大鼠颌骨骨髓间充质干细胞的分离和培养技术

摘要

来自颌骨髓的间充质干细胞在多种分化、自我更新和免疫调节方面具有显着功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的重要储存库。在这里，我们提出了一种分离大鼠颌骨髓间充质干细胞的独特方法。

摘要

骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 是一种具有多向分化电位的干细胞。与来源于颌骨的 BMMSCs 相比，来源于颌骨的 BMMSCs 具有更强的增殖和成骨分化能力，逐渐成为颌骨缺损修复的重要种子细胞。然而，下颌骨具有复杂的骨结构，松质含量低于附肢骨。使用传统方法很难获得大量高质量的颌源性骨髓间充质干细胞。本研究提出了一种用于分离和培养大鼠颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 的“基于生态位的干性方法”。采用全骨髓贴壁法结合骨切片消化法分离培养原代大鼠 JBMMSCs。通过细胞形态学观察、细胞表面标志物检测和多向分化诱导，将分离的细胞鉴定为 JBMMSC。通过这种方法提取的细胞呈现“成纤维细胞样”纺锤形。细胞很长，呈纺锤形，呈成纤维细胞状。流式细胞术分析显示，这些细胞的 CD29、CD44 和 CD90 阳性，但 CD11b/c、CD34 和 CD45 阴性，这与 BMMSCs 特征一致。这些细胞表现出很强的增殖能力，可以发生成骨、成骨和成软骨分化。本研究为在短时间内获得足够多、具有强分化能力的高质量JBMMSCs提供了一种有效、稳定的方法，可促进生物功能、再生医学及相关临床应用的进一步研究。

引言

间充质干细胞 （MSC） 首先在骨髓中发现，显示出在培养物中形成粘附集落的能力和强大的成骨潜力¹。Pittinger 等人² 进一步发现了它们对骨骼、脂肪和软骨的多向分化潜力。尽管来自不同来源的所有间充质干细胞都具有多向分化的潜力，但与来自其他组织的间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞具有最强的软骨形成分化潜力，使其成为骨组织工程的最佳候选细胞³.然而，许多研究证明，来自不同来源的 BMMSCs 具有位点特异性特征和特性，例如成骨分化能力和细胞增殖活性 ^4,5。这可能是由于颌骨和阑尾骨或髂嵴⁶ 之间的胚层不同。

颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 起源于神经外胚层的神经嵴细胞，而股骨来源的 BMMSCs 起源于中胚层⁷。与来源于长骨和髂嵴的 BMMSCs 相比，JBMMSCs 具有更高的增殖率、ALP 活性和成骨电位⁸。此外，BMMSCs 在组织和器官中的应用效果可能因不同的细胞类型和环境而异⁹。颌骨缺损的修复主要取决于颌源间充质干细胞的募集。因此，研究 JBMMSCs 可为其在颌骨组织工程中的临床应用提供实验依据¹⁰.然而，基础研究和临床应用主要集中在源自阑尾骨和中轴骨的 BMMSCs¹¹。对 JBMMSC 的研究有限，这可能是由于下颌骨中松质骨含量低以及大鼠下颌的松质骨含量甚至更低¹²。因此，使用普通骨髓冲洗方法很难分离颌骨来源的骨髓间充质干细胞，该方法通常用于从附肢骨或髂嵴¹³ 中分离 BMMSCs。基于 Hong 等人 ¹⁴ 和 Cheng 等人 ¹⁵ 的方法，我们假设致密骨消化和骨髓冲洗方法的结合可以有效分离大鼠 JBMMSC。

本研究旨在建立一种分离大鼠 JBMMSCs 的有效方法，并为颌骨组织工程提供充足的种子细胞来源。

研究方案

该方案得到了中国人民解放军总医院机构动物伦理委员会的批准。使用 13 周龄雄性 Wistar 大鼠进行实验。有关动物、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表。

1. 实验准备

1. 在高温高压下对所有手术器械进行消毒，包括眼科剪刀、镊子和骨咬合器。
2. 提前准备培养基。
   1. 制备含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素的 α-MEM 完全培养基。
   2. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 0.1% II 型胶原酶。
   3. 在一次性无菌 50 mL 离心管中制备 50 mL 含 1% 青霉素-链霉素的 PBS。

2. 大鼠 JBMMSCs 的分离和培养

1. 按照以下步骤分离大鼠下颌骨：
   注：为保持样品无菌，所有金属手术器械在使用前必须在酒精灯火焰下高温消毒至少三秒钟。
   1. 通过腹膜内注射用 2% 戊巴比妥钠 （2 mL/kg） 麻醉大鼠。
   2. 在呼吸频率降低且肌肉完全放松后，通过颈椎脱位（遵循机构批准的方案）处死麻醉大鼠。
   3. 将大鼠浸入 75% 乙醇中 30 分钟消毒，然后将其转移到超净台上。
   4. 将大鼠放在一次性无菌布上或无菌容器中，并保持仰卧位。
   5. 沿支切割和分离从口角到关节的皮肤和肌肉，然后用眼剪刀水平切割颞下颌关节盘和双侧外周韧带，将髁突与关节盂窝分离。
      注意：通过移动下颌骨并从外部观察髁突的位置来确定颞下颌关节的位置。
   6. 用剪刀从下切牙颊侧的前庭沟向左右两侧切割和分离下颌外侧的肌肉和结缔组织。
   7. 从舌系带到下颌骨后部区域切开下颌骨的舌肌。
   8. 从颅骨上取下下颌骨。
   9. 用眼科剪刀剪下门牙之间的联合，将下颌骨分成两半。
   10. 使用眼科剪刀和镊子小心地去除下颌骨上剩余的附着肌肉、筋膜和其他软组织。
2. 隔离 JBMMSC。
   1. 将咬牙的喙放在门牙与第一磨牙近中部分的交界处，用咬牙切断下切牙与下颌骨的连接处，将下门牙完全拔出。
   2. 去除所有带有骨咬合器的磨牙。
   3. 用骨咬合器切除下颌支，并通过沿最后一颗磨牙¹⁶ 的远端边缘分离下颌骨的中央部分来暴露骨髓腔。
   4. 用 1 mL 一次性无菌注射器吸取 α-MEM 完全培养基。将针头插入骨髓腔，用 α-MEM 完全培养基反复将骨髓冲洗到培养皿中，直到骨骼变白。
   5. 将骨髓冲洗溶液收集到 15 mL 离心管中，并在室温下以 800 x g 离心 3 分钟。
   6. 用移液管弃去上清液，用 10 mL α-MEM 完全培养基重悬细胞，然后将它们接种到新的 10 cm 培养皿中。
   7. 用咬合器将冲洗的下颌骨分成 1-3 mm³ 的骨片，并在 37 °C 下用 3 mL 的 0.1% II 型胶原酶在 200 rpm/min 的摇床中消化 90 分钟。
   8. 在室温下以 800 x g 离心消化的下颌骨 3 分钟，然后弃去上清液。
   9. 在 37 °C 下，在 5% CO₂ 加湿培养箱中，用 α-MEM 完全培养基培养收获的细胞和消化的骨片。
   10. 72 小时后用新鲜培养基更换一半的培养基，然后每 2 天完全更换一次。
       注意：前三天不要移动培养皿。
   11. 当贴壁细胞达到 80%-90% 汇合时，以 1：2 的比例传代贴壁细胞。在第二次传代培养期间去除骨片。使用 P2 或 P3 代的细胞进行实验。

3. 用于鉴定细胞表面标志物的流式细胞术

1. 在流式细胞术缓冲液中重悬 P2 代的 JBMMSC。使用自动细胞计数器对细胞进行计数，并将浓度调节至 3 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 向每个微量离心管中加入 100 μL 细胞悬液和 2 μL 单克隆抗体（CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45 和 CD90）。在 4 °C^17,18 下孵育 30 分钟。
3. 用 200 μL 流式细胞术缓冲液洗涤样品两次，并在室温下以 250 x g 离心 5 分钟。去除上清液。
4. 向每个试管中加入 100 μL 流式细胞术缓冲液和 2 μL PE 标记的荧光二抗。在 4 °C 孵育 30 分钟。
5. 重复步骤 3.3。
6. 将 JBMMSCs 重悬于每管 300-500 μL 流式细胞术缓冲液中。
7. 使用流式细胞仪进行流式细胞术分析。
   注：使用同源抗体作为阴性对照，以消除由抗体的非特异性组合引起的背景染色。

4. 细胞增殖测定

1. 将 P3 代 JBMMSCs 以每孔 5 × 10³ 个细胞的密度接种到 96 孔板中。
2. 向每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液。
3. 将 96 孔板放入培养箱中 2 小时，并使用酶标仪测量吸光度（450 nm 处的 OD 值）。
   注意：连续 7 天每天在同一时间进行测试。

5. 菌落形成能力

1. 将第 3 代的 1000 个 JBMMSCs 接种到 10 cm 培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养。
2. 每 3 天更换一次培养基。
3. 连续培养 15 天后进行结晶紫染色。
4. 接下来，用甲醇固定细胞 5 分钟，并用 2% 结晶紫染色 5 分钟。

6. JBMMSC 的多谱系分化

注意：使用 P3 生成的 JBMMSCs 进行多谱系分化。对照组用 α-MEM 完全培养基培养。

1. 进行成骨分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 ×^{10 个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为成骨诱导培养基。
      注意：每 3 天更换一次成骨诱导培养基。
   3. 成骨诱导 7 天后进行碱性磷酸酶 （ALP） 染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 在室温下用 ALP 染色溶液对细胞染色 30 分钟，并避光保存。
   6. 冲洗细胞直到没有染色溶液残留，并在显微镜下观察样品。
   7. 成骨诱导 21 天后进行茜素红染色。
   8. 用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟后，用茜素红染色液对细胞染色 5 分钟。
   9. 用 PBS 洗涤细胞，直到没有茜素红染色液残留。
   10. 在显微镜下观察钙结节的数量。
2. 进行成脂分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 × 10^{个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为成脂诱导培养基。
      注意：每三天更换一次成脂诱导培养基。
   3. 成脂诱导 14 天后进行油红 O 染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，用油红 O 固定液固定细胞 20-30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 取出固定液，用蒸馏水洗涤细胞两次。
   6. 将细胞浸入 60% 异丙醇中 20-30 秒。
   7. 去除 60% 异丙醇，用油红 O 染色对细胞染色 20-30 分钟。
   8. 去除染色液，用 60% 异丙醇冲洗细胞 20-30 秒，然后用蒸馏水洗涤。
   9. 用苏木精溶液对细胞核染色 1-2 分钟。
   10. 取出苏木精溶液，用蒸馏水洗涤细胞 2-3 次。加入油红 O 缓冲液 1 分钟，然后取出。
   11. 在显微镜下观察脂滴的数量。
3. 进行软骨形成分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 ×^{10 个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为软骨形成诱导培养基。
      注意：每 3 天更换一次软骨形成诱导培养基。
   3. 软骨形成诱导 21 天后进行 Alcian 蓝染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 在 37 °C 下用 Alcian 蓝染色细胞 1 小时。
   6. 冲洗细胞直到没有染色溶液残留，并在显微镜下观察它们。

7. 实时 PCR

1. 使用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，并用酶标记物测量 RNA 浓度（按照制造商的说明）。
2. 使用 500 ng RNA 合成 cDNA¹⁹。
3. 在实时系统上使用 10 μL qRT-PCR 混合物进行 qRT-PCR，其中含有 1 μL cDNA、3.5 μL 双蒸水、5 μL SYBR 和 0.5 μL 引物混合物 （0.1 μM）。
   注意：引物序列列于 表 1 中。热循环条件如下：50 °C 2 min，95 °C 2 min，然后是 95 °C 15 s、60 °C 2 min 的 40 次循环，然后从 60 °C 到 95 °C 以 0.5 °C 的增量循环 5 s，形成熔融曲线。
4. 使用 GAPDH 作为内部对照¹⁶.

结果

细胞接种 72 小时后，大多数细胞呈悬浮和圆形，极少数细胞粘附在壁上（图 1B）。到第 5 天，贴壁细胞集落出现，呈现纺锤形或成纤维细胞样形状（图 1C）。到第 7 天，贴壁细胞达到 90% 汇合，形成具有少量间歇性悬浮细胞的“鱼群”形状（图 1D）。传代细胞生长迅速，每 3 天传代一次。细胞形态相对均匀，主要是纺锤形，汇合?...

讨论

骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 是存在于骨髓中的非造血干细胞的一个亚群，其特征是具有自我更新能力、多向分化电位和造血支持功能。这些细胞在各种生理过程中起着关键作用，例如组织再生、血管生成和细胞活动的调节²⁰。因此，BMMSCs 经常作为最佳种子细胞来源用于组织修复和再生工程²¹。

颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 最初由 Matsubara ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red S Solution 0.2%	Solarbio	G1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime	C3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
CCK8 Kit	Dujindo	CK04
Cell culture dish 10 cm	Corning	353003
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge Tube 15 mL	Corning	430790
Centrifuge Tube 50 mL	Corning	430828
CO2 incubator	Thermo Fisher	3111
Constant-temperature oscillator	Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.	ZWY-100H
Fetal bovine serum	BI	04-001-1ACS
Flow cytometer	BD	FACS C6
Inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit	Oricell	RAXMX-09011
Multifunctional microplate reader	BioTek	Synergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain Kit	Solarbio	G1262
Paraformaldehyde 4%	Solarbio	P1110
PBS	MACGENE	CC008
penicillin-streptomycin 0.25%	MACGENE	CC004
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher	A25742
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMD-90021
RNA extraction kit	TIANGEN	DP419
Super-clean bench	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.	KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%	MACGENE	CC012
Type II collagenase	Solarbio	C8150
Wistar rat	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium	Gibco	C12571500BT