Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen aus dem Kieferknochenmark haben wichtige Funktionen bei der vielfältigen Differenzierung, Selbsterneuerung und Immunmodulation. Sie haben sich als wichtiges Reservoir für Vorläuferzellen in der Gentherapie, im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin erwiesen. Hier stellen wir eine einzigartige Methode zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Kieferknochenmarks bei Ratten vor.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (BMMSCs) des Knochenmarks sind eine Stammzellart mit multidirektionalem Differenzierungspotenzial. Im Vergleich zu BMMSCs, die aus Blinddarmknochen gewonnen werden, haben BMMSCs aus dem Kiefer eine größere proliferative und osteogene Differenzierungsfähigkeit und werden allmählich zu wichtigen Samenzellen für die Reparatur von Kieferdefekten. Der Unterkiefer hat jedoch eine komplexe knöcherne Struktur und einen geringeren spongiösen Gehalt als Blinddarmknochen. Es ist schwierig, mit herkömmlichen Methoden eine große Anzahl hochwertiger mesenchymaler Stammzellen aus dem Kiefermark zu gewinnen. Diese Studie stellt einen "nischenbasierten Ansatz zur Stammzelle" für die Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen (JBMMSCs) aus dem Kieferknochenmark der Ratte vor. Primäre JBMMSCs der Ratte wurden isoliert und unter Verwendung der gesamten Knochenmark-Adhärent-Methode in Kombination mit der Knochenschnitt-Verdauungsmethode kultiviert. Die isolierten Zellen wurden durch Beobachtung der Zellmorphologie, Nachweis von Zelloberflächenmarkern und multidirektionale Differenzierungsinduktion als JBMMSCs identifiziert. Die auf diese Weise extrahierten Zellen weisen eine "fibroblastenähnliche" Spindelform auf. Die Zellen sind lang, spindelförmig und fibroblastenartig. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass diese Zellen positiv für CD29, CD44 und CD90 sind, aber negativ für CD11b/c, CD34 und CD45, was mit den Eigenschaften von BMMSCs kongruent ist. Die Zellen weisen eine starke Proliferationsfähigkeit auf und können osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung durchlaufen. Diese Studie bietet eine effektive und stabile Methode, um in kurzer Zeit genügend qualitativ hochwertige JBMMSCs mit starker Differenzierungsfähigkeit zu erhalten, was weitere Studien zur Erforschung der biologischen Funktion, der regenerativen Medizin und der damit verbundenen klinischen Anwendungen erleichtern könnte.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden zuerst im Knochenmark entdeckt, die in Kultur die Fähigkeit zur Bildung von Adhäsionskolonien und ein starkes osteogenes Potenzial zeigten¹. Pittinger et ^al.2 fanden außerdem ihr multidirektionales Differenzierungspotenzial in Richtung Knochen, Fett und Knorpel. Obwohl alle mesenchymalen Stammzellen aus unterschiedlichen Quellen das Potenzial für eine multidirektionale Differenzierung aufweisen, haben mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen, die aus anderen Geweben gewonnen werden, das stärkste chondrogene Differenzierungspotenzial, was sie zu den besten Kandidatenzellen für das Bone Tissue Engineering macht³. Viele Studien haben jedoch gezeigt, dass BMMSCs unterschiedlicher Herkunft ortsspezifische Merkmale und Eigenschaften aufweisen, wie z. B. osteogene Differenzierungsfähigkeit und zelluläre proliferative Aktivität ^4,5. Dies kann auf unterschiedliche Keimblätter zwischen Kiefer- und Blinddarmknochen oder dem Beckenkamm^{zurückzuführen sein 6}.

Mesenchymale Stammzellen des Kieferknochenmarks (JBMMSCs) stammen aus Neuralleistenzellen des Neuroektoderms, während aus Femuren stammende BMMSCs aus dem Mesoderm stammen⁷. Im Vergleich zu BMMSCs, die aus langen Knochen und dem Beckenkamm gewonnen werden, weisen JBMMSCs eine höhere Proliferationsrate, ALP-Aktivität und ein höheres osteogenes Potenzial^{auf 8}. Außerdem kann die Anwendungswirkung von BMMSCs in Geweben und Organen je nach Zelltyp und Umgebung variieren⁹. Die Reparatur von Kieferdefekten hängt hauptsächlich von der Rekrutierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kiefer ab. Daher kann die Untersuchung von JBMMSCs eine experimentelle Grundlage für ihre klinische Anwendung im Kieferknochengewebe-Engineering bieten¹⁰. Die Grundlagenforschung und die klinische Anwendung konzentrieren sich jedoch hauptsächlich auf BMMSCs, die aus Blinddarm- und Axialknochen gewonnen werden¹¹. Die Forschung zu JBMMSCs ist begrenzt, und dies könnte auf den geringen Gehalt an spongiösem Knochen im Unterkiefer und die Tatsache zurückzuführen sein, dass der Kiefer von Ratten einen noch geringeren Gehalt an spongiösen Knochen aufweist¹². Daher ist es schwierig, aus dem Kieferknochenmark stammende mesenchymale Stammzellen mit der gewöhnlichen Knochenmarkspülungsmethode zu trennen, die üblicherweise bei der Isolierung von BMMSCs aus Blinddarmknochen oder dem Beckenkamm verwendet wird¹³. Basierend auf den Methoden von Hong et ^al.14 und Cheng et ^al.15 stellten wir die Hypothese auf, dass die Kombination aus dichter Knochenverdauung und der Knochenmarkspülmethode JBMMSCs von Ratten effizient isolieren könnte.

Ziel dieser Studie ist es, eine effiziente Methode zur Isolierung von Ratten-JBMMSCs zu etablieren und ausreichende Samenzellquellen für das Kieferknochen-Tissue Engineering bereitzustellen.

Protokoll

Das Protokoll wurde von der Institutionellen Tierethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Für das Experiment wurden dreizehn Wochen alte männliche Wistar-Ratten verwendet. Details zu den Tieren, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Augenscheren, Pinzetten und Knochenrongeure, bei hoher Temperatur und hohem Druck.
2. Bereiten Sie Nährmedien im Voraus vor.
   1. Bereiten Sie α-MEM-Komplettmedium vor, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält.
   2. Bereiten Sie 0,1 % Typ-II-Kollagenase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
   3. Bereiten Sie 50 ml PBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin in einem sterilen Einweg-Zentrifugenröhrchen mit 50 ml vor.

2. Isolierung und Kultivierung von JBMMSC der Ratte

1. Isolieren Sie den Rattenunterkiefer mit den folgenden Schritten:
   HINWEIS: Um die Sterilität der Probe aufrechtzuerhalten, müssen alle chirurgischen Instrumente aus Metall vor der Verwendung mindestens drei Sekunden lang bei hoher Temperatur auf einer Alkohollampenflamme desinfiziert werden.
   1. Betäuben Sie die Ratte mit 2% Pentobarbital-Natrium (2 ml/kg) durch intraperitoneale Injektion.
   2. Opfern Sie die anästhesierte Ratte durch eine Luxation der Halswirbel (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen), nachdem ihre Atemfrequenz abnimmt und sich die Muskeln vollständig entspannen.
   3. Tauchen Sie die Ratte 30 Minuten lang in 75%iges Ethanol, um sie zu desinfizieren, und bringen Sie sie dann auf den ultrasauberen Tisch.
   4. Legen Sie die Ratte auf ein steriles Einwegtuch oder in einen sterilen Behälter und halten Sie sie in Rückenlage.
   5. Schneiden und trennen Sie die Haut und den Muskel vom Angulus oris bis zum Gelenk entlang des Ramus und trennen Sie dann den Kondylus von der Fossa glenoidal, indem Sie die Bandscheibe des Kiefergelenks und die beidseitigen peripheren Bänder horizontal mit einer Augenschere durchtrennen.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Position des Kiefergelenks, indem Sie den Unterkiefer bewegen und die Position des Kondylus nach außen beobachten.
   6. Schneiden und trennen Sie die Muskeln und das Bindegewebe des lateralen Unterkiefers mit einer Schere von der vestibulären Furche auf der bukkalen Seite der unteren Schneidezähne nach links und rechts.
   7. Die Zungenmuskulatur des Unterkiefers vom Zungenfrenum bis zum hinteren Bereich des Unterkiefers einschneiden.
   8. Entferne den Unterkiefer vom Schädel.
   9. Teilen Sie den Unterkiefer in zwei Hälften, indem Sie die Symphyse zwischen den unteren Schneidezähnen mit einer Augenschere durchschneiden.
   10. Entfernen Sie die verbleibenden anhaftenden Muskeln, Faszien und anderen Weichteile am Unterkiefer vorsichtig mit einer Augenschere und einer Pinzette.
2. Isolieren Sie JBMMSCs.
   1. Den Schnabel des Rongeurs an die Verbindung der Schneidezähne mit dem mesialen Teil des ersten Backenzahns legen, die Verbindung zwischen den unteren Schneidezähnen und dem Unterkiefer mit dem Rongeur abschneiden und die unteren Schneidezähne vollständig herausziehen.
   2. Entfernen Sie alle Backenzähne mit einem Knochenrongeur.
   3. Entfernen Sie den Unterkieferast mit einem Knochenrongeur und legen Sie die Markhöhle frei, indem der mittlere Teil des Unterkiefers entlang des distalen Randes des letzten Molaren¹⁶ abgetrennt wird.
   4. Saugen Sie α-MEM-Komplettmedium mit einer sterilen 1-ml-Einwegspritze. Führen Sie die Nadel in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark wiederholt mit α-MEM-Komplettmedium in die Kulturschale, bis der Knochen weiß wird.
   5. Sammeln Sie die Knochenmarkspüllösung in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 800 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
   6. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml α-MEM-Komplettmedium und geben Sie sie in eine neue 10-cm-Kulturschale.
   7. Teilen Sie den gespülten Unterkiefer mit einem Rongeur in 1-3 mm³ Knochenscheiben und verdauen Sie diese mit 3 mL 0,1% Typ-II-Kollagenase für 90 min in einem 200 U/min/min-Shaker bei 37 °C.
   8. Der verdaute Unterkiefer wird bei 800 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
   9. Kultivieren Sie die entnommenen Zellen und verdauten Knochenschnitte mit α-MEM-Komplettmedium bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator.
   10. Wechseln Sie die Hälfte des Nährbodens nach 72 h durch frisches Medium und wechseln Sie ihn dann alle 2 Tage vollständig.
       HINWEIS: Bewegen Sie die Kulturschale in den ersten drei Tagen nicht.
   11. Passieren Sie die adhärenten Zellen in einem Verhältnis von 1:2, wenn sie eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen. Entfernen Sie Knochenscheiben während der zweiten Subkultur. Verwenden Sie die Zellen der Generationen P2 oder P3 für Experimente.

3. Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Zelloberflächenmarkern

1. Resuspendieren Sie JBMMSCs der P2-Generation in einem Durchflusszytometrie-Puffer. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration auf 3 × 10⁶ Zellen/ml ein.
2. Geben Sie 100 μl Zellsuspension und 2 μl monoklonale Antikörper (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 und CD90) in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. 30 min bei 4 °C^17,18 inkubieren.
3. Waschen Sie die Probe zweimal mit 200 μl Durchflusszytometrie-Puffer und zentrifugieren Sie sie 5 min lang bei 250 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand.
4. Geben Sie 100 μl Durchflusszytometriepuffer und 2 μl PE-markierten fluoreszierenden Sekundärantikörper in jedes Röhrchen. 30 min bei 4 °C inkubieren.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.3.
6. Resuspendieren Sie JBMMSCs in 300-500 μl Durchflusszytometrie-Puffer pro Röhrchen.
7. Führen Sie die durchflusszytometrische Analyse mit einem Durchflusszytometer durch.
   HINWEIS: Verwenden Sie homologe Antikörper als Negativkontrollen, um Hintergrundverfärbungen zu vermeiden, die durch die unspezifische Kombination von Antikörpern verursacht werden.

4. Bestimmung der Zellproliferation

1. JBMMSCs der P3-Generation werden in eine 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10³ Zellen pro Well geseedet.
2. Geben Sie 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung.
3. Legen Sie die 96-Well-Platte für 2 h in den Inkubator und messen Sie die Extinktion (OD-Wert bei 450 nm) mit einem Mikroplatten-Reader.
   HINWEIS: Führen Sie den Test an sieben aufeinanderfolgenden Tagen jeden Tag zur gleichen Zeit durch.

5. Fähigkeit zur Koloniebildung

1. 1000 JBMMSC aus dem Durchgang 3 in 10 cm große Kulturschalen aussäen und bei 37 °C mit 5 % CO₂ züchten.
2. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
3. Führen Sie eine Kristallviolettfärbung nach kontinuierlicher Kultivierung für 15 Tage durch.
4. Anschließend die Zellen 5 min lang mit Methanol fixieren und 5 min mit 2% Kristallviolett färben.

6. Multilineage-Differenzierung von JBMMSCs

HINWEIS: Verwenden Sie JBMMSCs der P3-Generation für die Unterscheidung mehrerer Linien. Die Kontrollgruppe wurde mit α-MEM-Komplettmedium kultiviert.

1. Führen Sie eine osteogene Differenzierung durch.
   1. 1 × 10⁵ JBMMSCs pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte impfen.
   2. Wenn die Zellkonfluenz 70% erreicht, wechseln Sie das Medium zu osteogenem Induktionsmedium.
      HINWEIS: Wechseln Sie das osteogene Induktionsmedium alle 3 Tage.
   3. Führen Sie nach 7 Tagen osteogener Induktion eine Färbung mit alkalischer Phosphatase (ALP) durch.
   4. Nehmen Sie das Medium von der Sechs-Well-Platte, fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.
   5. Die Zellen 30 min bei Raumtemperatur mit ALP-Färbelösung einfärben und vor Licht schützen.
   6. Spülen Sie die Zellen, bis keine Färbelösung mehr übrig ist, und betrachten Sie die Proben unter einem Mikroskop.
   7. Führen Sie nach 21 Tagen osteogener Induktion eine Alizarinrotfärbung durch.
   8. Färben Sie die Zellen 5 Minuten lang mit Alizarinrot-Färbelösung, nachdem Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd fixiert haben.
   9. Waschen Sie die Zellen mit PBS, bis keine Alizarinrot-Färbelösung mehr übrig ist.
   10. Beobachten Sie die Anzahl der Kalziumknötchen unter dem Mikroskop.
2. Führen Sie eine adipogene Differenzierung durch.
   1. 1 × 10⁵ JBMMSCs pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte impfen.
   2. Wenn die Zellkonfluenz 70% erreicht, wechseln Sie das Medium zu einem adipogenen Induktionsmedium.
      HINWEIS: Wechseln Sie das adipogene Induktionsmedium alle drei Tage.
   3. Führen Sie nach 14 Tagen adipogener Induktion eine Ölrot-O-Färbung durch.
   4. Entfernen Sie das Medium von der Sechs-Well-Platte, fixieren Sie die Zellen 20-30 Minuten lang mit Oil Red O Fixierlösung und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.
   5. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser.
   6. Tauchen Sie die Zellen 20-30 s lang in 60% Isopropanol.
   7. Entfernen Sie 60% Isopropanol und färben Sie die Zellen 20-30 Minuten lang mit Öl rot O.
   8. Entfernen Sie die Färbelösung, spülen Sie die Zellen 20-30 s lang mit 60% Isopropanol und waschen Sie sie dann mit destilliertem Wasser.
   9. Färben Sie den Zellkern 1-2 Minuten lang mit Hämatoxylinlösung.
   10. Entfernen Sie die Hämatoxylinlösung und waschen Sie die Zellen 2-3 Mal mit destilliertem Wasser. Fügen Sie Oil Red O Buffer für 1 min hinzu und entfernen Sie es.
   11. Beobachten Sie die Anzahl der Lipidtröpfchen unter einem Mikroskop.
3. Führen Sie eine chondrogene Differenzierung durch.
   1. 1 × 10⁵ JBMMSCs pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte impfen.
   2. Wenn die Zellkonfluenz 70% erreicht, wechseln Sie das Medium zu chondrogenem Induktionsmedium.
      HINWEIS: Wechseln Sie das chondrogene Induktionsmedium alle 3 Tage.
   3. Führen Sie die Alcianblau-Färbung nach 21 Tagen chondrogener Induktion durch.
   4. Nehmen Sie das Medium von der Sechs-Well-Platte, fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.
   5. Die Zellen 1 h lang bei 37 °C mit Alcianblau-Färbung färben.
   6. Spülen Sie die Zellen aus, bis keine Färbelösung mehr übrig ist, und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop.

7. Echtzeit-PCR

1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit dem RNA-Extraktionskit und messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Enzymmarker (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
2. Synthetisieren Sie cDNA mit 500 ng RNA¹⁹.
3. Führen Sie die qRT-PCR auf einem Echtzeitsystem mit 10 μl qRT-PCR-Mix durch, der 1 μl cDNA, 3,5 μl doppelt destilliertes Wasser, 5 μl SYBR und 0,5 μl Primer-Mix (0,1 μM) enthält.
   HINWEIS: Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Temperaturwechselbedingungen sind wie folgt: 50 °C für 2 min, 95 °C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 2 min und dann Inkremente von 0,5 °C für 5 s von 60 °C auf 95 °C für die Schmelzkurve.
4. Verwenden Sie GAPDH als interne Kontrolle¹⁶.

Ergebnisse

Nach 72 Stunden Zellinokulation waren die meisten Zellen suspendiert und rund, wobei nur sehr wenige an der Wand hafteten (Abbildung 1B). Am fünften Tag erschienen adhärente Zellkolonien, die Spindeln oder fibroblastenähnliche Formen aufwiesen (Abbildung 1C). Am siebten Tag erreichten die adhärenten Zellen eine Konfluenz von 90 % und bildeten eine "Fischschwarm"-Form mit einer kleinen Anzahl intermittierender suspendierter Zellen (Abbild...

Diskussion

Mesenchymale Stammzellen (BMMSCs) des Knochenmarks stellen eine Untergruppe der nicht-hämatopoetischen Stammzellen dar, die sich im Knochenmark befinden und sich durch ihre Selbsterneuerungsfähigkeit, ihr multidirektionales Differenzierungspotenzial und ihre unterstützenden Funktionen für die Hämatopoese auszeichnen. Diese Zellen spielen eine zentrale Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie der Geweberegeneration, der Angiogenese und der Regulation zellulärer Aktivitäten²⁰. Fo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red S Solution 0.2%	Solarbio	G1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime	C3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
CCK8 Kit	Dujindo	CK04
Cell culture dish 10 cm	Corning	353003
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge Tube 15 mL	Corning	430790
Centrifuge Tube 50 mL	Corning	430828
CO2 incubator	Thermo Fisher	3111
Constant-temperature oscillator	Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.	ZWY-100H
Fetal bovine serum	BI	04-001-1ACS
Flow cytometer	BD	FACS C6
Inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit	Oricell	RAXMX-09011
Multifunctional microplate reader	BioTek	Synergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain Kit	Solarbio	G1262
Paraformaldehyde 4%	Solarbio	P1110
PBS	MACGENE	CC008
penicillin-streptomycin 0.25%	MACGENE	CC004
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher	A25742
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMD-90021
RNA extraction kit	TIANGEN	DP419
Super-clean bench	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.	KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%	MACGENE	CC012
Type II collagenase	Solarbio	C8150
Wistar rat	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium	Gibco	C12571500BT