Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол экстракции высококачественных ядер из криоконсервированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из стромальных/эндотелиальных клеток и клеток крови, для поддержки одноядерных анализов секвенирования нового поколения. Производство высококачественных, неповрежденных ядер является обязательным условием для экспериментов по мультиомике, но для некоторых лабораторий может стать препятствием для входа в эту область.

Аннотация

Модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) являются отличными платформами для понимания развития крови, а клетки крови, полученные из ИПСК, имеют трансляционную полезность в качестве реагентов для клинических испытаний и трансфузионной клеточной терапии. Появление и расширение мультиомного анализа, включающего, помимо прочего, одноядерное секвенирование РНК (snRNAseq) и анализ на транспозазо-доступное секвенирование хроматина (snATACseq), открывает возможности для революции в нашем понимании развития клеток. Это включает в себя биологию развития с использованием гемопоэтических моделей in vitro . Тем не менее, может быть технически сложно выделить неповрежденные ядра из культивируемых или первичных клеток. Различные типы клеток часто требуют индивидуальной подготовки ядра в зависимости от жесткости и содержания клеток. Эти технические трудности могут ограничивать качество данных и выступать в качестве барьера для исследователей, заинтересованных в проведении исследований мультиомики. Криоконсервация образцов часто необходима из-за ограничений по сбору и/или обработке клеток, а замороженные образцы могут представлять дополнительные технические проблемы для изоляции неповрежденных ядер. В данной рукописи мы подробно описываем метод выделения высококачественных ядер из клеток, полученных из iPSC, на разных стадиях развития гемопоэза in vitro для использования в рабочих процессах многоядерной мультиомики. Мы сосредоточили разработку метода на выделении ядер из адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных клеток-предшественников, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структурной и клеточной идентичности. Описанные шаги по устранению неполадок ограничили образование комков ядер и мусора, что позволило восстановить ядра в достаточном количестве и качестве для последующего анализа. Подобные методы могут быть адаптированы для выделения ядер из других типов криоконсервированных клеток.

Введение

Кроветворение является относительно хорошо охарактеризованной системой развития, но неспособность воспроизводить образование клеток крови in vitro демонстрирует неполное понимание связанных с этим факторов. Модели гемопоэза на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) могут помочь пролить свет на ключевые факторы развития и связанную с ними биологию. Система iPSC также предлагает отличную модель для изучения заболеваний крови, а клетки крови на основе iPSC были разработаны для производства трансляционных и терапевтически значимых реагентов 1,2,3,4.....

протокол

1. Криоконсервация клеток

  1. Замораживание >1 x 106 изолированных клеток, полученных из iPSC, на мл в 1 мл 90% FBS и 10% ДМСО. Поместите криовиалы в контейнер для заморозки при температуре -80°C, чтобы снизить скорость замораживания и оптимизировать восстановление жизнеспособных клеток (Таблица материалов). Ожидайте значительной потери клеток, которая может варьироваться в зависимости от условий культивирования и идентичности клеток.
  2. Перейдите от -80 °C к хранилищу жидкого азота в течение 24 часов.

2. Размораживание клеток

  1. Извлеките криовиал из хр....

Результаты

С помощью вышеупомянутого протокола мы выделили ядра из криоконсервированных адгезивных стромальных/эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, и неадгезивных (плавающих) гемопоэтических клеток-предшественников. Подробное схематическое изображение процедуры ядерной изоляции можно на.......

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
Выделение высококачественных ядер имеет важное значение для успешной реализации современных методов секвенирования следующего поколения на основе одного ядра, которые быстро развиваются. Признавая существующие барьеры для лабораторий.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят Джейсона Хатакеяму (10x Genomics) и Диану Слейтер (Diana Slater) (Детская больница Филадельфийского центра прикладной геномики) за рекомендации и предложения. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (HL156052 к CST).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)Sigma673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Corning21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)GeminiBio100106
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875093
Cells
Induced pluripotent stem cellsN/AN/AThe iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents 
Trypan Blue SolutionCorning25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) KitStemCell Technologies17899This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl MicropipetteWards science470231606
100 µl MicropipetteWards science470231598
1000 µl Extended Universal TipOxford Lab ProductsOAR-1000XL-SLF
1000 µl MicropipetteWards science470231602
2.0 ml Cryogenic vialsCorning431386
20 µl MicropipetteWards science470231608
200 µl MicropipetteWards science470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom TubeFalcon352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip StationCorning4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip StationCorning4144
Counting chamberCytoSMART699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm Bel-ArtH136800040
MagnetStemCell Technologies18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing ContainerNalgene51000001
Nuclei Isolation ReagentsNuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kitSTEMCELL17899
DigitoninThermo Fisher ScientificBN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)Sigma646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µmBel-ArtH136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock SolutionMiltenyi Biotec130091376
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigmaM1028
Nonidet P40 SubstituteSigma74385
Nuclease-Free WaterThermo Fisher ScientificAM9937
Nuclei Buffer (20X)10X Genomics2000153
Protector RNase inhibitorSigma3335399001
Sodium chloride (NaCl)SigmaS7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4SigmaT2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)SigmaT3252-500G
Tween 20Bio-Rad1662404
Other equipment
Automated cell counterCytoSMART699910591
MicroscopeZeissPrimostar 3

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitroIPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены