Isolamento nucleare da cellule del sangue derivate in vitro crioconservate

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per l'estrazione di nuclei di alta qualità da cellule staminali stromali/endoteliali e ematiche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte crioconservate per supportare le analisi di sequenziamento di nuova generazione a singolo nucleo. La produzione di nuclei intatti di alta qualità è fondamentale per gli esperimenti multiomici, ma può essere una barriera all'ingresso nel campo per alcuni laboratori.

Abstract

I modelli basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono piattaforme eccellenti per comprendere lo sviluppo del sangue e le cellule ematiche derivate da iPSC hanno utilità traslazionale come reagenti per test clinici e terapie cellulari trasfusibili. L'avvento e l'espansione dell'analisi multiomica, che include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNAseq) e il saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATACseq), offrono il potenziale per rivoluzionare la nostra comprensione dello sviluppo cellulare. Ciò include la biologia dello sviluppo utilizzando modelli ematopoietici in vitro . Tuttavia, può essere tecnicamente difficile isolare nuclei intatti da cellule coltivate o primarie. Diversi tipi di cellule spesso richiedono preparazioni nucleari su misura a seconda della rigidità e del contenuto cellulare. Queste difficoltà tecniche possono limitare la qualità dei dati e fungere da barriera per i ricercatori interessati a perseguire studi multiomici. La crioconservazione dei campioni è spesso necessaria a causa delle limitazioni con la raccolta e/o l'elaborazione delle cellule e i campioni congelati possono presentare ulteriori sfide tecniche per l'isolamento nucleare intatto. In questo manoscritto, forniamo un metodo dettagliato per isolare nuclei di alta qualità da cellule derivate da iPSC in diverse fasi dello sviluppo ematopoietico in vitro per l'uso in flussi di lavoro multiomici a nucleo singolo. Abbiamo focalizzato lo sviluppo del metodo sull'isolamento di nuclei da cellule stromali/endoteliali aderenti derivate da iPSC e da cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti, in quanto queste rappresentano tipi cellulari molto diversi per quanto riguarda l'identità strutturale e cellulare. Le fasi di risoluzione dei problemi descritte hanno limitato l'aggregazione nucleare e i detriti, consentendo il recupero di nuclei in quantità e qualità sufficienti per le analisi a valle. Metodi simili possono essere adattati per isolare nuclei da altri tipi di cellule crioconservate.

Introduzione

L'emopoiesi è un sistema di sviluppo relativamente ben caratterizzato, ma l'incapacità di ricapitolare la formazione delle cellule del sangue in vitro dimostra una comprensione incompleta dei fattori correlati. I modelli di emopoiesi basati su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aiutare a chiarire i fattori chiave dello sviluppo e la biologia correlata. Il sistema iPSC offre anche un eccellente modello per studiare le malattie del sangue e le cellule del sangue basate su iPSC sono state sviluppate per produrre reagenti traslazionali e terapeuticamente rilevanti 1,2,3,4.

Protocollo

1. Crioconservazione delle cellule

1. Congelare >1 x 10⁶ cellule isolate derivate da iPSC per mL in 1 mL di FBS al 90% e DMSO al 10%. Mettere i crioviali in un contenitore di congelamento a -80°C per ridurre la velocità di congelamento e ottimizzare il recupero delle cellule vitali (Tabella dei materiali). Prevedere una notevole perdita cellulare, che può variare in base alle condizioni di coltura e all'identità cellulare.
2. Passare da -80 °C allo stoccaggio di azoto liquido entro 24 ore.

2. Scongelamento delle cellule

1. Recuperare il crioviale dalla ....

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
L'isolamento di nuclei di alta qualità è essenziale per l'implementazione di successo delle attuali modalità di sequenziamento di nuova generazione basate su un singolo nucleo, che sono in rapida evoluzione. Riconoscendo le barriere esistenti per i laboratori interessati a questi approcci, in particolare per i campioni crioconservati, la nostra intenzione era quella di creare una tecnica di isolamento nucleare su misura per le cellule precedentemente cong.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3