Moxibustion partitionnée par des herbes sur le nombril dans un modèle de rat de dysménorrhée primaire avec coagulation à froid et stase sanguine

Résumé

Ici, nous décrivons en détail les procédures opératoires et les précautions à prendre lors de la moxibustion partitionnée à base d’herbes sur le nombril dans le traitement de la dysménorrhée primaire chez les rats présentant une coagulation froide et une stase sanguine, ce qui peut améliorer considérablement la réaction de torsion des rats dysménorrhée et soulager la douleur.

Résumé

La dysménorrhée primaire (PDM) fait référence à l’apparition de douleurs coliques spasmodiques dans le bas-ventre sans aucune pathologie pelvienne évidente, souvent accompagnée d’autres symptômes systémiques, ce qui réduit considérablement la qualité de vie des femmes atteintes de PDM, 45% à 95% des femmes menstruelles en sont affectées. Malgré l’incidence élevée de la PDM, elle n’est souvent pas bien traitée et est ignorée par les chercheurs concernés et les femmes elles-mêmes. La moxibustion partitionnée aux herbes (HPM) est une thérapie externe caractéristique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), qui est largement utilisée pour traiter les maladies en Chine ; il traite les maladies en appliquant une formule à base de plantes chinoises sur les points d’acupuncture du patient, puis en allumant des bâtonnets de moxa sur la formule à base de plantes pour la thérapie de moxibustion. L’efficacité principale des herbes utilisées dans cette étude est l’activation des méridiens et la chaleur, qui encouragent la circulation du qi pour soulager la douleur. La stimulation thermique de la moxibustion pourrait accélérer l’infusion des herbes dans le corps humain. Par conséquent, la HPM, qui combine des stimulations d’acupoint, à base de plantes et de chaleur, est appropriée pour traiter les troubles gynécologiques, en particulier les maladies fonctionnelles telles que la PDM. Cet article fournit une description détaillée des procédures et des précautions pour la HPM au point d’acupuncture Shenque (CV8) chez les rats expérimentaux femelles, ce qui fournit une base expérimentale pour mieux promouvoir l’application et le développement de la HPM sur le nombril dans la PDM.

Introduction

La dysménorrhée primaire (PDM), également appelée dysménorrhée fonctionnelle, est l’une des maladies gynécologiques les plus répandues affectant les adolescentes et les jeunes femmes menstruées¹. Il se caractérise par des effets secondaires tels que l’angoisse et les compressions utérines (spasmes), ainsi que par des problèmes inflammatoires de l’abdomen avant et après les menstruations sans aucun signe de pathologie pelvienne². Les crampes abdominales inférieures qui commencent 8 à 72 heures après le début des menstruations, culminent dans les premiers jours d’augmentation du flux menstruel ^3,4 et se propagent parfois au dos et aux cuisses sont les symptômes caractéristiques de la PDM polykystique. En raison de définitions différentes de la maladie et d’un manque de méthodes normalisées pour évaluer l’intensité des douleurs menstruelles, la prévalence estimée de la dysménorrhée chez les femmes varie de 45 % à 95 %^3,4,5. On estime qu’environ 10 à 25 % des femmes en âge de procréer souffrent d’un PDM⁶ très sévère. La prévalence de la PDM est la plus élevée dans le groupe d’âge de 20 à 24 ans et diminue progressivement par la suite². La PDM se caractérise par des douleurs abdominales basses périodiques, qui sont souvent accompagnées d’autres symptômes systémiques tels que des douleurs lombaires, des nausées, des vomissements, des maux de tête, de l’anorexie, de la diarrhée⁷ et même des symptômes mentaux comme la dépression et l’anxiété ^8,9. Pendant les menstruations, les femmes atteintes de dysménorrhée connaissent une baisse de leur qualité de vie globale ^4,8,10.

De plus, des études ont montré que les douleurs menstruelles répétées peuvent affecter le fonctionnement du système nerveux central, entraînant une altération de la perception de la douleur aux stades douloureux ou non douloureux¹¹. En raison de l’étiologie de la PDM basée sur les prostaglandines (PG), le traitement médicamenteux le plus courant de la PDM est les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)^12,13, suivis des contraceptifs oraux¹⁴. En plus des effets secondaires des médicaments, 10 à 20 % des personnes ne répondent pas aux AINS et aux contraceptifs³. La majorité des recherches actuelles portent sur les effets de la dysménorrhée sur l’anatomie et la physiologie du cerveau, avec peu d’attention accordée aux approches thérapeutiques. Par conséquent, il est urgent de trouver une stratégie de traitement qui puisse être largement appliquée dans la pratique clinique, avec une efficacité établie et facilement acceptée par les patients.

La moxibustion partitionnée aux herbes (HPM) est une thérapie externe caractéristique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), qui est largement utilisée pour traiter les maladies en Chine. Ses avantages comprennent un coût minimal, l’absence d’effets secondaires, de bons effets à long terme, une utilisation facile et une acceptation facile par les patients. Il a été constaté que l’effet de la HPM sur le nombril sur la PDM est significatif¹⁵, ce qui peut être étroitement lié à la régulation du manque de froid et de chaleur et de l’excès de l’utérus ainsi que des mastocytes et des récepteurs associés¹⁶. L’équipe de recherche a prouvé que la HPM peut soulager immédiatement les douleurs menstruelles¹⁷.

Zhang Zhong-jing a d’abord enregistré le concept de dysménorrhée dans les maladies diverses des femmes et le traitement de la Chambre dorée, écrivant que le flux menstruel est défavorable sous la ceinture et que l’abdomen est plein^{de douleur.} Selon ses principaux symptômes, la dysménorrhée peut être attribuée à la catégorie des douleurs menstruelles et des douleurs abdominales menstruelles dans la médecine traditionnelle chinoise. Les syndromes de dysménorrhée peuvent être divisés en cinq : qi et carence sanguine ; coagulation froide et stase sanguine ; accumulation de chaleur humide ; stagnation du qi et stase sanguine ; et insuffisance hépatique et rénale¹⁶. Selon les études pertinentes, le syndrome de coagulation froide et de stase sanguine est le syndrome le plus courant de PDM^19,20. La MTC soutient que la PDM et les agents pathogènes du froid sont intimement liés²¹. Pendant ou autour de la menstruation, il y a un flux sanguin excessif chez Xuehai, entraînant une diminution rapide du sang qi en raison de sa nature énergétique. Par conséquent, les femmes sont vulnérables aux causes pathogènes en raison d’un manque d’énergie saine suffisante et des fluctuations rapides du qi et du sang dans l’utérus et les méridiens Chong et Ren²². Les femmes qui ont un physique bien développé doivent prendre des précautions pour éviter de consommer des aliments crus ou froids et pour éviter d’attraper un rhume pendant les menstruations. Le non-respect de cette consigne peut entraîner l’intrusion d’agents pathogènes froids dans l’utérus, entraînant la coagulation et la stagnation du sang dans l’utérus et les méridiens de Chong et Ren. Par conséquent, les individus ressentent de la douleur en raison de la stagnation du flux sanguin. L’intrusion d’agents pathogènes du froid de l’extérieur et la présence de froid yin dans le corps peuvent provoquer un blocage et une coagulation des méridiens.

L’emplacement de la dysménorrhée se trouve dans les méridiens de Chong et Ren, et son apparition est liée à des changements dans le qi et le sang. Dans la théorie de la MTC, la moxibustion agit en stimulant le Qi Yang, en réchauffant les méridiens, en dispersant le froid et en augmentant le flux sanguin pour soulager la douleur. Selon Jinfu de Lingshu²³, si le pouls et le caillot sanguin sont au milieu, et qu’il y a du sang figé et du sang froid, alors il est approprié pour la moxibustion ; Il s’agit d’un traitement typique de la dysménorrhée externe. Dans un travail précédemment publié,²⁴ feuilles d’artemisia argyi sont décrites comme amères et piquantes, capables de restaurer le Yang originel presque épuisé, reliant les douze méridiens, traversant les trois méridiens Yin, régulant le Qi et le sang, dissipant le froid et l’humidité, et réchauffant l’utérus, la moxibustion, à l’aide des points d’acupuncture correspondants, peut expulser les facteurs pathogènes de l’extérieur, réguler le qi et le sang en interne, et ainsi jouer un rôle dans la régulation des méridiens, l’activation de la circulation sanguine et l’arrêt de la douleur. Le nombril, également connu sous le nom de Shenque (CV8), appartient au méridien Ren, reliant les méridiens Du, Chong et Dai. Selon la théorie de la MTC, on pense que Shenque est lié aux cinq zang et aux six fu²⁵. Il est considéré comme un fondement congénital et le pivot de l’équilibre yin-yang. Anatomique, le PDM est à proximité du bassin et est étroitement relié à l’utérus. La maladie PDM affecte spécifiquement l’utérus, et sa pathogenèse implique un déséquilibre du qi et du sang ainsi qu’un déséquilibre des viscères. En stimulant le point de Shenque, il est possible d’influencer directement le qi et l’état sanguin de l’utérus et de traiter efficacement les crampes menstruelles. Sur la base de la théorie susmentionnée, nous avons sélectionné la stimulation du point d’acupuncture Shenque situé dans la région abdominale pour la thérapie HPM, dans le but d’améliorer les symptômes de la dysménorrhée et de soulager la douleur.

Pour imiter au plus près l’intervention de la MTC sur la PDM avec la coagulation à froid et la stase sanguine, nous avons répliqué la technique HPM sur le nombril chez des rats femelles. Il a été découvert que la HPM sur le nombril a un effet analgésique clair et peut atténuer la réaction de torsion des rats dysménorrhée. Afin d’étudier le mécanisme de la HPM sur le nombril pour améliorer la PDM et la promouvoir, nous avons examiné une technique de fixation des rats et de réalisation de la HPM au niveau de l’acupoint de Shenque dans le ventre.

Protocole

Ce protocole expérimental a été approuvé par le Comité de gestion et d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Zhejiang. Toutes les opérations expérimentales sur des animaux sont conformes aux réglementations en matière d’éthique du bien-être des animaux de laboratoire et de sécurité des expériences sur les animaux. L’étude a utilisé des rats Wistar femelles adultes âgés de 8 à 10 semaines du Centre des animaux de laboratoire de l’Université de médecine chinoise du Zhejiang. Avant l’expérience, des rats ont été nourris avec un régime adaptatif pendant 1 semaine dans un environnement contrôlé (température : 23-25 °C, humidité : 40 %-60 %). Les rats ont été maintenus dans un cycle lumière-obscurité de 12 heures, avec des lumières allumées de 8h00 à 20h00, et avaient un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Le protocole suivant décrit la PDM avec l’établissement d’un modèle de coagulation froide et de stase sanguine et la HPM sur la procédure de thérapie du nombril. La figure 1 illustre la procédure dans un ton de procédure.

1. Mise en place de la PDM avec coagulation à froid et stase sanguine

1. Examinez les cycles œstraux des rats par lavage vaginal.
   1. Insérez le pistolet pipette avec 60 μL de solution saline à 0,9 % dans l’orifice vaginal du rat, pipetez de haut en bas 3 à 4 fois, puis aspirez le liquide et déposez-le sur une lame de verre.
      REMARQUE : Il serait approprié d’envelopper le rat dans une serviette qui pourrait être lavée ou éliminée.
   2. Fixez le contenu séché en ajoutant 60 μL d’éthanol à 95 % pendant 8 min, puis rincez et séchez le contenu. Ajouter une solution de coloration au bleu de méthylène à 0,1 % et incuber à l’abri de la lumière pendant 10 min. Ensuite, rincez et séchez le contenu.
   3. Observer et obtenir des images au microscope.
      REMARQUE : Si l’on observe un grand nombre de globules blancs et peu de cellules épithéliales nucléaires, le stade de diestrus est confirmé (Figure 1B). Ces rats ont été divisés au hasard en groupe témoin, groupe modèle et groupe de moxibustion (n = 6).
2. Etablissement de modèles animaux PDM avec coagulation froide et stase sanguine
   1. Injecter du benzoate d’œstradiol par voie sous-cutanée dans la cuisse pendant 10 jours (0,5 mg par rat les^1er et 10e^{jours et} 0,2 mg du 2e^au 9e^jour) pour induire la contraction de l’utérus.
   2. Placez les rats femelles dans un réfrigérateur à -20°C pendant 4 h du 1er^{au 5ème} jour de modélisme²⁶. Pendant la période d’incubation de 4 h, ouvrez à mi-chemin la porte du réfrigérateur pour renouveler l’air pendant 30 min, puis fermez-la.
   3. Injecter de l’ocytocine (2 U par rat) par injection intrapéritonéale 24 h après la dernière administration pour induire la dysménorrhée.
      REMARQUE : Cette étude est basée sur un travail précédemment publié qui s’est concentré sur la coagulation froide et la préparation du modèle de rat de dysménorrhée de stase^{sanguine 27}. Le groupe témoin a reçu une injection du même volume de solution saline, et la procédure de congélation a été la même que celle du groupe modèle.

2. Thérapie du nombril HPM sur des rats femelles modèles PDM avec coagulation à froid et stase sanguine

REMARQUE : Préparez les quatre matériaux les plus importants pour la thérapie du nombril HPM (voir le tableau des matériaux).

1. Préparez des cônes de moxa. Frottez le fil de moxa dans la main en forme de fuseau (diamètre 0,8 cm, hauteur 0,8 cm) (Figure 2A).
2. Réalisez un bol à pâte avec un trou (diamètre 1 cm, profondeur 0,8 cm) au milieu (Figure 2B).
3. Peser 0,3 g de poudre de TCM (Figure 2C).
   REMARQUE : Selon Du Dongqing²⁸, la poudre TCM contientdes souches de Corydalis yanhusuo, Evodia fructus, Olibanum, Baishao (Paeoniae Radix Alba), Myrrhe, Bornéol et Wulingzhi (Trogopterus xanthipes).
4. Préparez la poche à rat pour fixer le rat. Cela maintiendra le rat stable pendant la procédure.
   1. Découper le tissu (longueur x largeur : 20 cm x 20 cm) et coudre en diagonale. Découpez une petite ouverture en haut pour la respiration et un trou (environ 5 cm de diamètre) sur un côté du sachet pour la moxibustion.
   2. Cousez une paire de cordes en tissu d’environ 10 cm de longueur et 1 cm de largeur aux extrémités supérieure et inférieure du sac, respectivement, pour l’attacher (figure 2D).
      REMARQUE : L’expérimentateur peut faire une taille appropriée de la poche de rat en fonction de la taille de l’animal testé.
5. Trouvez l’emplacement exact du point d’acupuncture Shenque (CV8).
   1. En se référant à la littérature^29,30, localiser le Shenque (CV8) sur la ligne médiane de l’abdomen du rat, à l’intersection des 2/3 supérieurs et des 1/3 inférieurs de la ligne reliant l’apophyse xiphoïde et le bord supérieur de l’os pubien (Figure 1D).
6. Retirez les poils autour du point d’acupuncture Shenque.
7. Placez le rat dans la poche à rats. Gardez l’abdomen du rat vers le haut et exposez les membres inférieurs et la queue. Fixez les parties supérieure et inférieure du corps du rat et la queue sur la table d’opération avec du ruban adhésif.
   REMARQUE : Lors de l’attache des rats, l’opérateur doit être doux et pas trop fort, en veillant à ce que cela ne provoque pas de panique chez les rats et n’affecte pas les résultats expérimentaux. Assurez-vous que la fixation est desserrée et n’applique pas de pression sur le cœur, ce qui pourrait entraîner la mort des rats.
8. Désinfectez le Shenque et sa peau environnante à l’aide d’éthanol à 75 %.
9. Placez le bol sur l’abdomen, visez son trou sur le point d’acupuncture Shenque et mettez la poudre TCM sur le point d’acupuncture Shenque.
10. Mettez le cône de moxa sur la poudre TCM.
11. Allumez le cône de moxa et placez-en un nouveau après que le précédent ait brûlé. Traitez le rat pendant 30 minutes (Figure 1E).
    REMARQUE : N’utilisez pas d’anesthésie pendant le traitement. Silence. Observez attentivement le rat pour éviter les brûlures causées par une température excessive pendant la moxibustion.

3. Réalisation du test comportemental

1. Essuyez la boîte expérimentale avec de l’éthanol à 75 % avant chaque essai.
   REMARQUE : Le champ ouvert est un cube de 40 cm x 40 cm x 40 cm sans couvercle de boîte en bois.
2. Placez le rat dans la cage après une injection intrapéritonéale d’ocytocine (2 U) ou de solution saline à 0,9 %.
3. Enregistrez le comportement de torsion pendant 30 minutes avec une caméra vidéo.
4. Calculez les latences d’torsion (WL) et le score d’torsion (WS).
   1. Selon la méthode de Schmauss³¹, divisez le comportement de torsion en 4 niveaux de 0 à 3. Notez les animaux selon la méthode de Schmauss.
      REMARQUE : Niveau 0 : posture normale (mains et griffes à plat sur le fond de la cage ou comportement exploratoire normal) ; Niveau 1 : corps penché vers la gauche ou la droite ; Niveau 2 : pattes arrière étirées, dos des pattes arrière plié et rotation fréquente du bassin ; Niveau 3 : contraction des muscles abdominaux, pattes arrière tendues vers l’arrière. Les rats ont montré des réponses de torsion (contraction abdominale, concavité, extension du tronc et des membres postérieurs, rotation d’un membre, contraction utérine), indiquant une préparation réussie de la PDM de type PDM à sang congelé. La période d’incubation de l’incubation est le temps écoulé entre l’injection d’ocytocine et l’apparition d’une réaction de torsion. Si la période d’incubation dépasse 30 min, elle est calculée comme 30 min. Score de torsion = (0 [fois] × 0) + (1 [fois] × 1) + (2 [fois] × 2) + (3 [fois] × 3).

4. Prélèvement de l’échantillon après le test comportemental

1. Tenez le rat avec la main et injectez du pentobarbital de sodium à 3 % (1 mL/kg) par voie intrapéritonéale pour une anesthésie profonde.
2. Pesez les rats pour obtenir le poids corporel.
3. Incisez la peau et le muscle du milieu de l’abdomen pour exposer le cœur.
4. Insérez le cœur à partir de la position apex avec une aiguille de perfusion, fixez l’aiguille de perfusion avec une pince hémostatique et faites une petite incision dans le pavillon droit.
5. Perfuser une solution saline à 0,9 % par le ventricule gauche et l’aorte ascendante jusqu’à ce que le foie et les yeux du rat deviennent plus clairs et plus blancs.
6. Utilisez des ciseaux pour découper l’utérus et le peser.
7. Obtenez l’indice utérin en calculant le rapport entre le poids de l’utérus et le poids corporel.

Résultats

Dans cette étude, le benzoate d’estradiol en combinaison avec l’ocytocine a été utilisé pour induire le modèle PDM de la coagulation froide et du type de stase sanguine afin d’observer l’effet de la thérapie du nombril HPM. Tout d’abord, en observant le comportement tordu du rat, déterminez si le rat PDM avec coagulation froide et stase sanguine a été modélisé avec succès, et évaluez le comportement de la douleur, la modélisation et le traitement du rat sur l’ut...

Discussion

À l’heure actuelle, il existe diverses méthodes de modélisation de la PDM avec coagulation froide et type de stase sanguine, mais la méthode principale est le benzoate d’estradiol combiné à l’ocytocine pour la modélisation de la dysménorrhée, qui sera différente sur cette base. Dans cette étude, la méthode de congélation du corps entier combinée au benzoate d’estradiol et à l’ocytocine a été utilisée pour la modélisation. La température de la méthode de con...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% physiological saline	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	SLYSZ1A	For injecting the control group
1 mL disposable sterile syringe	Changzhou Yuekang Medical Equipment Co., Ltd.	3000-0515-14	For drug injection
3 mL (extended) Pasteur pipette	Beijing Lanjieke Technology Co., Ltd.	YCKJ-HC-007245	For mounting
75% disinfection alcohol	Hangzhou OUTOP Biotechnology Co., Ltd.	N/A	For sterilizing the treatment site
Adhesive-coated glass slide	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	188105W	For HE staining
Biochemical incubator	Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Medical Equipment Factory	N/A	For tissue dewaxing in HE staining
Cloth material	In-house preparation	N/A	Pouch to hold rat
Digital manager slice scanning system	Hamamatsu	C13210-01	For HE slice scanning
Disposable latex gloves	Guangzhou Lige Technology Co., Ltd.	LG10-102-1I	For use during operation
Estradiol benzoate	Hefei Xinkexin Animal Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model
Excelsior AS Fully automatic dehydrator	Thermo Scientific	Excelsior AS	For HE staining tissue dehydration
Female Wistar rats	Laboratory Animal Center of Zhejiang Chinese Medicine University	N/A	220–250 g
Flour	In-house preparation	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Forcep	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Formaldehyde	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd.	441244-1KG	For tissue fixation
Gemini AS slide stainer	Thermo Scientific	Gemini AS	Staining machine
Hemostat	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
HistoCore	Leica ( Arcadia H )	14039357258	For HE staining tissue embedding
Medical cotton ball sterile	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For sterilize the tratment site
Methylene blue staining solution (0.1%)	Beijing Honghu United Chemical Products Co., Ltd.	G1300	For screening estrous cycle
Microdissection Shears	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	XWJ12A	For specimen collection
Microscope cover glass (24 mm x 50 mm)	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	10212450C	For HE staining
Microtome	Leica Microsystems	RM2255	For tissue sectioning
Midea freezer	Hefei Midea Refrigerator Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model with cold coagulation and blood stasis
Molar forceps	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	YGJD-11	For specimen collection
Mounting medium	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	CS9603-100mL	For tissue mounting
Moxa stick	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Pentobarbital sodium	Hangzhou Dawen Biological Co., Ltd.	N/A	For specimen collection
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	P1010-2L	For specimen collection
Scissor	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Sectioning blade	Shanghai Saihan Technology Co., Ltd.	LEICA-819-box	For HE staining paraffin section preparation
Shaver	Shenzhen Cordes Electrical Appliance Co., Ltd.	N/A	For shaving a rat's hair
Sodium Chloride	Chemical Reagent Co., Ltd.	A501218-0001	For specimen collection
Sucrose	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	S11055-500g	For gradient dehydration
Thermal insulation container	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsbwx8l	For paraffin section dewaxing
Tissue embedding cassettes, rectangular in shape, with a breakable lid.	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	31050102W	For HE staining tissue embedding
Wide adhesive tape	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	N/A	For stabilizing rat during the treatment procedure