Moxibustione partizionata con erbe sull'ombelico in un modello di ratto di dismenorrea primaria con coagulazione a freddo e stasi sanguigna

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio le procedure operative e le precauzioni da prendere durante la moxibustione partizionata con erbe sull'ombelico nel trattamento della dismenorrea primaria nei ratti con coagulazione a freddo e stasi del sangue, che può migliorare significativamente la reazione di contorsione dei ratti con dismenorrea e alleviare il dolore.

Abstract

La dismenorrea primaria (PDM) si riferisce all'insorgenza di dolore colico spasmodico nell'addome inferiore senza alcuna patologia pelvica evidente, spesso accompagnato da altri sintomi sistemici, che riduce significativamente la qualità della vita delle donne con PDM, il 45%-95% delle donne mestruali ne è affetto. Nonostante l'elevata incidenza di PDM, spesso non è ben trattata ed è ignorata dai ricercatori e dalle donne stesse. La moxibustione partizionata con erbe (HPM) è una terapia esterna caratteristica della medicina tradizionale cinese (MTC), ampiamente utilizzata per trattare le malattie in Cina; tratta le malattie applicando una formula a base di erbe cinesi sui punti di agopuntura del paziente e quindi accendendo bastoncini di moxa sulla formula a base di erbe per la terapia della moxibustione. L'efficacia primaria delle erbe utilizzate in questo studio è l'attivazione dei meridiani e il calore, che incoraggia la circolazione del qi per alleviare il dolore. La stimolazione del calore della moxibustione potrebbe accelerare l'infusione delle erbe nel corpo umano. Di conseguenza, l'HPM, che combina agopuntura, erboristeria e stimolazione termica, è appropriato per il trattamento di disturbi ginecologici, in particolare malattie funzionali come il PDM. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata delle procedure e delle precauzioni per l'HPM al punto di agopuntura di Shenque (CV8) nelle femmine di ratto sperimentale, che fornisce una base sperimentale per promuovere meglio l'applicazione e lo sviluppo dell'HPM sull'ombelico nella PDM.

Introduzione

La dismenorrea primaria (PDM), nota anche come dismenorrea funzionale, è una delle malattie ginecologiche più diffuse che colpisce le ragazze adolescenti e le giovani donne mestruate¹. È caratterizzata da effetti collaterali come angoscia e compressioni uterine (spasmi), insieme a problemi infiammatori nell'addome prima e dopo le mestruazioni senza alcuna evidenza di patologia pelvica². I crampi addominali inferiori che iniziano 8-72 ore dopo l'inizio delle mestruazioni, raggiungono il picco nei primi giorni di aumento del flusso mestruale ^3,4 e talvolta si diffondono alla schiena e alle cosce sono i sintomi caratteristici della PDM policistica. A causa delle diverse definizioni della condizione e della mancanza di modi standardizzati per valutare l'intensità del dolore mestruale, la prevalenza stimata della dismenorrea nelle donne varia dal 45% al 95%^3,4,5. Si ritiene che circa il 10%-25% delle donne in età riproduttiva soffra di PDM⁶ molto grave. La prevalenza della PDM è più alta nella fascia di età compresa tra i 20 e i 24 anni e diminuisce progressivamente successivamente^2. La PDM è caratterizzata da dolore addominale inferiore periodico, che è spesso accompagnato da altri sintomi sistemici come lombalgia, nausea, vomito, mal di testa, anoressia, diarrea⁷ e persino sintomi mentali come depressione e ansia ^8,9. Durante le mestruazioni, le donne con dismenorrea sperimentano un declino della qualità generale della vita ^4,8,10.

Inoltre, gli studi hanno scoperto che il dolore mestruale ripetuto può influenzare la funzione del sistema nervoso centrale, portando a un'alterata percezione del dolore sia nella fase dolorosa che in quella senza dolore¹¹. A causa dell'eziologia della PDM basata sulle prostaglandine (PG), il trattamento farmacologico più comune per la PDM sono i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS)^12,13, seguiti dai contraccettivi orali¹⁴. Oltre agli effetti collaterali dei farmaci, il 10%-20% delle persone non risponde ai FANS e ai contraccettivi³. La maggior parte della ricerca attuale riguarda gli effetti della dismenorrea sull'anatomia e la fisiologia del cervello, con poca attenzione agli approcci terapeutici. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di trovare una strategia di trattamento che possa essere ampiamente applicata nella pratica clinica, con un'efficacia comprovata e prontamente accettata dai pazienti.

La moxibustione partizionata con erbe (HPM) è una terapia esterna caratteristica della medicina tradizionale cinese (MTC), ampiamente utilizzata per trattare le malattie in Cina. I suoi vantaggi includono un costo minimo, nessun effetto collaterale, buoni effetti a lungo termine, facilità d'uso e facile accettazione da parte dei pazienti. È stato riscontrato che l'effetto dell'HPM sull'ombelico sulla PDM è significativo¹⁵, che può essere strettamente correlato alla regolazione della carenza e dell'eccesso di freddo e caldo dell'utero, nonché dei mastociti e dei relativi recettori¹⁶. Il team di ricerca ha dimostrato che l'HPM può alleviare immediatamente il dolore mestruale¹⁷.

Zhang Zhong-jing inizialmente registrò il concetto di dismenorrea nelle Malattie varie delle donne e nel trattamento della Camera d'oro, scrivendo che il flusso mestruale è sfavorevole sotto la cintura e l'addome è pieno di dolore¹⁸. Secondo i suoi sintomi principali, la dismenorrea può essere attribuita alla categoria dei dolori mestruali e dei dolori addominali mestruali nella medicina tradizionale cinese. Le sindromi della dismenorrea possono essere suddivise in cinque: qi e carenza di sangue; coagulazione a freddo e stasi del sangue; accumulo di calore umido; ristagno del qi e stasi del sangue; e carenza epatica e renale¹⁶. Secondo studi pertinenti, la sindrome della coagulazione a freddo e della stasi del sangue è la sindrome più comune di PDM^19,20. La MTC sostiene che la PDM e i patogeni del raffreddore sono intimamente connessi²¹. Durante o intorno alle mestruazioni, c'è un flusso eccessivo di sangue a Xuehai, che porta a un rapido esaurimento del sangue qi a causa della sua natura energetica. Di conseguenza, le donne sono vulnerabili alle cause che causano malattie a causa della mancanza di sufficiente energia sana e delle rapide fluttuazioni del qi e del sangue nell'utero e nei meridiani Chong e Ren²². Le donne che hanno un fisico ben sviluppato dovrebbero prendere precauzioni per evitare di consumare cibi crudi o freddi e per evitare di prendere il raffreddore durante le mestruazioni. In caso contrario, può verificarsi l'intrusione di agenti patogeni freddi nell'utero, con conseguente coagulazione e ristagno di sangue nell'utero e nei meridiani di Chong e Ren. Di conseguenza, gli individui provano dolore a causa del ristagno del flusso sanguigno. Sia l'intrusione di agenti patogeni del freddo dall'esterno che la presenza di freddo yin all'interno del corpo possono causare il blocco e la coagulazione dei meridiani.

La posizione della dismenorrea è nei meridiani Chong e Ren e l'insorgenza è correlata ai cambiamenti nel qi e nel sangue. Nella teoria della MTC, la moxibustione agisce stimolando lo Yang Qi, riscaldando i meridiani, disperdendo il freddo e aumentando il flusso sanguigno per alleviare il dolore. Secondo Jinfu di Lingshu²³, se il polso e il coagulo di sangue sono nel mezzo, e c'è sangue rappreso e sangue freddo, allora è appropriato per la moxibustione; È un tipico trattamento della dismenorrea esterna. In un lavoro precedentemente pubblicato²⁴ foglie di artemisia argyi sono descritte come amare e pungenti, in grado di ripristinare lo Yang originale quasi esaurito, collegando i dodici meridiani, correndo attraverso i tre meridiani Yin, regolando il Qi e il sangue, dissipando il freddo e l'umidità e riscaldando l'utero, la moxibustione, con l'aiuto dei corrispondenti punti di agopuntura, può espellere i fattori patogeni esternamente, Regola il Qi e il sangue internamente, e quindi svolge un ruolo nella regolazione dei meridiani, nell'attivazione della circolazione sanguigna e nell'arresto del dolore. L'ombelico, noto anche come Shenque (CV8), appartiene al meridiano Ren, che collega i meridiani Du, Chong e Dai. Secondo la teoria della MTC, si ritiene che Shenque sia imparentato con i cinque zang e i sei fu²⁵. È considerato un fondamento congenito e il perno dell'equilibrio yin-yang. Anatomico, il PDM si trova in prossimità del bacino ed è strettamente collegato all'utero. La malattia PDM colpisce specificamente l'utero e la sua patogenesi comporta uno squilibrio del qi e del sangue, nonché uno squilibrio dei visceri. Stimolando il punto di Shenque, è possibile influenzare direttamente il qi e la condizione del sangue dell'utero e trattare efficacemente i crampi mestruali. Sulla base della suddetta teoria, abbiamo selezionato la stimolazione dell'agopunto Shenque situato nella regione addominale per la terapia HPM, con l'obiettivo di migliorare i sintomi della dismenorrea e alleviare il dolore.

Per imitare il più possibile l'intervento della MTC sulla PDM con la coagulazione a freddo e la stasi del sangue, abbiamo replicato la tecnica HPM sull'ombelico in ratti femmine. È stato scoperto che l'HPM sull'ombelico ha un chiaro effetto analgesico e può ridurre la reazione di contorsione dei ratti dismenorrea. Al fine di studiare il meccanismo dell'HPM sull'ombelico per migliorare la PDM e promuoverla, abbiamo esaminato una tecnica di fissaggio dei ratti e l'esecuzione dell'HPM nel punto di agopuntura di Shenque nella pancia.

Protocollo

Questo protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato di revisione della gestione e dell'etica degli animali sperimentali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Zhejiang. Tutte le operazioni sperimentali sugli animali sono conformi alle norme etiche sul benessere degli animali e sulla sicurezza degli animali. Lo studio ha utilizzato ratti Wistar femmine adulte di età compresa tra 8 e 10 settimane del Laboratory Animal Center dell'Università di Medicina Cinese di Zhejiang. Prima dell'esperimento, i ratti sono stati alimentati con una dieta adattativa per 1 settimana in un ambiente controllato (temperatura: 23-25 °C, umidità: 40%-60%). I ratti sono stati mantenuti in un ciclo luce-buio di 12 ore, con luci accese dalle 8:00 alle 20:00, e hanno avuto accesso illimitato a cibo e acqua. Il seguente protocollo descrive il PDM con coagulazione a freddo e stasi del sangue e HPM sulla procedura di terapia dell'ombelico. Una rappresentazione della procedura è mostrata nella Figura 1.

1. Instaurazione della PDM con coagulazione a freddo e stasi del sangue

1. Esamina i cicli estrali dei ratti mediante lavaggio vaginale.
   1. Inserire la pistola per pipette con 60 μl di soluzione fisiologica allo 0,9% nell'orifizio vaginale del ratto, pipettare su e giù 3-4 volte, quindi aspirare il liquido e lasciarlo cadere su un vetrino.
      NOTA: Avvolgere il topo in un asciugamano che potrebbe essere lavato o smaltito sarebbe appropriato.
   2. Fissare il contenuto essiccato aggiungendo 60 μL di etanolo al 95% per 8 minuti, quindi risciacquare e asciugare il contenuto. Aggiungere la soluzione colorante blu di metilene allo 0,1% e incubare al riparo dalla luce per 10 minuti. Successivamente, sciacquare e asciugare il contenuto.
   3. Osservare e ottenere immagini al microscopio.
      NOTA: Se si osserva un gran numero di globuli bianchi e poche cellule epiteliali nucleari, lo stadio di diestro è confermato (Figura 1B). Questi ratti sono stati divisi casualmente nel gruppo di controllo, nel gruppo modello e nel gruppo di moxibustione (n = 6).
2. Costituzione di modelli animali PDM con coagulazione a freddo e stasi ematica
   1. Iniettare estradiolo benzoato per via sottocutanea nella coscia per 10 giorni (0,5 mg per ratto il 1^{° e il} 10° giorno e 0,2^mg dal 2^{° al 9° giorno)} per indurre la contrazione dell'utero.
   2. Mettere le femmine di ratto in frigorifero a -20 ° C per 4 ore dal 1^° al 5^° giorno di modellazione²⁶. Durante il periodo di incubazione di 4 ore, aprire la porta del frigorifero a metà per scambiare l'aria per 30 minuti e poi chiuderla.
   3. Iniettare ossitocina (2 U per ratto) mediante iniezione intraperitoneale 24 ore dopo l'ultima somministrazione per indurre la dismenorrea.
      NOTA: Questo studio si basa su un lavoro precedentemente pubblicato che si è concentrato sulla coagulazione a freddo e sulla preparazione di modelli di ratto con dismenorrea da stasi^{ematica 27}. Al gruppo di controllo è stato iniettato lo stesso volume di soluzione fisiologica e la procedura di congelamento è stata la stessa del gruppo modello.

2. Terapia HPM ombelico su ratti femmina modello PDM con coagulazione a freddo e stasi ematica

NOTA: Preparare i quattro materiali più importanti per la terapia dell'ombelico HPM (vedi Tabella dei materiali).

1. Prepara i coni di moxa. Strofinare il filo interdentale di moxa con la mano a forma di fuso (diametro 0,8 cm, altezza 0,8 cm) (Figura 2A).
2. Realizzare una ciotola per l'impasto con un foro (diametro 1 cm, profondità 0,8 cm) al centro (Figura 2B).
3. Pesare 0,3 g di polvere TCM (Figura 2C).
   NOTA: Secondo Du Dongqing²⁸, la polvere MTCcontiene Corydalis yanhusuo, Evodia fructus, Olibanum, Baishao (Paeoniae Radix Alba), Mirra, Borneolo e Wulingzhi (Trogopterus Xanthipes).
4. Prepara la sacca per topi per riparare il topo. Questo manterrà il ratto stabile durante la procedura.
   1. Ritaglia il panno (lunghezza x larghezza: 20 cm x 20 cm) e cuci insieme in diagonale. Ritagliare una piccola apertura nella parte superiore per la respirazione e un foro (di circa 5 cm di diametro) su un lato della sacca per la moxibustione.
   2. Cuci un paio di corde di stoffa di circa 10 cm di lunghezza e 1 cm di larghezza rispettivamente alle estremità superiore e inferiore della borsa per il fissaggio (Figura 2D).
      NOTA: Lo sperimentatore può realizzare una dimensione adeguata della sacca per ratti in base alle dimensioni dell'animale testato.
5. Trova la posizione esatta del punto di agopuntura Shenque (CV8).
   1. Facendo riferimento alla letteratura^29,30, localizzare lo Shenque (CV8) sulla linea mediana dell'addome del ratto, all'intersezione tra i 2/3 superiori e i 1/3 inferiori della linea che collega il processo xifoideo e il bordo superiore dell'osso pubico (Figura 1D).
6. Rimuovi i peli intorno al punto di agopuntura Shenque.
7. Metti il topo nella custodia per topi. Tieni l'addome del ratto sollevato ed esponi gli arti inferiori e la coda. Fissare le parti superiore e inferiore del corpo del ratto e la coda sul tavolo operatorio con del nastro adesivo.
   NOTA: Quando si legano i ratti, l'operatore deve essere delicato e non troppo duro, assicurandosi che ciò non causi panico nei ratti e non influisca sui risultati sperimentali. Assicurarsi che il fissaggio sia allentato e non eserciti pressione sul cuore, il che potrebbe portare alla mortalità dei ratti.
8. Disinfettare lo Shenque e la sua pelle circostante utilizzando etanolo al 75%.
9. Posiziona la ciotola sull'addome, punta il foro sul punto di agopuntura Shenque e metti la polvere MTC sul punto di agopuntura Shenque.
10. Metti il cono di moxa sulla polvere TCM.
11. Accendi il cono di moxa e posizionane uno nuovo dopo che il precedente si è esaurito. Trattare il ratto per 30 minuti (Figura 1E).
    NOTA: Non utilizzare l'anestesia durante il trattamento. Taci. Osservare attentamente il ratto per evitare scottature causate da una temperatura eccessiva durante la moxibustione.

3. Conduzione del test comportamentale

1. Pulire la scatola sperimentale con etanolo al 75% prima di ogni prova.
   NOTA: Il campo aperto è un cubo di 40 cm x 40 cm x 40 cm senza coperchio della scatola di legno.
2. Posizionare il ratto nella gabbia dopo l'iniezione intraperitoneale di ossitocina (2 U) o soluzione fisiologica allo 0,9%.
3. Registra il comportamento di contorsione per 30 minuti con una videocamera.
4. Calcola le latenze di contorsione (WL) e il punteggio di contorsione (WS).
   1. Secondo il metodo di Schmauss³¹, dividere il comportamento di torsione in 4 livelli da 0 a 3. Assegna un punteggio agli animali in base al metodo di Schmauss.
      NOTA: Livello 0: postura normale (mani e artigli appoggiati sul fondo della gabbia o comportamento esplorativo normale); Livello 1: corpo inclinato a sinistra o a destra; Livello 2: zampe posteriori distese, parte posteriore delle zampe piegate e rotazione frequente del bacino; Livello 3: contrazione dei muscoli addominali, zampe posteriori distese all'indietro. I ratti hanno mostrato risposte contorte (contrazione addominale, concavità, estensione del tronco e degli arti posteriori, rotazione di un arto, contrazione uterina), indicando il successo della preparazione del PDM di tipo stasi del sangue congelato a freddo. Il periodo di incubazione della torsione è il tempo che intercorre tra l'iniezione di ossitocina e il verificarsi di una reazione di torsione. Se il periodo di incubazione supera i 30 minuti, viene calcolato come 30 minuti. Punteggio twist = (0 [volte] × 0) + (1 [volte] × 1) + (2 [volte] × 2) + (3 [volte] × 3).

4. Prelievo del campione dopo il test comportamentale

1. Tenere il ratto con la mano e iniettare pentobarbital di sodio al 3% (1 ml/kg) per via intraperitoneale per un'anestesia profonda.
2. Pesare i ratti per ottenere il peso corporeo.
3. Incidere la pelle e il muscolo dal centro dell'addome per esporre il cuore.
4. Inserire il cuore dalla posizione apicale con un ago per perfusione, fissare l'ago per perfusione con una pinza emostatica e praticare un piccolo taglio nel padiglione auricolare destro.
5. Perfondere lo 0,9% di soluzione salina attraverso il ventricolo sinistro e l'aorta ascendente fino a quando il fegato e gli occhi del ratto diventano più chiari e di colore più bianco.
6. Usa le forbici per tagliare l'utero e pesarlo.
7. Ottieni l'indice uterino calcolando il rapporto tra il peso dell'utero e il peso corporeo.

Risultati

In questo studio, l'estradiolo benzoato in combinazione con ossitocina è stato utilizzato per indurre il modello PDM di coagulazione a freddo e tipo di stasi del sangue per osservare l'effetto della terapia con ombelico HPM. In primo luogo, osservando il comportamento contorto del ratto, determinare se il ratto PDM con coagulazione a freddo e stasi del sangue è stato modellato con successo e valutare il comportamento del dolore, la modellazione e il trattamento del ratto sull'utero att...

Discussione

Attualmente, esistono vari metodi di modellazione per la PDM con coagulazione a freddo e tipo di stasi del sangue, ma il metodo principale è l'estradiolo benzoato combinato con ossitocina per la modellazione della dismenorrea, che sarà diverso su questa base. In questo studio, per la modellazione è stato utilizzato il metodo di congelamento di tutto il corpo combinato con estradiolo benzoato e ossitocina. La temperatura del metodo di congelamento di tutto il corpo era di -20 °C. Nel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% physiological saline	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	SLYSZ1A	For injecting the control group
1 mL disposable sterile syringe	Changzhou Yuekang Medical Equipment Co., Ltd.	3000-0515-14	For drug injection
3 mL (extended) Pasteur pipette	Beijing Lanjieke Technology Co., Ltd.	YCKJ-HC-007245	For mounting
75% disinfection alcohol	Hangzhou OUTOP Biotechnology Co., Ltd.	N/A	For sterilizing the treatment site
Adhesive-coated glass slide	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	188105W	For HE staining
Biochemical incubator	Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Medical Equipment Factory	N/A	For tissue dewaxing in HE staining
Cloth material	In-house preparation	N/A	Pouch to hold rat
Digital manager slice scanning system	Hamamatsu	C13210-01	For HE slice scanning
Disposable latex gloves	Guangzhou Lige Technology Co., Ltd.	LG10-102-1I	For use during operation
Estradiol benzoate	Hefei Xinkexin Animal Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model
Excelsior AS Fully automatic dehydrator	Thermo Scientific	Excelsior AS	For HE staining tissue dehydration
Female Wistar rats	Laboratory Animal Center of Zhejiang Chinese Medicine University	N/A	220–250 g
Flour	In-house preparation	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Forcep	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Formaldehyde	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd.	441244-1KG	For tissue fixation
Gemini AS slide stainer	Thermo Scientific	Gemini AS	Staining machine
Hemostat	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
HistoCore	Leica ( Arcadia H )	14039357258	For HE staining tissue embedding
Medical cotton ball sterile	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For sterilize the tratment site
Methylene blue staining solution (0.1%)	Beijing Honghu United Chemical Products Co., Ltd.	G1300	For screening estrous cycle
Microdissection Shears	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	XWJ12A	For specimen collection
Microscope cover glass (24 mm x 50 mm)	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	10212450C	For HE staining
Microtome	Leica Microsystems	RM2255	For tissue sectioning
Midea freezer	Hefei Midea Refrigerator Co., Ltd.	N/A	For establishing dysmenorrhea model with cold coagulation and blood stasis
Molar forceps	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.	YGJD-11	For specimen collection
Mounting medium	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	CS9603-100mL	For tissue mounting
Moxa stick	The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University	N/A	For herbs-partitioned moxibustion treatment
Pentobarbital sodium	Hangzhou Dawen Biological Co., Ltd.	N/A	For specimen collection
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.	P1010-2L	For specimen collection
Scissor	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsnz	For specimen collection
Sectioning blade	Shanghai Saihan Technology Co., Ltd.	LEICA-819-box	For HE staining paraffin section preparation
Shaver	Shenzhen Cordes Electrical Appliance Co., Ltd.	N/A	For shaving a rat's hair
Sodium Chloride	Chemical Reagent Co., Ltd.	A501218-0001	For specimen collection
Sucrose	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	S11055-500g	For gradient dehydration
Thermal insulation container	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	lsbwx8l	For paraffin section dewaxing
Tissue embedding cassettes, rectangular in shape, with a breakable lid.	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	31050102W	For HE staining tissue embedding
Wide adhesive tape	Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	N/A	For stabilizing rat during the treatment procedure