Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

Resumen

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula tienen funciones significativas en la diferenciación diversa, la autorrenovación y la modulación inmunitaria. Se han convertido en un reservorio crucial de células precursoras en terapia génica, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Aquí, presentamos un método único para aislar células madre mesenquimales de médula ósea de la mandíbula en ratas.

Resumen

Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) son un tipo de célula madre con potencial de diferenciación multidireccional. En comparación con las BMMSC derivadas de los huesos apendiculares, las BMMSC derivadas de la mandíbula tienen una mayor capacidad de diferenciación proliferativa y osteogénica, convirtiéndose gradualmente en células semilla importantes para la reparación de defectos de la mandíbula. Sin embargo, la mandíbula tiene una estructura ósea compleja y menos esponjoso que los huesos apendiculares. Es difícil adquirir un gran número de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de la mandíbula de alta calidad utilizando métodos tradicionales. Este estudio presenta un "enfoque basado en nichos sobre la madre" para aislar y cultivar células madre mesenquimales de médula ósea (JBMMSC) de mandíbula de rata. Las JBMMSC primarias de rata se aislaron y cultivaron utilizando el método de adherencia de médula ósea completa combinado con el método de digestión de cortes de hueso. Las células aisladas se identificaron como JBMMSC mediante la observación de la morfología celular, la detección de marcadores de superficie celular y la inducción de diferenciación multidireccional. Las células extraídas por este método exhiben una forma de huso "similar a un fibroblasto". Las células son largas, fusiformes y parecidas a fibroblastos. El análisis de citometría de flujo muestra que estas células son positivas para CD29, CD44 y CD90, pero negativas para CD11b/c, CD34 y CD45, lo cual es congruente con las características de las BMMSC. Las células muestran una fuerte capacidad de proliferación y pueden experimentar diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica. Este estudio proporciona un método eficaz y estable para obtener suficientes JBMMSC de alta calidad con una fuerte capacidad de diferenciación en poco tiempo, lo que podría facilitar estudios adicionales de la exploración de la función biológica, la medicina regenerativa y las aplicaciones clínicas relacionadas.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) se descubrieron por primera vez en la médula ósea, que mostraron la capacidad de formar colonias adhesivas en cultivo y un fuerte potencial osteogénico¹. Pittinger et ^al.2 descubrieron además su potencial de diferenciación multidireccional hacia el hueso, la grasa y el cartílago. Aunque todas las células madre mesenquimales de diferentes fuentes tienen el potencial de diferenciación multidireccional, las células madre mesenquimales de la médula ósea tienen el mayor potencial de diferenciación condrogénica en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de otros tejidos, lo que las convierte en las mejores células candidatas para^{la ingeniería de} tejidos óseos.. Sin embargo, muchos estudios han demostrado que las BMMSCs de diferentes orígenes presentan características y propiedades específicas del sitio, como la capacidad de diferenciación osteogénica y la actividad proliferativa celular ^4,5. Esto puede deberse a diferentes capas germinales entre la mandíbula y los huesos apendiculares o la cresta ilíaca⁶.

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula (JBMMSC) surgen de las células de la cresta neural del neuroectodermo, mientras que las BMMSC derivadas del fémur se originan en el^{mesodermo 7}. En comparación con las BMMSC derivadas de los huesos largos y la cresta ilíaca, las JBMMSC tienen una mayor tasa de proliferación, actividad ALP y potencial osteogénico⁸. Además, el efecto de la aplicación de las BMMSCs en tejidos y órganos puede variar dependiendo de los diferentes tipos de células y entornos⁹. La reparación de los defectos de la mandíbula depende principalmente del reclutamiento de células madre mesenquimales derivadas de la mandíbula. Por lo tanto, el estudio de las JBMMSC puede proporcionar una base experimental para su aplicación clínica en la ingeniería de tejidos óseos mandibulares¹⁰. Sin embargo, la investigación básica y las aplicaciones clínicas se centran principalmente en las BMMSC derivadas de huesos apendiculares y axiales¹¹. La investigación sobre las JBMMSCs es limitada, y esto puede deberse al bajo contenido de hueso esponjoso en la mandíbula y al hecho de que las mandíbulas de las ratas tienen aún menos contenido de hueso esponjoso¹². Por lo tanto, es difícil separar las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula utilizando el método ordinario de lavado de la médula ósea, que se usa comúnmente para aislar las BMMSC de los huesos apendicular o de la cresta ilíaca¹³. Basándonos en los métodos de Hong et ^al.14 y Cheng et ^al.15, planteamos la hipótesis de que la combinación de la digestión ósea densa y el método de lavado de la médula ósea podría aislar eficientemente las JBMMSC de rata.

Este estudio tiene como objetivo establecer un método eficiente para aislar las JBMMSC de rata y proporcionar suficientes fuentes de células semilla para la ingeniería de tejidos óseos de la mandíbula.

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal del Hospital General del PLA de China. Para el experimento se utilizaron ratas Wistar macho de trece semanas de edad. Los detalles sobre los animales, los reactivos y el equipo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, incluidas las tijeras oftálmicas, las pinzas y los espigones óseos, a alta temperatura y presión.
2. Prepare los medios de cultivo con anticipación.
   1. Prepare α medio completo de MEM que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
   2. Prepare colagenasa tipo II al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   3. Prepare 50 mL de PBS con penicilina-estreptomicina al 1% en un tubo centrífugo estéril desechable de 50 mL.

2. Aislamiento y cultivo de JBMMSC de ratas

1. Aísla la mandíbula de la rata siguiendo los siguientes pasos:
   NOTA: Para mantener la esterilidad de la muestra, todos los instrumentos quirúrgicos metálicos deben desinfectarse a alta temperatura sobre la llama de una lámpara de alcohol durante al menos tres segundos antes de su uso.
   1. Anestesiar a la rata con pentobarbital sódico al 2% (2 mL/kg) mediante inyección intraperitoneal.
   2. Sacrificar la rata anestesiada por dislocación de vértebras cervicales (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) después de que su frecuencia respiratoria disminuya y los músculos se relajen por completo.
   3. Sumerja la rata en etanol al 75% durante 30 minutos para desinfectarla y luego transfiérala a la mesa ultra limpia.
   4. Coloque la rata sobre un paño estéril desechable o en un recipiente estéril y manténgala en posición supina.
   5. Cortar y separar la piel y el músculo del ángulo de oris a la articulación a lo largo de la rama, y luego separar el cóndilo de la fosa glenoidea cortando el disco de la articulación temporomandibular y los ligamentos periféricos bilaterales horizontalmente con tijeras oftálmicas.
      NOTA: Determine la posición de la articulación temporomandibular moviendo la mandíbula y observando la posición del cóndilo externamente.
   6. Cortar y separar los músculos y los tejidos conectivos de la mandíbula lateral con unas tijeras desde el surco vestibular en el lado bucal de los incisivos inferiores hacia los lados izquierdo y derecho.
   7. Incisión en los músculos linguales de la mandíbula desde el frenillo lingual hasta la región posterior de la mandíbula.
   8. Retire la mandíbula del cráneo.
   9. Divida la mandíbula en mitades cortando la sínfisis entre los incisivos inferiores con unas tijeras oftálmicas.
   10. Retire los músculos adheridos, la fascia y otros tejidos blandos restantes de la mandíbula con cuidado con tijeras y pinzas oftálmicas.
2. Aísle los JBMMSC.
   1. Coloque el pico del rongeur en la unión de los incisivos y la parte mesial del primer molar, corte la conexión entre los incisivos inferiores y la mandíbula con el rongeur, y extraiga los incisivos inferiores por completo.
   2. Retire todos los molares con un rongeur de hueso.
   3. Extraer la rama mandibular con un rongeur óseo y exponer la cavidad medular separando la parte central de la mandíbula a lo largo del borde distal del último molar¹⁶.
   4. Aspire el medio completo α-MEM con una jeringa estéril desechable de 1 mL. Inserte la aguja en la cavidad de la médula ósea y enjuague la médula ósea repetidamente en la placa de cultivo con medio completo α-MEM hasta que el hueso se vuelva blanco.
   5. Recoja la solución de lavado de médula ósea en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 800 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   6. Deseche el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células con 10 mL de medio completo α-MEM y colóquelas en una nueva placa de cultivo de 10 cm.
   7. Divida la mandíbula enjuagada en rodajas de hueso de 1-3 mm³ con un rongeur y digieralas con 3 mL de colagenasa tipo II al 0,1% durante 90 min en un agitador de 200 rpm/min a 37 °C.
   8. Centrifugar la mandíbula digerida a 800 x g durante 3 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
   9. Cultive las células recolectadas y los trozos de hueso digeridos con medio completo α-MEM a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .
   10. Cambie la mitad del medio de cultivo por medio fresco después de 72 h y luego cámbielo completamente cada 2 días.
       NOTA: No mueva la placa de cultivo durante los primeros tres días.
   11. Pase las células adherentes en una proporción de 1:2 cuando alcancen el 80%-90% de confluencia. Retire las rodajas de hueso durante el segundo subcultivo. Utilice las celdas de las generaciones P2 o P3 para los experimentos.

3. Citometría de flujo para la identificación de marcadores de superficie celular

1. Vuelva a suspender las JBMMSC de la generación P2 en el tampón de citometría de flujo. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y ajuste la concentración a 3 × 10⁶ células/mL.
2. Agregue 100 μL de suspensión celular y 2 μL de anticuerpos monoclonales (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 y CD90) a cada tubo de microcentrífuga. Incubar durante 30 min a 4 °C^17,18.
3. Lavar la muestra dos veces con 200 μL de tampón de citometría de flujo y centrifugarla durante 5 min a 250 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante.
4. Agregue 100 μL de tampón de citometría de flujo y 2 μL de anticuerpo secundario fluorescente marcado con PE a cada tubo. Incubar a 4 °C durante 30 min.
5. Repita el paso 3.3.
6. Resuspenda las JBMMSC en 300-500 μL de tampón de citometría de flujo por tubo.
7. Realice el análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo.
   NOTA: Utilice anticuerpos homólogos como controles negativos para eliminar la tinción de fondo causada por la combinación inespecífica de anticuerpos.

4. Determinación de la proliferación celular

1. Siembre las JBMMSC de la generación P3 en una placa de 96 pocillos con una densidad de 5 × 10³ celdas por pocillo.
2. Agregue 10 μL de solución CCK-8 a cada pocillo.
3. Coloque la placa de 96 pocillos en la incubadora durante 2 h y mida la absorbancia (valor OD a 450 nm) con un lector de microplacas.
   NOTA: Realice la prueba a la misma hora todos los días durante siete días consecutivos.

5. Capacidad de formación de colonias

1. Siembre 1000 JBMMSCs del pasaje 3 en placas de cultivo de 10 cm y cultivo a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Cambie el medio de cultivo cada 3 días.
3. Realizar la tinción con cristal violeta después de un cultivo continuo durante 15 días.
4. A continuación, fije las células con metanol durante 5 min y tiña con un 2% de cristal violeta durante 5 min.

6. Diferenciación multilinaje de las JBMMSC

NOTA: Utilice JBMMSC de generación P3 para la diferenciación de varios linajes. El grupo control se cultivó con medio completo α-MEM.

1. Realizar la diferenciación osteogénica.
   1. Inocular 1 × 10⁵ JBMMSC por pocillo en una placa de seis pocillos.
   2. Cuando la confluencia celular alcance el 70%, cambie el medio a medio de inducción osteogénico.
      NOTA: Cambie el medio de inducción osteogénico cada 3 días.
   3. Realizar la tinción con fosfatasa alcalina (ALP) después de 7 días de inducción osteogénica.
   4. Retire el medio de la placa de seis pocillos, fije las celdas con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego lávelas con PBS tres veces.
   5. Tiñir las células con solución de tinción de ALP a temperatura ambiente durante 30 min y protegerlas de la luz.
   6. Enjuague las células hasta que no quede ninguna solución de tinción y observe las muestras bajo un microscopio.
   7. Realizar la tinción con rojo de alizarina después de 21 días de inducción osteogénica.
   8. Tiñir las células con una solución de tinción de rojo de alizarina durante 5 minutos después de fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos.
   9. Lave las células con PBS hasta que no quede una solución de tinción de rojo de alizarina.
   10. Observe el número de nódulos de calcio bajo un microscopio.
2. Realizar la diferenciación adipogénica.
   1. Inocular 1 × 10⁵ JBMMSC por pocillo en una placa de seis pocillos.
   2. Cuando la confluencia celular alcanza el 70%, cambie el medio a medio de inducción adipogénico.
      NOTA: Cambie el medio de inducción adipogénico cada tres días.
   3. Realice la tinción de aceite rojo O después de 14 días de inducción adipogénica.
   4. Retire el medio de la placa de seis pocillos, fije las celdas con una solución de fijación Oil Red O durante 20-30 minutos y luego lávelas con PBS tres veces.
   5. Retire la solución de fijación y lave las celdas con agua destilada dos veces.
   6. Sumerja las células en isopropanol al 60% durante 20-30 s.
   7. Retirar el 60% de isopropanol y teñir las células con aceite rojo O tinción durante 20-30 min.
   8. Retire la solución de tinción, enjuague las células con isopropanol al 60% durante 20-30 s y luego lávelas con agua destilada.
   9. Tiñir el núcleo con una solución de hematoxilina durante 1-2 min.
   10. Retire la solución de hematoxilina y lave las células 2-3 veces con agua destilada. Agregue el tampón O rojo aceite durante 1 min y retírelo.
   11. Observe el número de gotas de lípidos bajo un microscopio.
3. Realizar diferenciación condrogénica.
   1. Inocular 1 × 10⁵ JBMMSC por pocillo en una placa de seis pocillos.
   2. Cuando la confluencia celular alcanza el 70%, cambie el medio a medio de inducción condrogénico.
      NOTA: Cambie el medio de inducción condrogénico cada 3 días.
   3. Realizar la tinción con azul alcián después de 21 días de inducción condrogénica.
   4. Retire el medio de la placa de seis pocillos, fije las celdas con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego lávelas con PBS tres veces.
   5. Teñir las células con azul alcián a 37 °C durante 1 h.
   6. Enjuague las células hasta que no quede ninguna solución de tinción y obsérvelas bajo un microscopio.

7. PCR en tiempo real

1. Extraiga el ARN total con el kit de extracción de ARN y mida la concentración de ARN con un marcador enzimático (siguiendo las instrucciones del fabricante).
2. Sintetizar ADNc utilizando 500 ng de ARN¹⁹.
3. Realice qRT-PCR en un sistema en tiempo real con 10 μL de mezcla de qRT-PCR que contiene 1 μL de ADNc, 3,5 μL de agua bidestilada, 5 μL de SYBR y 0,5 μL de mezcla de cebador (0,1 μM).
   NOTA: Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1. Las condiciones de ciclo térmico son las siguientes: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 2 min, seguidos de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 2 min, y luego incrementos de 0,5 °C durante 5 s de 60 °C a 95 °C para la curva de fusión.
4. Utilizar el GAPDH como control interno¹⁶.

Resultados

Después de 72 h de inoculación celular, la mayoría de las células estaban suspendidas y de forma redonda, con muy pocas adheridas a la pared (Figura 1B). Al quinto día, aparecieron colonias de células adherentes, que exhibían husos o formas similares a fibroblastos (Figura 1C). Al séptimo día, las células adherentes alcanzaron el 90% de confluencia, formando una forma de "banco de peces" con un pequeño número de células suspendidas intermitentes (

Discusión

Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) representan un subconjunto de células madre no hematopoyéticas que residen en la médula ósea, caracterizadas por su capacidad de autorrenovación, su potencial de diferenciación multidireccional y sus funciones de apoyo para la hematopoyesis. Estas células desempeñan un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos, como la regeneración de tejidos, la angiogénesis y la regulación de las actividades celulares²⁰. En consec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red S Solution 0.2%	Solarbio	G1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime	C3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
CCK8 Kit	Dujindo	CK04
Cell culture dish 10 cm	Corning	353003
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge Tube 15 mL	Corning	430790
Centrifuge Tube 50 mL	Corning	430828
CO2 incubator	Thermo Fisher	3111
Constant-temperature oscillator	Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.	ZWY-100H
Fetal bovine serum	BI	04-001-1ACS
Flow cytometer	BD	FACS C6
Inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit	Oricell	RAXMX-09011
Multifunctional microplate reader	BioTek	Synergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain Kit	Solarbio	G1262
Paraformaldehyde 4%	Solarbio	P1110
PBS	MACGENE	CC008
penicillin-streptomycin 0.25%	MACGENE	CC004
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher	A25742
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMD-90021
RNA extraction kit	TIANGEN	DP419
Super-clean bench	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.	KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%	MACGENE	CC012
Type II collagenase	Solarbio	C8150
Wistar rat	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium	Gibco	C12571500BT