Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro

Resumen

Describimos un protocolo para extraer núcleos de alta calidad de tipos de células madre pluripotentes inducidas, estromales/endoteliales y de células sanguíneas criopreservadas para respaldar los análisis de secuenciación de próxima generación de un solo núcleo. La producción de núcleos intactos de alta calidad es imprescindible para los experimentos multiómicos, pero puede ser una barrera de entrada en el campo para algunos laboratorios.

Resumen

Los modelos basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son excelentes plataformas para comprender el desarrollo sanguíneo, y las células sanguíneas derivadas de iPSC tienen utilidad traslacional como reactivos de pruebas clínicas y terapias celulares transfundibles. El advenimiento y la expansión del análisis multiómico, que incluye, entre otros, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq) y el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATACseq), ofrece el potencial de revolucionar nuestra comprensión del desarrollo celular. Esto incluye la biología del desarrollo utilizando modelos hematopoyéticos in vitro . Sin embargo, puede ser técnicamente difícil aislar núcleos intactos de células cultivadas o primarias. Los diferentes tipos de células a menudo requieren preparaciones nucleares personalizadas en función de la rigidez y el contenido celular. Estas dificultades técnicas pueden limitar la calidad de los datos y actuar como una barrera para los investigadores interesados en realizar estudios multiómicos. La criopreservación de muestras suele ser necesaria debido a las limitaciones de la recolección y/o el procesamiento de células, y las muestras congeladas pueden presentar desafíos técnicos adicionales para el aislamiento nuclear intacto. En este manuscrito, proporcionamos un método detallado para aislar núcleos de alta calidad de células derivadas de iPSC en diferentes etapas del desarrollo hematopoyético in vitro para su uso en flujos de trabajo multiómicos de un solo núcleo. Hemos centrado el desarrollo del método en el aislamiento de núcleos de células estromal/endoteliales adherentes derivadas de iPSC y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos celulares muy diferentes en cuanto a identidad estructural y celular. Los pasos de solución de problemas descritos limitaron la aglomeración y los desechos nucleares, lo que permitió la recuperación de núcleos en cantidad y calidad suficientes para los análisis posteriores. Métodos similares pueden adaptarse para aislar núcleos de otros tipos de células criopreservadas.

Introducción

La hematopoyesis es un sistema de desarrollo relativamente bien caracterizado, pero la incapacidad de recapitular la formación de células sanguíneas in vitro demuestra una comprensión incompleta de los factores relacionados. Los modelos de hematopoyesis basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden ayudar a dilucidar los factores clave del desarrollo y la biología relacionada. El sistema iPSC también ofrece un excelente modelo para estudiar los trastornos sanguíneos, y se han desarrollado células sanguíneas basadas en iPSC para producir reactivos relevantes desde el punto de vista traslacional y terapéutico 1,2,3,4. Los estudios de células individuales se han utilizado ampliamente para investigar la biología del desarrollo basada en iPSC, incluidos los tipos de células que se producen durante la hematopoyesis⁵. En comparación con la secuenciación masiva de ARN, que no puede inferir relaciones entre subpoblaciones celulares⁶, las modalidades de una sola célula permiten evaluar la heterogeneidad celular y pueden facilitar la identificación y caracterización del desarrollo celular ^6,7.

La formación de células hematopoyéticas a partir de iPSC requiere una diferenciación secuencial a través de estados primitivos de raya, mesodermo y endotelial para formar células endoteliales hemogénicas. Las células endoteliales hemogénicas son precursoras directas de las células madre y progenitoras hematopoyéticas⁸. Estos tipos de células tienen propiedades morfológicas y celulares notablemente diferentes. Existe una comprensión limitada del panorama epigenético y la dinámica del desarrollo de los modelos de células hematopoyéticas derivadas in vitro, aunque este es un conocimiento esencial para desbloquear todo el potencial terapéutico del sistema iPSC. En muchos casos, solo las modalidades de análisis de células individuales permiten la identificación de poblaciones celulares, actividades transcripcionales, paisajes de cromatina y mecanismos reguladores que gobiernan el desarrollo entre preparaciones celulares heterogéneas.

Dos metodologías, la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq), pueden revelar información transcripcional a nivel de célula individual⁹. Un factor principal que dicta la validez y fiabilidad de los datos es la necesidad intransigente de muestras que cumplan con estrictos criterios de calidad. Estos incluyen requisitos precisos para la densidad celular/nuclear, viabilidad óptima y aglomeración mínima. La preparación de núcleos individuales puede ser un desafío técnico. Puede haber desafíos adicionales asociados con el uso de células previamente criopreservadas.

Observamos cuatro limitaciones potenciales importantes para los enfoques estándar de scRNAseq. En primer lugar, los protocolos estándar para generar suspensiones celulares a menudo hacen referencia a preparaciones a partir de células o tejidos frescos, en lugar de los recuperados después de la criopreservación¹⁰. Esto puede reducir la utilidad de recursos potencialmente valiosos. En segundo lugar, la eficiencia de disociación de diversos tipos de células es variable. Por ejemplo, muchos tipos de células inmunitarias se disocian con relativa facilidad. Por el contrario, las células estromalas, los fibroblastos y las células endoteliales, que normalmente están incrustadas en la matriz extracelular y la membrana basal, tienen propiedades celulares únicas que pueden complicar el aislamiento de los núcleos^11,12. Estas propiedades pueden requerir protocolos de disociación agresivos, lo que puede poner en peligro la integridad estructural de las poblaciones celulares más delicadas. En tercer lugar, algunas células (por ejemplo, los megacariocitos) pueden superar los 100 μm de diámetro y plantean dificultades para varias plataformas comerciales unicelulares existentes¹³. Además, el manejo inadecuado puede provocar daño celular y respuestas de estrés durante los pasos iniciales del aislamiento celular, involucrando hidrólisis enzimática y disociación mecánica, lo que puede afectar los perfiles de expresión génica^11,14.

Por estas y otras razones, un enfoque de un solo núcleo puede ser una alternativa preferible a los métodos de una sola célula¹⁵. Dada la estabilidad superior de la membrana nuclear en comparación con la membrana celular, la envoltura nuclear puede permanecer intacta incluso después de la criopreservación de tejidos¹⁶. Esto puede facilitar la extracción nuclear y mejorar la diversidad de tipos de muestras adecuados para las modalidades de secuenciación de próxima generación. En segundo lugar, los núcleos exhiben una mayor resistencia a las perturbaciones mecánicas y tienden a manifestar menos cambios transcripcionales durante la disociación¹⁴. Por lo tanto, los núcleos pueden proporcionar una mayor estabilidad del ARN y perfiles transcripcionales más reproducibles. Una tercera ventaja notable de los métodos de núcleo único es la falta de restricciones de tamaño celular y la aplicabilidad para células más grandes, como cardiomiocitos o megacariocitos¹². En cuarto lugar, los núcleos sirven como sustratos adecuados para los análisis multiómicos, que ofrecen una visión ampliada del análisis integrado de la expresión génica, las regiones de cromatina accesibles y otros parámetros¹⁷, lo que permite una comprensión más profunda de la heterogeneidad, el desarrollo y los estados funcionales de las células¹⁸.

Al perfilar las iPSC durante el desarrollo hematopoyético, los enfoques multiómicos pueden ayudar a definir los procesos de desarrollo en modelos de enfermedades normales o patológicas. Las comparaciones de células derivadas de iPSC con células o tejidos primarios también pueden proporcionar una evaluación de la fidelidad del modelo de iPSC a la biología in vivo , lo que facilita la mejora del modelo de iPSC y el descubrimiento de nuevas poblaciones celulares y factores que impulsan la formación de sangre.

Aunque muchos grupos han navegado con éxito el aislamiento nuclear y el análisis de secuenciación de próxima generación resultante, el aislamiento de núcleos de alta calidad sigue siendo una barrera para algunos laboratorios interesados en realizar análisis basados en un solo núcleo. Este manuscrito detalla un protocolo para aislar núcleos de calidad de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nos hemos centrado en las células estromalas/endoteliales adherentes y en las células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos de células muy diferentes en cuanto a estructura y contenido que exigen modificaciones y resolución de problemas a medida para aumentar la recuperación de núcleos de alta calidad susceptibles de secuenciación de próxima generación u otros experimentos.

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Protocolo

1. Criopreservación de células

1. Congele >1 x 10⁶ células aisladas derivadas de iPSC por ml en 1 ml de 90 % de FBS y 10 % de DMSO. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación a -80 °C para reducir la velocidad de congelación y optimizar la recuperación de células viables (Tabla de materiales). Anticipe una pérdida celular considerable, que puede variar según las condiciones de cultivo y la identidad celular.
2. Pase de -80 °C al almacenamiento de nitrógeno líquido en 24 h.

2. Descongelación de células

1. Recupere el criovial del almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 °C durante 2 minutos. Retirar del baño de agua mientras aún sean visibles los pequeños cristales de hielo.
2. Transfiera las células del criovial a un tubo vacío de 15 mL y agregue lentamente 10 mL de medio precalentado (RPMI 1640 + 10% FBS) mientras mezcla con cuidado. Centrifugar a 400 x g durante 3 min a 25 °C.
3. Aspirar el sobrenadante y reconstituir en 1 mL de DPBS suplementado con 2% de FBS y 1 mM de CaCl₂ (Tabla de Materiales). Mezcle cuidadosamente pipeteando 3x con una micropipeta de 1000 μL. Transfiera a un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo.

3. Eliminación de células muertas

1. Añadir 50 μL de cóctel de eliminación de células muertas (Tabla de Materiales) a 1 mL de suspensión celular. Añadir 50 μL de cóctel de selección de biotina a la mezcla de células. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Estos pasos etiquetan las células muertas de Anexina V⁺ contenidas dentro de la suspensión celular con biotina.
2. Vigorosamente vórtice durante 30 s, las perlas de dextrano diseñadas para el agotamiento de tipos celulares no deseados marcados con biotina (Tabla de Materiales). Agregue 100 μL de perlas de dextrano a la suspensión celular y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una micropipeta de 1000 μL (Tabla de materiales).
3. Añada 1,3 mL de DPBS que contenga un 2% de FBS y 1 mM de CaCl₂ a la suspensión celular y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una micropipeta de 1000 μL. Coloque el tubo en el imán (Tabla de Materiales) e incube a temperatura ambiente durante 3 min.
4. Invierta el imán y el tubo para verter la suspensión de células vivas enriquecida en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 400 x g durante 3 min a 4°C. Retirar la mayor parte del sobrenadante y volver a suspender en 1 mL de DPBS + 0,04% BSA. Mezclar suavemente pipeteando 3 veces con una micropipeta de 1000 μL.

4. Aislamiento de núcleos

1. Centrifugar la suspensión de células vivas a 460 x g durante 5 minutos a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante, asegurándose de que no se interrumpa el pellet de la célula.
2. Añadir 100 μL de tampón de lisis 0,5x recién preparado y enfriado con hielo (Tabla 1) y mezclar suavemente pipeteando 10x con una micropipeta de 100 μL. Incubar 3 min en hielo.
3. Añadir 500 μL de tampón de lavado refrigerado (Tabla 2) al tubo sin mezclar. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.

5. Lavado y valoración de núcleos

1. Aspire el sobrenadante y añada 500 μL de tampón de lavado frío para disolver el pellet intacto restante sin mezclar. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Retire todo el sobrenadante sin alterar la pellets de núcleo.
2. Volver a suspender en 120 μL de tampón de núcleos diluidos refrigerados (Tabla 3). Filtre la suspensión celular con un filtro celular de 40 μm (Tabla de materiales).
3. Teñir con azul de tripano al 0,4% y evaluar visualmente la calidad de los núcleos aislados con un microscopio de 10x (Tabla de materiales).

6. Procesamiento de núcleos aislados

1. Mantenga los núcleos en hielo. Proceda al procesamiento posterior de inmediato, ya que la aglomeración nuclear puede ocurrir con el tiempo y requerir pasos de filtración adicionales.

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Resultados

Empleamos el protocolo mencionado anteriormente para extraer núcleos de células estromalas/endoteliales adherentes derivadas de iPSC criopreservadas y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes (flotantes). En la Figura 1 se puede encontrar una representación esquemática detallada del procedimiento de aislamiento nuclear.

Para el examen morfológico, los núcleos aislados se tiñeron con azul de tripano y se visualizaron bajo un microscopio. El exame...

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Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
El aislamiento de núcleos de alta calidad es esencial para la implementación exitosa de las modalidades actuales de secuenciación de próxima generación basadas en un solo núcleo, que están evolucionando rápidamente. En reconocimiento de las barreras existentes para los laboratorios interesados en estos enfoques, particularmente para los especímenes criopreservados, nuestra intención era diseñar una técnica de aislamiento nuclear adaptada para células p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3