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Resumen

Aquí, describimos en detalle los procedimientos de operación y las precauciones que se deben tomar durante la moxibustión particionada con hierbas en el ombligo en el tratamiento de la dismenorrea primaria en ratas con coagulación fría y estasis sanguínea, que puede mejorar significativamente la reacción de retorcimiento de las ratas con dismenorrea y aliviar el dolor.

Resumen

La dismenorrea primaria (DMP) se refiere a la aparición de dolor cólico espasmódico en la parte inferior del abdomen sin ninguna patología pélvica evidente, a menudo acompañada de otros síntomas sistémicos, lo que reduce significativamente la calidad de vida de las mujeres con MDP, entre el 45% y el 95% de las mujeres menstruales se ven afectadas por ella. A pesar de la alta incidencia de la PDM, a menudo no se trata bien y es ignorada por los investigadores relevantes y las propias mujeres. La moxibustión dividida por hierbas (HPM) es una terapia externa característica en la medicina tradicional china (MTC), que se usa ampliamente para tratar enfermedades en China; trata enfermedades aplicando una fórmula herbal china en los puntos de acupuntura del paciente y luego encendiendo palos de moxa en la fórmula herbal para la terapia de moxibustión. La eficacia principal de las hierbas utilizadas en este estudio es la activación de los meridianos y el calor, lo que estimula la circulación del qi para aliviar el dolor. La estimulación térmica de la moxibustión podría acelerar la infusión de las hierbas en el cuerpo humano. En consecuencia, la HPM, que combina estimulaciones de acupuntura, hierbas y calor, es adecuada para tratar trastornos ginecológicos, en particular enfermedades funcionales como la PDM. Este artículo proporciona una descripción detallada de los procedimientos y precauciones para la HPM en el punto de acupuntura Shenque (CV8) en ratas experimentales hembras, lo que proporciona una base experimental para promover mejor la aplicación y el desarrollo de HPM en el ombligo en PDM.

Introducción

La dismenorrea primaria (DMP), también conocida como dismenorrea funcional, es una de las enfermedades ginecológicas más prevalentes que afecta a las adolescentes y a las mujeres jóvenes que menstrúan1. Se caracteriza por efectos secundarios como angustia y compresiones uterinas (espasmos), junto con problemas inflamatorios en el abdomen antes y después de la menstruación sin ninguna evidencia de patología pélvica2. Los calambres abdominales inferiores que comienzan 8-72 h después del inicio de la menstruación, alcanzan su punto máximo en los primeros días de aumento del flujo menstrual 3,4 y, a veces, se extienden a la espalda y los muslos son los síntomas característicos de la DMD poliquística. Debido a las diferentes definiciones de la afección y a la falta de formas estandarizadas de evaluar la intensidad del dolor menstrual, la prevalencia estimada de la dismenorrea en las mujeres varía entre el 45% y el 95%3,4,5. Se cree que entre el 10% y el 25% de las mujeres en edad reproductiva sufren de MDP6 realmente grave. La prevalencia de PDM es más alta en el grupo de edad de 20 a 24 años y disminuye progresivamente a partir de entonces2. La PDM se caracteriza por dolor periódico en la parte inferior del abdomen, que frecuentemente se acompaña de otros síntomas sistémicos como lumbalgia, náuseas, vómitos, cefaleas, anorexia, diarrea7, e incluso síntomas mentales como depresión y ansiedad 8,9. Durante la menstruación, las mujeres con dismenorrea experimentan una disminución en la calidad de vida general 4,8,10.

Además, los estudios han encontrado que el dolor menstrual repetido puede afectar la función del sistema nervioso central, lo que lleva a una percepción alterada del dolor tanto en etapas dolorosas como indoloras11. Debido a que la etiología de la PDM se basa en las prostaglandinas (PG), el tratamiento farmacológico más frecuente para la PDM son los antiinflamatorios no esteroideos (AINE)12,13, seguidos de los anticonceptivos orales14. Además de los efectos secundarios de los medicamentos, entre el 10% y el 20% de las personas no responden a los AINE y anticonceptivos3. La mayoría de las investigaciones actuales se centran en los efectos de la dismenorrea en la anatomía y la fisiología del cerebro, y se presta poca atención a los enfoques terapéuticos. En consecuencia, existe una necesidad urgente de encontrar una estrategia de tratamiento que pueda ser ampliamente aplicada en la práctica clínica, con una eficacia establecida y fácilmente aceptada por los pacientes.

La moxibustión particionada por hierbas (HPM) es una terapia externa característica en la medicina tradicional china (MTC), que se usa ampliamente para tratar enfermedades en China. Sus beneficios incluyen un costo mínimo, sin efectos secundarios, buenos efectos a largo plazo, fácil operación y fácil aceptación por parte de los pacientes. Se ha encontrado que el efecto de la HPM sobre el ombligo es significativo15, lo que puede estar estrechamente relacionado con la regulación de la deficiencia y el exceso de frío y calor del útero, así como de los mastocitos y los receptores relacionados16. El equipo de investigación ha demostrado que la HPM puede aliviar inmediatamente el dolor menstrual17.

Zhang Zhong-jing inicialmente registró el concepto de dismenorrea en las Mujeres Misceláneas de Enfermedades y Tratamiento de la Cámara Dorada, escribiendo que el flujo menstrual es desfavorable bajo el cinturón y el abdomen está lleno de dolor18. Según sus principales síntomas, la dismenorrea se puede atribuir a la categoría de dolor menstrual y dolor abdominal menstrual en la medicina tradicional china. Los síndromes de la dismenorrea se pueden dividir en cinco: deficiencia de qi y sangre; coagulación fría y estasis sanguínea; acumulación de calor húmedo; estancamiento de qi y estasis de sangre; y deficiencia hepática y renal16. De acuerdo con estudios relevantes, el síndrome de coagulación fría y estasis sanguínea es el síndrome más común de la PDM19,20. La MTC sostiene que la PDM y los patógenos del resfriado están íntimamente conectados21. Durante o alrededor de la menstruación, hay un flujo excesivo de sangre en Xuehai, lo que lleva a un rápido agotamiento de la sangre qi debido a su naturaleza energética. En consecuencia, las mujeres son vulnerables a las causas causantes de enfermedades debido a la falta de suficiente energía saludable y a las rápidas fluctuaciones del qi y la sangre en el útero y los meridianos Chong y Ren22. Las mujeres que tienen un físico bien desarrollado deben tomar precauciones para evitar consumir alimentos crudos o fríos y para evitar resfriarse durante la menstruación. De lo contrario, se puede producir la intrusión de patógenos del resfriado en el útero, lo que provoca la coagulación y el estancamiento de la sangre en el útero y en los meridianos Chong y Ren. En consecuencia, las personas experimentan dolor como resultado del estancamiento del flujo sanguíneo. Tanto la intrusión de patógenos del frío desde el exterior como la presencia de frío yin dentro del cuerpo pueden causar bloqueo y coagulación de los meridianos.

La localización de la dismenorrea es en los meridianos Chong y Ren, y el inicio está relacionado con cambios en el qi y la sangre. En la teoría de la medicina tradicional china, la moxibustión funciona estimulando el Yang Qi, calentando los meridianos, dispersando el frío y aumentando el flujo sanguíneo para aliviar el dolor. Según Jinfu de Lingshu23, si el pulso y el coágulo de sangre están en el medio, y hay sangre congelada y sangre fría, entonces es apropiado para la moxibustión; Es un tratamiento típico de la dismenorrea externa. En un trabajo publicado anteriormente se describen24 hojas de artemisia argyi como amargas y picantes, capaces de restaurar el Yang original casi agotado, conectando los doce meridianos, corriendo a través de los tres meridianos Yin, regulando el Qi y la sangre, disipando el frío y la humedad, y calentando el útero, la moxibustión, con la ayuda de los puntos de acupuntura correspondientes, puede expulsar factores patógenos externamente, regulan el Qi y la sangre internamente y, por lo tanto, desempeñan un papel en la regulación de los meridianos, activan la circulación sanguínea y detienen el dolor. El ombligo, también conocido como Shenque (CV8), pertenece al meridiano Ren, que conecta los meridianos Du, Chong y Dai. Según la teoría de la medicina tradicional china, se cree que el Shenque está relacionado con los cinco zang y los seis fu25. Se considera una base congénita y el pivote del equilibrio del yin-yang. Anatómicamente, el PDM se encuentra muy cerca de la pelvis y está estrechamente conectado con el útero. La enfermedad PDM afecta específicamente al útero, y su patogenia implica un desequilibrio del qi y la sangre, así como un desequilibrio de las vísceras. Al estimular el punto Shenque, es posible influir directamente en el qi y el estado de la sangre del útero y tratar eficazmente los cólicos menstruales. Basándonos en la teoría antes mencionada, seleccionamos la estimulación del punto de acupuntura Shenque situado en la región abdominal para la terapia HPM, con el objetivo de mejorar los síntomas de la dismenorrea y aliviar el dolor.

Para imitar la intervención de la MTC en la MDP lo más fielmente posible con la coagulación fría y la estasis sanguínea, replicamos la técnica de HPM en el ombligo en ratas hembras. Se descubrió que el HPM en el ombligo tiene un claro efecto analgésico y puede disminuir la reacción de retorcimiento de las ratas con dismenorrea. Con el fin de investigar el mecanismo de HPM en el ombligo para mejorar el PDM y promoverlo, hemos examinado una técnica de fijación de ratas y realización de HPM en el punto de acupuntura de Shenque en el vientre.

Protocolo

Este protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Revisión de Ética y Manejo de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Zhejiang. Todas las operaciones experimentales en animales cumplen con las normas éticas de bienestar animal experimental y seguridad animal experimental. El estudio utilizó ratas Wistar hembras adultas de 8 a 10 semanas del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Zhejiang. Antes del experimento, las ratas fueron alimentadas con una dieta adaptativa durante 1 semana en un ambiente controlado (temperatura: 23-25 °C, humedad: 40%-60%). Las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, con luces encendidas de 8:00 a 20:00, y tuvieron acceso sin restricciones a comida y agua. El siguiente protocolo describe el PDM con coagulación fría y establecimiento del modelo de estasis sanguínea y el HPM en el procedimiento de terapia del ombligo. En la Figura 1 se muestra una representación del procedimiento.

1. Establecimiento de PDM con coagulación en frío y estasis sanguínea

  1. Examina los ciclos estrales de las ratas mediante un lavado vaginal.
    1. Inserte la pistola de pipetas con 60 μL de solución salina al 0,9% en el orificio vaginal de la rata, pipetee hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces, y luego succione el líquido y déjelo caer en un portaobjetos de vidrio.
      NOTA: Sería apropiado envolver a la rata en una toalla que se pueda lavar o desechar.
    2. Fije el contenido seco agregando 60 μL de etanol al 95% durante 8 minutos, luego enjuague y seque el contenido. Agregue una solución de tinción de azul de metileno al 0,1% e incube lejos de la luz durante 10 minutos. Después, enjuague y seque el contenido.
    3. Observar y obtener imágenes bajo un microscopio.
      NOTA: Si se observa un gran número de glóbulos blancos y pocas células epiteliales nucleares, se confirma el estadio de diestro (Figura 1B). Estas ratas se dividieron aleatoriamente en el grupo de control, el grupo modelo y el grupo de moxibustión (n = 6).
  2. Establecimiento de modelos animales de PDM con coagulación en frío y estasis sanguínea
    1. Inyectar benzoato de estradiol por vía subcutánea en el muslo durante 10 días (0,5 mg por rata el1º y10º día y 0,2 mg del2º al9º día) para inducir la contracción del útero.
    2. Coloque las ratas hembras en un refrigerador a -20 ° C durante 4 h del 1eral 5 ° día de modelado26. Durante el período de incubación de 4 h, abra la puerta del refrigerador a mitad de camino para intercambiar aire durante 30 minutos y luego ciérrela.
    3. Inyectar oxitocina (2 U por rata) por inyección intraperitoneal 24 h después de la última administración para inducir dismenorrea.
      NOTA: Este estudio se basa en un trabajo publicado anteriormente que se centró en la coagulación en frío y la preparación de modelos de dismenorrea en ratas por estasis sanguínea27. Al grupo control se le inyectó el mismo volumen de solución salina y el procedimiento de congelación fue el mismo que el del grupo modelo.

2. Terapia de ombligo HPM en ratas hembra modelo PDM con coagulación fría y estasis sanguínea

NOTA: Prepare los cuatro materiales más importantes para la terapia del ombligo HPM (consulte la Tabla de materiales).

  1. Prepara los conos de moxa. Frote el hilo dental de moxa en la mano en forma de huso (diámetro 0,8 cm, altura 0,8 cm) (Figura 2A).
  2. Haga un tazón de masa con un agujero (diámetro 1 cm, profundidad 0,8 cm) en el medio (Figura 2B).
  3. Pesar 0,3 g de polvo de MTC (Figura 2C).
    NOTA: Según Du Dongqing28, el polvo de MTC contienesistos de Corydalis yanhusuo, Evodia fructus, Olíbano, Baishao (Paeoniae Radix Alba), Mirra, Borneol y Wulingzhi (Trogopterus Xanthipes).
  4. Prepara la bolsa para ratas para arreglarla. Esto mantendrá a la rata estable durante el procedimiento.
    1. Recorta la tela (largo x ancho: 20 cm x 20 cm) y cose en diagonal. Corta una pequeña abertura en la parte superior para respirar y un orificio (de aproximadamente 5 cm de diámetro) en un lado de la bolsa para la moxibustión.
    2. Cose un par de cuerdas de tela de unos 10 cm de largo y 1 cm de ancho en los extremos superior e inferior de la bolsa, respectivamente, para atar (Figura 2D).
      NOTA: El experimentador puede hacer un tamaño adecuado de la bolsa para ratas de acuerdo con el tamaño del animal probado.
  5. Encuentre la ubicación exacta del punto de acupuntura Shenque (CV8).
    1. Refiriéndonos a la literatura29,30, localizamos el Shenque (CV8) en la línea media del abdomen de la rata, en la intersección de los 2/3 superiores y 1/3 inferiores de la línea que conecta la apófisis xifoides y el borde superior del hueso púbico (Figura 1D).
  6. Retira el vello alrededor del punto de acupuntura Shenque.
  7. Coloca la rata en la bolsa para ratas. Mantén el abdomen de la rata levantado y expone las extremidades inferiores y la cola. Fije las partes superior e inferior del cuerpo y la cola de la rata en la mesa de operaciones con cinta adhesiva.
    NOTA: Al atar las ratas, el operador debe ser suave y no demasiado duro, asegurándose de que no cause pánico en las ratas y afecte los resultados experimentales. Asegúrese de que la fijación esté floja y no ejerza presión sobre el corazón, lo que puede provocar la mortalidad de las ratas.
  8. Desinfecte el Shenque y la piel circundante con etanol al 75 %.
  9. Coloque el tazón en el abdomen, apunte su agujero al punto de acupuntura Shenque y coloque el polvo de MTC en el punto de acupuntura Shenque.
  10. Ponga el cono de moxa en el polvo de TCM.
  11. Enciende el cono de moxa y coloca uno nuevo después de que el anterior se queme. Trate a la rata durante 30 minutos (Figura 1E).
    NOTA: No use anestesia durante el tratamiento. Callado. Observe a la rata de cerca para evitar quemaduras causadas por una temperatura excesiva durante la moxibustión.

3. Realización de la prueba de comportamiento

  1. Limpie la caja experimental con etanol al 75% antes de cada ensayo.
    NOTA: El campo abierto es un cubo de 40 cm x 40 cm x 40 cm sin tapa de caja de madera.
  2. Coloque a la rata en la jaula después de la inyección intraperitoneal de oxitocina (2 U) o solución salina al 0,9%.
  3. Grabe el comportamiento de retorcerse durante 30 minutos con una cámara de video.
  4. Calcule las latencias de retorcimiento (WL) y la puntuación de retorcimiento (WS).
    1. De acuerdo con el método de Schmauss31, divida el comportamiento de torsión en 4 niveles de 0 a 3. Puntúa a los animales según el método de Schmauss.
      NOTA: Nivel 0: postura normal (manos y garras planas en el fondo de la jaula o comportamiento exploratorio normal); Nivel 1: cuerpo inclinado hacia la izquierda o hacia la derecha; Nivel 2: patas traseras estiradas, parte posterior de las patas traseras dobladas y rotación frecuente de la pelvis; Nivel 3: contracción de los músculos abdominales, patas traseras estiradas hacia atrás. Las ratas mostraron respuestas retorcidas (contracción abdominal, concavidad, extensión del tronco y las extremidades traseras, rotación de una extremidad, contracción uterina), lo que indica una preparación exitosa de PDM tipo estasis de sangre congelada en frío. El período de incubación de la retorsión es el tiempo que transcurre desde la inyección de oxitocina hasta la aparición de una reacción de retorcimiento. Si el período de incubación supera los 30 min, se calcula como 30 min. Puntuación de Twist = (0 [veces] × 0) + (1 [veces] × 1) + (2 [veces] × 2) + (3 [veces] × 3).

4. Tomar la muestra después de la prueba de comportamiento

  1. Sostenga la rata con la mano e inyecte pentobarbital sódico al 3% (1 mL/kg) por vía intraperitoneal para anestesia profunda.
  2. Pesar las ratas para obtener el peso corporal.
  3. Incidir la piel y el músculo desde la mitad del abdomen para exponer el corazón.
  4. Inserte el corazón desde la posición del ápice con una aguja de perfusión, fije la aguja de perfusión con pinzas hemostáticas y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha.
  5. Perfundir solución salina al 0,9% a través del ventrículo izquierdo y la aorta ascendente hasta que el hígado y los ojos de la rata se vuelvan más claros y de color más blanco.
  6. Use unas tijeras para cortar el útero y pesarlo.
  7. Obtener el índice uterino calculando la relación entre el peso del útero y el peso corporal.

Resultados

En este estudio, se utilizó benzoato de estradiol en combinación con oxitocina para inducir el modelo PDM de coagulación fría y tipo estasis sanguínea para observar el efecto de la terapia de ombligo HPM. En primer lugar, mediante la observación del comportamiento de retorcimiento de la rata, determine si la rata PDM con coagulación fría y estasis sanguínea se modeló con éxito, y evalúe el comportamiento del dolor, el modelado y el tratamiento de la rata en el útero a travé...

Discusión

En la actualidad, existen varios métodos de modelado para PDM con coagulación fría y tipo de estasis sanguínea, pero el método principal es el benzoato de estradiol combinado con oxitocina para el modelado de la dismenorrea, que será diferente sobre esta base. En este estudio, se utilizó el método de congelación de cuerpo entero combinado con benzoato de estradiol y oxitocina para el modelado. La temperatura del método de congelación de todo el cuerpo fue de -20 °C. En el pr...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang, Programa de Exploración Q (LQ20H270012), Plan de Tecnología de Medicina Tradicional China de Zhejiang (NO.2020ZB124), el Proyecto de Investigación de la Universidad Médica China de Zhejiang (NO.2021JKZKTS056B) y el Proyecto de Nivel Hospitalario del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang (NO. ZS22ZA01). Estamos agradecidos con el Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica China de Zhejiang y el Laboratorio Clave de Acupuntura y Neurología de la Provincia de Zhejiang por proporcionarnos las condiciones experimentales.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% physiological salineHangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.SLYSZ1AFor injecting the control group 
1 mL disposable sterile syringeChangzhou Yuekang Medical Equipment Co., Ltd.3000-0515-14For drug injection
3 mL (extended) Pasteur pipetteBeijing Lanjieke Technology Co., Ltd.YCKJ-HC-007245For mounting
75% disinfection alcoholHangzhou OUTOP Biotechnology Co., Ltd.N/AFor sterilizing the treatment site
Adhesive-coated glass slideZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.188105WFor HE staining
Biochemical incubatorShanghai Boxun Industrial Co., Ltd. Medical Equipment FactoryN/AFor tissue dewaxing in HE staining
Cloth materialIn-house preparationN/APouch to hold rat
Digital manager slice scanning systemHamamatsuC13210-01For HE slice scanning
Disposable latex glovesGuangzhou Lige Technology Co., Ltd.LG10-102-1IFor use during operation
Estradiol benzoateHefei Xinkexin Animal Pharmaceutical Co., Ltd.N/AFor establishing dysmenorrhea model
Excelsior AS Fully automatic dehydratorThermo ScientificExcelsior ASFor HE staining tissue dehydration
Female Wistar ratsLaboratory Animal Center of Zhejiang Chinese Medicine UniversityN/A220–250 g
FlourIn-house preparationN/AFor herbs-partitioned moxibustion treatment
ForcepZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsnzFor specimen collection
Formaldehyde Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd.441244-1KGFor tissue fixation
Gemini AS slide stainerThermo ScientificGemini AS Staining machine
HemostatZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsnzFor specimen collection
HistoCoreLeica ( Arcadia H )14039357258For HE staining tissue embedding
Medical cotton ball sterileThe Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical UniversityN/AFor sterilize the tratment site
Methylene blue staining solution (0.1%)Beijing Honghu United Chemical Products Co., Ltd.G1300For screening estrous cycle
Microdissection ShearsHangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.XWJ12AFor specimen collection
Microscope cover glass (24 mm x 50 mm)Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.10212450CFor HE staining
MicrotomeLeica MicrosystemsRM2255For tissue sectioning
Midea freezerHefei Midea Refrigerator Co., Ltd.N/AFor establishing dysmenorrhea model with cold coagulation and blood stasis
Molar forcepsHangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.YGJD-11For specimen collection
Mounting mediumHangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.CS9603-100mLFor tissue mounting
Moxa stickThe Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical UniversityN/AFor herbs-partitioned moxibustion treatment
Pentobarbital sodiumHangzhou Dawen Biological Co., Ltd.N/AFor specimen collection
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hangzhou Gaosheng Biotechnology Co., Ltd.P1010-2LFor specimen collection
Scissor Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsnzFor specimen collection
Sectioning bladeShanghai Saihan Technology Co., Ltd.LEICA-819-boxFor HE staining paraffin section preparation
ShaverShenzhen Cordes Electrical Appliance Co., Ltd.N/AFor shaving a rat's hair
Sodium ChlorideChemical Reagent Co., Ltd.A501218-0001For specimen collection
SucroseZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.S11055-500gFor gradient dehydration
Thermal insulation containerZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.lsbwx8lFor paraffin section dewaxing
Tissue embedding cassettes, rectangular in shape, with a breakable lid.Zhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.31050102WFor HE staining tissue embedding
Wide adhesive tapeZhejiang Tuzhi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.N/AFor stabilizing rat during the treatment procedure

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