Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Мы описываем протокол экстракции высококачественных ядер из криоконсервированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из стромальных/эндотелиальных клеток и клеток крови, для поддержки одноядерных анализов секвенирования нового поколения. Производство высококачественных, неповрежденных ядер является обязательным условием для экспериментов по мультиомике, но для некоторых лабораторий может стать препятствием для входа в эту область.
Модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) являются отличными платформами для понимания развития крови, а клетки крови, полученные из ИПСК, имеют трансляционную полезность в качестве реагентов для клинических испытаний и трансфузионной клеточной терапии. Появление и расширение мультиомного анализа, включающего, помимо прочего, одноядерное секвенирование РНК (snRNAseq) и анализ на транспозазо-доступное секвенирование хроматина (snATACseq), открывает возможности для революции в нашем понимании развития клеток. Это включает в себя биологию развития с использованием гемопоэтических моделей in vitro . Тем не менее, может быть технически сложно выделить неповрежденные ядра из культивируемых или первичных клеток. Различные типы клеток часто требуют индивидуальной подготовки ядра в зависимости от жесткости и содержания клеток. Эти технические трудности могут ограничивать качество данных и выступать в качестве барьера для исследователей, заинтересованных в проведении исследований мультиомики. Криоконсервация образцов часто необходима из-за ограничений по сбору и/или обработке клеток, а замороженные образцы могут представлять дополнительные технические проблемы для изоляции неповрежденных ядер. В данной рукописи мы подробно описываем метод выделения высококачественных ядер из клеток, полученных из iPSC, на разных стадиях развития гемопоэза in vitro для использования в рабочих процессах многоядерной мультиомики. Мы сосредоточили разработку метода на выделении ядер из адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных клеток-предшественников, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структурной и клеточной идентичности. Описанные шаги по устранению неполадок ограничили образование комков ядер и мусора, что позволило восстановить ядра в достаточном количестве и качестве для последующего анализа. Подобные методы могут быть адаптированы для выделения ядер из других типов криоконсервированных клеток.
Кроветворение является относительно хорошо охарактеризованной системой развития, но неспособность воспроизводить образование клеток крови in vitro демонстрирует неполное понимание связанных с этим факторов. Модели гемопоэза на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) могут помочь пролить свет на ключевые факторы развития и связанную с ними биологию. Система iPSC также предлагает отличную модель для изучения заболеваний крови, а клетки крови на основе iPSC были разработаны для производства трансляционных и терапевтически значимых реагентов 1,2,3,4.....
1. Криоконсервация клеток
2. Размораживание клеток
С помощью вышеупомянутого протокола мы выделили ядра из криоконсервированных адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных (плавающих) гемопоэтических клеток-предшественников. Подробное схематическое изображение процедуры ядерной изоляции можно на.......
Критические шаги в рамках протокола
Выделение высококачественных ядер имеет важное значение для успешной реализации современных методов секвенирования следующего поколения на основе одного ядра, которые быстро развиваются. Признавая существующие барьеры для лабораторий.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Авторы благодарят Джейсона Хатакеяму (10x Genomics) и Диану Слейтер (Diana Slater) (Детская больница Филадельфийского центра прикладной геномики) за рекомендации и предложения. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (HL156052 к CST).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Reagents | |||
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
Cells | |||
Induced pluripotent stem cells | N/A | N/A | The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
Cell Staining Reagents | |||
Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
Dead Cell Removal Reagents | |||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube. |
Materials | |||
10 µl Micropipette | Wards science | 470231606 | |
100 µl Micropipette | Wards science | 470231598 | |
1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
1000 µl Micropipette | Wards science | 470231602 | |
2.0 ml Cryogenic vials | Corning | 431386 | |
20 µl Micropipette | Wards science | 470231608 | |
200 µl Micropipette | Wards science | 470231600 | |
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
Counting chamber | CytoSMART | 699910591 | |
Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 51000001 | |
Nuclei Isolation Reagents | Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer, Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
Dead Cell Removal kit | STEMCELL | 17899 | |
Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma | 59222C | |
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
Other equipment | |||
Automated cell counter | CytoSMART | 699910591 | |
Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены