Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro

Resumen

Describimos un protocolo para extraer núcleos de alta calidad de tipos de células madre pluripotentes inducidas, estromales/endoteliales y de células sanguíneas criopreservadas para respaldar los análisis de secuenciación de próxima generación de un solo núcleo. La producción de núcleos intactos de alta calidad es imprescindible para los experimentos multiómicos, pero puede ser una barrera de entrada en el campo para algunos laboratorios.

Resumen

Los modelos basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son excelentes plataformas para comprender el desarrollo sanguíneo, y las células sanguíneas derivadas de iPSC tienen utilidad traslacional como reactivos de pruebas clínicas y terapias celulares transfundibles. El advenimiento y la expansión del análisis multiómico, que incluye, entre otros, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq) y el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATACseq), ofrece el potencial de revolucionar nuestra comprensión del desarrollo celular. Esto incluye la biología del desarrollo utilizando modelos hematopoyéticos in vitro . Sin embargo, puede ser técnicamente difícil aislar núcleos intactos de células cultivadas o primarias. Los diferentes tipos de células a menudo requieren preparaciones nucleares personalizadas en función de la rigidez y el contenido celular. Estas dificultades técnicas pueden limitar la calidad de los datos y actuar como una barrera para los investigadores interesados en realizar estudios multiómicos. La criopreservación de muestras suele ser necesaria debido a las limitaciones de la recolección y/o el procesamiento de células, y las muestras congeladas pueden presentar desafíos técnicos adicionales para el aislamiento nuclear intacto. En este manuscrito, proporcionamos un método detallado para aislar núcleos de alta calidad de células derivadas de iPSC en diferentes etapas del desarrollo hematopoyético in vitro para su uso en flujos de trabajo multiómicos de un solo núcleo. Hemos centrado el desarrollo del método en el aislamiento de núcleos de células estromal/endoteliales adherentes derivadas de iPSC y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos celulares muy diferentes en cuanto a identidad estructural y celular. Los pasos de solución de problemas descritos limitaron la aglomeración y los desechos nucleares, lo que permitió la recuperación de núcleos en cantidad y calidad suficientes para los análisis posteriores. Métodos similares pueden adaptarse para aislar núcleos de otros tipos de células criopreservadas.

Introducción

La hematopoyesis es un sistema de desarrollo relativamente bien caracterizado, pero la incapacidad de recapitular la formación de células sanguíneas in vitro demuestra una comprensión incompleta de los factores relacionados. Los modelos de hematopoyesis basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden ayudar a dilucidar los factores clave del desarrollo y la biología relacionada. El sistema iPSC también ofrece un excelente modelo para estudiar los trastornos sanguíneos, y se han desarrollado células sanguíneas basadas en iPSC para producir reactivos relevantes desde el punto de vista traslacional y terapéutico ....

Protocolo

1. Criopreservación de células

1. Congele >1 x 10⁶ células aisladas derivadas de iPSC por ml en 1 ml de 90 % de FBS y 10 % de DMSO. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación a -80 °C para reducir la velocidad de congelación y optimizar la recuperación de células viables (Tabla de materiales). Anticipe una pérdida celular considerable, que puede variar según las condiciones de cultivo y la identidad celular.
2. Pase de -80 °C al almacenamiento de nitrógeno líquido en 24 h.

2. Descongelación de células

1. Recupere el criovial del almacenamien....

Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
El aislamiento de núcleos de alta calidad es esencial para la implementación exitosa de las modalidades actuales de secuenciación de próxima generación basadas en un solo núcleo, que están evolucionando rápidamente. En reconocimiento de las barreras existentes para los laboratorios interesados en estos enfoques, particularmente para los especímenes criopreservados, nuestra intención era diseñar una técnica de aislamiento nuclear adaptada para células p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3