Выделение ядра из криоконсервированных клеток крови, полученных in vitro

Резюме

Мы описываем протокол экстракции высококачественных ядер из криоконсервированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из стромальных/эндотелиальных клеток и клеток крови, для поддержки одноядерных анализов секвенирования нового поколения. Производство высококачественных, неповрежденных ядер является обязательным условием для экспериментов по мультиомике, но для некоторых лабораторий может стать препятствием для входа в эту область.

Аннотация

Модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) являются отличными платформами для понимания развития крови, а клетки крови, полученные из ИПСК, имеют трансляционную полезность в качестве реагентов для клинических испытаний и трансфузионной клеточной терапии. Появление и расширение мультиомного анализа, включающего, помимо прочего, одноядерное секвенирование РНК (snRNAseq) и анализ на транспозазо-доступное секвенирование хроматина (snATACseq), открывает возможности для революции в нашем понимании развития клеток. Это включает в себя биологию развития с использованием гемопоэтических моделей in vitro . Тем не менее, может быть технически сложно выделить неповрежденные ядра из культивируемых или первичных клеток. Различные типы клеток часто требуют индивидуальной подготовки ядра в зависимости от жесткости и содержания клеток. Эти технические трудности могут ограничивать качество данных и выступать в качестве барьера для исследователей, заинтересованных в проведении исследований мультиомики. Криоконсервация образцов часто необходима из-за ограничений по сбору и/или обработке клеток, а замороженные образцы могут представлять дополнительные технические проблемы для изоляции неповрежденных ядер. В данной рукописи мы подробно описываем метод выделения высококачественных ядер из клеток, полученных из iPSC, на разных стадиях развития гемопоэза in vitro для использования в рабочих процессах многоядерной мультиомики. Мы сосредоточили разработку метода на выделении ядер из адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных клеток-предшественников, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структурной и клеточной идентичности. Описанные шаги по устранению неполадок ограничили образование комков ядер и мусора, что позволило восстановить ядра в достаточном количестве и качестве для последующего анализа. Подобные методы могут быть адаптированы для выделения ядер из других типов криоконсервированных клеток.

Введение

Кроветворение является относительно хорошо охарактеризованной системой развития, но неспособность воспроизводить образование клеток крови in vitro демонстрирует неполное понимание связанных с этим факторов. Модели гемопоэза на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) могут помочь пролить свет на ключевые факторы развития и связанную с ними биологию. Система iPSC также предлагает отличную модель для изучения заболеваний крови, а клетки крови на основе iPSC были разработаны для производства трансляционных и терапевтически значимых реагентов 1,2,3,4.....

протокол

1. Криоконсервация клеток

1. Замораживание >1 x 10⁶ изолированных клеток, полученных из iPSC, на мл в 1 мл 90% FBS и 10% ДМСО. Поместите криовиалы в контейнер для заморозки при температуре -80°C, чтобы снизить скорость замораживания и оптимизировать восстановление жизнеспособных клеток (Таблица материалов). Ожидайте значительной потери клеток, которая может варьироваться в зависимости от условий культивирования и идентичности клеток.
2. Перейдите от -80 °C к хранилищу жидкого азота в течение 24 часов.

2. Размораживание клеток

1. Извлеките криовиал из хр....

Результаты

С помощью вышеупомянутого протокола мы выделили ядра из криоконсервированных адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных (плавающих) гемопоэтических клеток-предшественников. Подробное схематическое изображение процедуры ядерной изоляции можно на.......

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
Выделение высококачественных ядер имеет важное значение для успешной реализации современных методов секвенирования следующего поколения на основе одного ядра, которые быстро развиваются. Признавая существующие барьеры для лабораторий.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3