL di terreno preriscaldato (RPMI 1640 + 10% FBS) mescolando accuratamente. Centrifugare a 400 x g per 3 min a 25 °C.
3. Aspirare il surnatante e ricostituire in 1 mL di DPBS integrato con FBS al 2% e 1 mM di CaCl₂ (Tabella dei materiali). Miscelare accuratamente pipettando 3 volte con una micropipetta da 1000 μl. Trasferire in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL.

3. Rimozione delle cellule morte

1. Aggiungere 50 μL di cocktail per la rimozione delle cellule morte (Tabella dei materiali) a 1 mL di sospensione cellulare. Aggiungere 50 μl di cocktail di selezione di biotina alla miscela cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Questi passaggi marcano le cellule morte dell'annessina V⁺ contenute nella sospensione cellulare con la biotina.
2. Vorticare vigorosamente per 30 s, le perle di destrano progettate per l'esaurimento dei tipi di cellule indesiderate etichettate con biotina (Tabella dei materiali). Aggiungere 100 μl di perle di destrano alla sospensione cellulare e mescolare pipettando delicatamente su e giù 2 volte con una micropipetta da 1000 μl (Tabella dei materiali).
3. Aggiungere 1,3 mL di DPBS contenente il 2% di FBS e 1 mM di CaCl₂ alla sospensione cellulare e mescolare pipettando delicatamente su e giù 2 volte con una micropipetta da 1000 μL. Posizionare la provetta nel magnete (Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
4. Capovolgere il magnete e la provetta per versare la sospensione di cellule vive arricchita in una nuova provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 400 x g per 3 min a 4°C. Rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere in 1 mL di DPBS + 0,04% BSA. Miscelare delicatamente pipettando 3 volte con una micropipetta da 1000 μl.

4. Isolamento dei nuclei

1. Centrifugare la sospensione di cellule vive a 460 x g per 5 minuti a 4 °C e quindi aspirare il surnatante, garantendo l'assenza di interruzioni del pellet cellulare.
2. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi 0,5x appena preparato e raffreddato su ghiaccio (Tabella 1) e mescolare delicatamente pipettando 10x con una micropipetta da 100 μl. Incubare 3 minuti con ghiaccio.
3. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio refrigerato (Tabella 2) alla provetta senza mescolare. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.

5. Lavaggio e valutazione dei nuclei

1. Aspirare il surnatante e aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio refrigerato per sciogliere il pellet intatto rimanente senza mescolare. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere tutto il surnatante senza interrompere il pellet dei nuclei.
2. Risospendere in 120 μl di tampone nuclei diluiti raffreddato (Tabella 3). Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 40 μm (Tabella dei materiali).
3. Colorare con blu di tripano allo 0,4% e valutare visivamente la qualità dei nuclei isolati al microscopio 10x (Tabella dei materiali).

6. Elaborazione di nuclei isolati

1. Mantieni i nuclei sul ghiaccio. Procedere immediatamente a un'ulteriore elaborazione, poiché nel tempo può verificarsi aggregazione nucleare e richiedere ulteriori fasi di filtrazione.

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Risultati

Abbiamo impiegato il suddetto protocollo per estrarre nuclei da cellule stromali/endoteliali aderenti derivate da iPSC crioconservate e da cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti (galleggianti). Una rappresentazione schematica dettagliata della procedura di isolamento nucleare si trova nella Figura 1.

Per l'esame morfologico, i nuclei isolati sono stati colorati con blu di tripano e visualizzati al microscopio. L'esame morfologico nucleare è fondamentale...

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Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
L'isolamento di nuclei di alta qualità è essenziale per l'implementazione di successo delle attuali modalità di sequenziamento di nuova generazione basate su un singolo nucleo, che sono in rapida evoluzione. Riconoscendo le barriere esistenti per i laboratori interessati a questi approcci, in particolare per i campioni crioconservati, la nostra intenzione era quella di creare una tecnica di isolamento nucleare su misura per le cellule precedentemente cong...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3