原发性痛经伴冷凝血瘀的大鼠模型中草药分区肚脐灸

摘要

本文详细介绍了冷凝血瘀大鼠原发性痛经治疗过程中应采取的作规程和注意事项，可显著改善痛经大鼠的扭动反应，缓解疼痛。

摘要

原发性痛经 （PDM） 是指在下腹部出现痉挛性绞痛，没有任何明显的盆腔病变，常伴有其他全身症状，这显着降低了 PDM 女性的生活质量，45%-95% 的经期女性受其影响。尽管 PDM 的发病率很高，但它往往没有得到很好的治疗，并且被相关研究人员和女性本身所忽视。中药分区艾灸 （HPM） 是中医 （TCM） 中的一种特色外用疗法，在我国被广泛用于治疗疾病;它通过在患者的穴位上涂抹中草药配方，然后在草药配方上点燃艾条进行艾灸疗法来治疗疾病。本研究中使用的草药的主要功效是经络激活和温暖，促进气循环以缓解疼痛。艾灸的热刺激可以加速草药注入人体。因此，结合穴位、草药和热刺激的 HPM 适用于治疗妇科疾病，尤其是 PDM 等功能性疾病。本文详细介绍了雌性实验大鼠申阙穴 （CV8） 穴 HPM 的程序和注意事项，为更好地促进 HPM 在 PDM 中肚脐的应用和发展提供了实验依据。

引言

原发性痛经 （PDM），也称为功能性痛经，是影响青春期女孩和经期年轻女性的最普遍的妇科疾病之一¹。它的特点是副作用，如痛苦和子宫压迫（痉挛），以及月经前后腹部的炎症问题，没有任何盆腔病变的证据²。月经开始后 8-72 小时开始的下腹部绞痛，在月经量增加的最初几天达到高峰 ^3,4，有时扩散到背部和大腿是多囊 PDM 的典型症状。由于对这种情况的定义不同，并且缺乏评估月经疼痛强度的标准化方法，女性痛经的估计患病率为 45%-95%^3,4,5。大约 10%-25% 的育龄妇女被认为患有非常严重的 PDM⁶。PDM 患病率在 20 至 24 岁年龄组中最高，此后逐渐下降²。PDM 的特征是周期性下腹痛，经常伴有其他全身症状，如腰痛、恶心、呕吐、头痛、厌食、腹泻⁷，甚至抑郁和焦虑等精神症状 ^8,9。在月经期间，患有痛经的女性的整体生活质量会下降 ^4,8,10。

此外，研究发现，反复的月经疼痛可能会影响中枢神经系统的功能，导致疼痛或无痛阶段对疼痛的感知发生变化¹¹。由于 PDM 的病因基于前列腺素 （PG），因此 PDM 最常见的药物治疗是非甾体抗炎药 （NSAIDs） ^12,13，其次是口服避孕药¹⁴。除了药物的副作用外，10%-20% 的人对非甾体抗炎药和避孕药没有反应³。目前的大多数研究都关注痛经对大脑解剖学和生理学的影响，很少关注治疗方法。因此，迫切需要找到一种能够在临床实践中广泛应用、具有既定疗效并易于被患者接受的治疗策略。

中药分区艾灸 （HPM） 是中医 （TCM） 中的一种特色外用疗法，在中国被广泛用于治疗疾病。其优点包括成本最低、无副作用、长期疗效好、作简便、易于被患者接受。已经发现 HPM 对肚脐对 PDM 的影响显着¹⁵，这可能与调节子宫的冷热虚缺和过多以及肥大细胞和相关受体密切相关¹⁶。研究团队证明 HPM 可以立即缓解经痛¹⁷.

张仲静最初在《金房女杂病治法》中记载了痛经的概念，写道腰带下月经量不利，腹部满腹痛¹⁸.根据其主要症状，痛经可归结为中医中经痛和经腹痛的范畴。痛经的证候可分为五种:气血虚;冷凝血瘀;湿热积累;气滞血瘀;和肝肾虚^{症 16}.根据相关研究，冷凝血瘀证是 PDM 最常见的证候^19,20。TCM 认为 PDM 和感冒病原体密切相关²¹.在月经期间或前后，血海中血液流动过多，由于其能量性质，导致气血迅速耗尽。因此，由于缺乏足够的健康能量以及子宫和冲经和任经络中气血的快速波动，女性容易受到致病原因的影响²².体质发达的女性应采取预防措施，避免食用生食或冷食，并防止在月经期间感冒。否则可能会导致寒冷的病原体侵入子宫，导致子宫和冲经和任经的血液凝结和停滞。因此，由于血流停滞，个人会感到疼痛。来自外部的寒冷病原体的侵入和体内阴寒的存在都会导致经络阻塞和凝血。

痛经的位置在冲经和任经络中，发病与气血变化有关。在中医理论中，艾灸的作用是刺激阳气、暖经络、散寒、增加血流以缓解疼痛。根据灵书^二十三章的金福，如果脉血凝块在中间，又有凝血和冷血，那么适于艾灸;这是一种典型的外部痛经治疗。在之前发表的著作中，²⁴ 片艾 蒿叶被 描述为苦辣，能恢复几乎耗尽的原本阳气，连通十二经络，贯穿三阴经络，调气气血，祛寒祛湿，暖子宫，艾灸，借助相应的穴位，能将致病因素从外排出， 对内调节气血，从而起到调节经络、活血、止痛的作用。肚脐，也被称为神阙 （CV8），属于任经络，连接杜、冲和傣子午。根据中医理论，神阙被认为与五藏六福²⁵ 有关。它被视为先天的基础和阴阳平衡的枢纽。从解剖学上讲，PDM 靠近骨盆，并与子宫紧密相连。PDM 疾病特别影响子宫，其发病机制涉及气血失衡以及内脏失衡。通过刺激神阙穴，可以直接影响子宫的气血状况，有效治疗痛经。基于上述理论，我们选择刺激位于腹部区域的申阙穴进行 HPM 治疗，目的是改善痛经症状和缓解疼痛。

为了尽可能模拟中医对 PDM 的冷凝血瘀作用干预，我们在雌性大鼠的肚脐上复制了 HPM 技术。研究发现，HPM 对肚脐有明显的镇痛作用，可以减轻痛经大鼠的扭动反应。为了探讨 HPM 在肚脐上改善和促进 PDM 的机制，我们研究了一种固定大鼠并在腹部申阙穴进行 HPM 的技术。

研究方案

该实验方案得到了浙江中医药大学实验动物管理和伦理审查委员会的批准。所有对动物的实验作均符合实验动物福利伦理和动物实验安全规定。该研究使用了来自浙江中医药大学实验动物中心的 8-10 周龄成年雌性 Wistar 大鼠。实验前，大鼠在受控环境 （温度:23-25 °C，湿度:40%-60%） 下饲喂适应性饮食 1 周。大鼠保持 12 小时的明暗周期，从 8:00 到 20:00 开灯，并且可以不受限制地获取食物和水。以下方案描述了冷凝血瘀模型建立和 HPM 对肚脐治疗程序的 PDM。该过程的表示如图 1 所示。

1. 冷凝血瘀 PDM 的建立

1. 通过阴道灌洗筛选大鼠的发情周期。
   1. 将装有 60 μL 0.9% 生理盐水的移液枪插入大鼠的阴道口，上下移液 3-4 次，然后吸出液体并将其滴到载玻片上。
      注意:用可以清洗或丢弃的毛巾包裹老鼠是合适的。
   2. 加入 60 μL 95% 乙醇 8 分钟，固定干燥的内容物，然后冲洗并干燥内容物。加入 0.1% 亚甲蓝染色溶液，避光孵育 10 分钟。然后，冲洗并擦干内容物。
   3. 在显微镜下观察并获取图像。
      注意:如果观察到大量白细胞和少量核上皮细胞，则确认发情期（图 1B）。将这些大鼠随机分为对照组、模型组和艾灸组 （n = 6）。
2. 冷凝血瘀PDM动物模型的建立
   1. 在大腿皮下注射苯甲酸雌二醇10天（^第1天和第10^天每只大鼠0.5 mg，第2^天至第9天0.2 mg）以诱导子宫收缩。
   2. 在建模²⁶ 的^第 1 天至^第 5 天，将雌性大鼠置于 -20°C 的冰箱中 4 小时。在 4 小时的孵育期内，中途打开冰箱门以交换空气 30 分钟，然后关闭。
   3. 最后一次给药后 24 小时通过腹膜内注射注射催产素（每只大鼠 2 U）以诱导痛经。
      注:本研究基于先前发表的专注于冷凝和血瘀痛经大鼠模型制备^{的工作 27}。对照组注射相同体积的生理盐水，冷冻程序与模型组相同。

2. HPM 肚脐疗法对 PDM 模型雌性冷凝血瘀大鼠的治疗

注意:准备 HPM 肚脐治疗的四种最重要的材料（见 材料表）。

1. 准备艾条锥。用手将艾条棉线揉成纺锤形（直径 0.8 厘米，高度 0.8 厘米）（图 2A）。
2. 制作一个中间有孔（直径 1 厘米，深度 0.8 厘米）的面团碗（图 2B）。
3. 称取 0.3 g TCM 粉末（图 2C）。
   注:根据杜冬青²⁸ 年，中药粉成分包括烟虎梭、胡椒、乳香、白韶（白芍）、没药、冰片和五灵芝（穴翅目）。
4. 准备鼠袋来固定老鼠。这将在手术过程中保持大鼠稳定。
   1. 剪下布料（长 x 宽:20 厘米 x 20 厘米）并沿对角线缝合。在袋子的顶部切出一个小开口用于呼吸，并在袋子的一侧切出一个孔（直径约 5 厘米）用于艾灸。
   2. 在袋子的顶端和底端分别缝制一对长约 10 厘米、宽约 1 厘米的布绳，用于系绳（图 2D）。
      注意:实验者可以根据被测动物的大小制作合适大小的大鼠袋。
5. 找到 Shenque （CV8） 穴位的确切位置。
   1. 参考文献^29,30，将 Shenque （CV8） 定位在大鼠腹部的中线上，在连接剑突和耻骨上边缘的线上的上 2/3 和下 1/3 的交点处（图 1D）。
6. 去除申阙穴周围的毛发。
7. 将大鼠放入鼠袋中。保持大鼠的腹部向上，露出下肢和尾巴。用胶带将大鼠身体的上下部和尾巴固定在手术台上。
   注意:拴住大鼠时，作者必须轻柔，不要太用力，确保不会引起大鼠恐慌，影响实验结果。确保固定物松动，不要对心脏施加压力，这可能会导致大鼠死亡。
8. 使用 75% 乙醇对 Shenque 及其周围皮肤进行消毒。
9. 将碗放在腹部，将孔对准神阙穴，将中医粉涂抹在神阙穴上。
10. 将艾筒涂在 TCM 粉末上。
11. 点燃艾灸锥，并在前一个艾灸锥烧完后放置一个新的艾灸锥。处理大鼠 30 分钟（图 1E）。
    注意:治疗期间不要使用麻醉剂。保持安静。密切观察大鼠，防止艾灸时温度过高造成烫伤。

3. 进行行为测试

1. 每次试验前用 75% 乙醇擦拭实验盒。
   注意:开阔的场地是一个 40 厘米 x 40 厘米 x 40 厘米的立方体，没有木箱盖。
2. 腹膜内注射催产素 （2 U） 或 0.9% 盐水后，将大鼠置于笼中。
3. 用摄像机记录 30 分钟的扭动行为。
4. 计算扭动延迟 （WL） 和扭动分数 （WS）。
   1. 根据 Schmauss³¹ 的方法，将扭曲行为分为从 0 到 3 的 4 个级别。根据 Schmauss 的方法对动物进行评分。
      注意:0 级:正常姿势（手和爪子平放在笼子底部或正常的探索行为）;1 级:身体向左或向右倾斜;2 级:后腿伸直，后爪后部弯曲，骨盆频繁旋转;3 级:腹部肌肉收缩，后腿向后伸展。大鼠出现扭动反应 （腹部收缩、凹陷、躯干和后肢伸展、单肢旋转、子宫收缩），表明冷凝血瘀型 PDM 制备成功。扭动的潜伏期是从注射催产素到发生扭动反应的时间。如果潜伏期超过 30 分钟，则计算为 30 分钟。扭曲分数 = （0 [次] × 0） + （1 [次] × 1） + （2 [次] × 2） + （3 [次] × 3）。

4. 行为测试后取样

1. 用手握住大鼠，腹膜内注射 3% 戊巴比妥钠 （1 mL/kg） 进行深度麻醉。
2. 称量大鼠以获得体重。
3. 从腹部中部切开皮肤和肌肉，露出心脏。
4. 用灌注针从心尖位置插入心脏，用止血钳固定灌注针，在右耳廓上做一个小切口。
5. 通过左心室和升主动脉灌注 0.9% 盐水，直到大鼠的肝脏和眼睛变浅和颜色变白。
6. 用剪刀剪出子宫并称重。
7. 通过计算子宫重量与体重的比率来获得子宫指数。

结果

本研究采用苯甲酸雌二醇联合催产素诱导冷凝血瘀型 PDM 模型，观察 HPM 肚脐治疗的效果。首先，通过观察大鼠的扭动行为，确定冷凝血瘀的 PDM 大鼠建模是否成功，并通过 WS、WLs 和子宫指数评价大鼠在子宫上的疼痛行为、建模和治疗。从建模的^第 6 天到^第 10 天，在 CV8 （Shenque） 进行 HPM 治疗，每天一次，每次 30 分钟。造模^第 11 天，在麻醉下对?...

讨论

目前，冷凝血瘀型PDM有多种建模方法，但主要方法是苯甲酸雌二醇联合催产素进行痛经建模，在此基础上会有所不同。本研究采用苯甲酸雌二醇和催产素联合全身冷冻法进行建模。全身冷冻法的温度为 -20 °C。 在前面的前期实验中，发现当温度为 −25 °C 时，大鼠会出现严重的冻伤甚至截尾，因此将温度调整到 −20 °C，这样可以保证冷凝的目的不会对大鼠造成太大的物理...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% physiological saline	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	SLYSZ1A	For injecting the control group
1 mL disposable sterile syringe	Changzhou Yuekang Medical Equipment Co., Ltd.	3000-0515-14	For drug injection
3 mL (extended) Pasteur pipette	Beijing Lanjieke Technology Co., Ltd.	YCKJ-HC-007245	For mounting
75% disinfection alcohol	Hangzhou OUTOP Biotechnology Co., Ltd.	N/A	For sterilizing the treatment site
Adhesive-coated glass slide	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	188105W	For HE staining
Biochemical incubator	Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Medical Equipment Factory	N/A	For tissue dewaxing in HE staining
Cloth material	In-house preparation	N/A	Pouch to hold rat
Digital manager slice scanning system	Hamamatsu	C13210-01	For HE slice scanning
Disposable latex gloves	Guangzhou Lige Technology Co., Ltd.	LG10-102-1I	For use during operation
Estradiol benzoate	Hefei Xinkexin Animal Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model
Excelsior AS Fully automatic dehydrator	Thermo Scientific	Excelsior AS	For HE staining tissue dehydration
Female Wistar rats	Laboratory Animal Center of Zhejiang Chinese Medicine University	N/A	220–250 g
Flour	In-house preparation	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Forcep	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Formaldehyde	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd.	441244-1KG	For tissue fixation
Gemini AS slide stainer	Thermo Scientific	Gemini AS	Staining machine
Hemostat	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
HistoCore	Leica ( Arcadia H )	14039357258	For HE staining tissue embedding
Medical cotton ball sterile	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For sterilize the tratment site
Methylene blue staining solution (0.1%)	Beijing Honghu United Chemical Products Co., Ltd.	G1300	For screening estrous cycle
Microdissection Shears	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	XWJ12A	For specimen collection
Microscope cover glass (24 mm x 50 mm)	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	10212450C	For HE staining
Microtome	Leica Microsystems	RM2255	For tissue sectioning
Midea freezer	Hefei Midea Refrigerator Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model with cold coagulation and blood stasis
Molar forceps	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	YGJD-11	For specimen collection
Mounting medium	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	CS9603-100mL	For tissue mounting
Moxa stick	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Pentobarbital sodium	Hangzhou Dawen Biological Co., Ltd.	N/A	For specimen collection
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	P1010-2L	For specimen collection
Scissor	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Sectioning blade	Shanghai Saihan Technology Co., Ltd.	LEICA-819-box	For HE staining paraffin section preparation
Shaver	Shenzhen Cordes Electrical Appliance Co., Ltd.	N/A	For shaving a rat's hair
Sodium Chloride	Chemical Reagent Co., Ltd.	A501218-0001	For specimen collection
Sucrose	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	S11055-500g	For gradient dehydration
Thermal insulation container	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsbwx8l	For paraffin section dewaxing
Tissue embedding cassettes, rectangular in shape, with a breakable lid.	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	31050102W	For HE staining tissue embedding
Wide adhesive tape	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	N/A	For stabilizing rat during the treatment procedure