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요약

턱뼈 골수에서 채취한 중간엽 줄기세포는 다양한 분화, 자가 재생, 면역 조절에 중요한 기능을 합니다. 그들은 유전자 치료, 조직 공학 및 재생 의학에서 전구 세포의 중요한 저장소로 부상했습니다. 여기에서는 쥐에서 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는 독특한 방법을 제시합니다.

초록

골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)는 다방향 분화 가능성이 있는 줄기 세포의 한 유형입니다. 충수골에서 유래한 BMMSC에 비해 턱에서 유래한 BMMSC는 증식 및 골형성 분화 능력이 뛰어나 점차 턱 결손 복구에 중요한 종자 세포가 되고 있습니다. 그러나 하악골은 복잡한 뼈 구조를 가지고 있으며 충수골보다 수축성 함량이 적습니다. 전통적인 방법으로는 고품질의 턱 유래 골수 중간엽 줄기 세포를 대량으로 획득하기 어렵습니다. 이 연구는 쥐의 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포(JBMMSC)를 분리하고 배양하기 위한 '줄기세포에 대한 틈새 기반 접근법'을 제시합니다. 원발성 쥐 JBMMSC는 뼈 절편 분해 방법과 결합된 전체 골수 부착 방법을 사용하여 분리 및 배양했습니다. 분리된 세포는 세포 형태 관찰, 세포 표면 마커 검출 및 다방향 분화 유도를 통해 JBMMSC로 식별되었습니다. 이 방법으로 추출한 세포는 '섬유아세포와 같은' 방추체 모양을 나타냅니다. 세포는 길고 방추 모양이며 섬유아세포와 같습니다. 유세포 분석 결과 이들 세포는 CD29, CD44 및 CD90에 대해서는 양성이지만 CD11b/c, CD34 및 CD45에 대해서는 음성이며, 이는 BMMSC의 특성과 일치합니다. 세포는 강력한 증식 능력을 보이며 골형성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 분화를 거칠 수 있습니다. 이 연구는 단시간에 강력한 분화 능력을 가진 충분한 고품질 JBMMSC를 얻을 수 있는 효과적이고 안정적인 방법을 제공하여 생물학적 기능, 재생 의학 및 관련 임상 응용에 대한 추가 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

서문

중간엽 줄기세포(MSCs)는 골수에서 처음 발견되었으며, 배양에서 접착 군락을 형성할 수 있는 능력과 강력한 골형성 잠재력을 보여주었습니다1. Pittinger et al.2은 뼈, 지방 및 연골에 대한 다방향 분화 잠재력을 추가로 발견했습니다. 서로 다른 출처의 모든 중간엽 줄기세포는 다방향 분화의 잠재력을 가지고 있지만, 골수 중간엽 줄기세포는 다른 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포에 비해 가장 강력한 연골 분화 잠재력을 가지고 있어 뼈 조직 공학에 가장 적합한 후보 세포로 간주됩니다3. 그러나 많은 연구에서 다양한 기원의 BMMSC가 골형성 분화 능력 및 세포 증식 활성과 같은 부위 특이적 특성 및 특성을 나타낸다는 것을 입증했습니다 4,5. 이는 턱뼈와 충수골 사이의 생식층이 다르거나 장골능선(iliac crest)이 다르기 때문일 수 있다6.

턱뼈 골수 중간엽 줄기세포(JBMMSC)는 신경외배엽의 신경능선 세포에서 발생하는 반면, 대퇴골 유래 BMMSC는 중배엽에서 유래한다7. 장골과 장골능선에서 유래한 BMMSC와 비교했을 때, JBMMSC는 증식률, ALP 활성도 및 골형성 전위가 더 높다8. 게다가, 조직 및 장기에 대한 BMMSC의 적용 효과는 세포 유형 및 환경에 따라 다를 수 있습니다9. 턱 결손의 복구는 주로 턱 유래 중간엽 줄기 세포의 모집에 달려 있습니다. 따라서 JBMMSC를 연구하는 것은 턱뼈 조직 공학에서 임상적 적용을 위한 실험적 기초를 제공할 수 있다10. 그러나 기초 연구 및 임상 응용은 주로 충수골 및 축골에서 유래한 BMMSC에 초점을 맞추고 있다11. JBMMSC에 대한 연구는 제한적이며, 이는 하악골의 해면골 함량이 낮고 쥐의 턱에 해면골 함량이 훨씬 적기 때문일 수 있다12. 따라서, 충수골 또는 장골능선(iliac crest 13)에서 BMMSC를 분리하는 데 일반적으로 사용되는 일반적인 골수 세척법을 사용하여 턱뼈 유래 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는 것은 어렵다13. Hong et al.14 및 Cheng et al.15의 방법을 바탕으로 조밀한 골 소화와 골수 세척 방법의 조합이 쥐 JBMMSC를 효율적으로 분리할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

이 연구는 랫트 JBMMSC를 분리하는 효율적인 방법을 확립하고 턱뼈 조직 공학을 위한 충분한 종자 세포 소스를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 중국 PLA 종합병원의 기관 동물 윤리 위원회(Institutional Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 실험에는 13주 된 수컷 Wistar 쥐가 사용되었습니다. 동물, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험적 준비

  1. 안과 가위, 핀셋, 뼈 막대기를 포함한 모든 수술 기구를 고온과 압력에서 멸균합니다.
  2. 배양 배지를 미리 준비하십시오.
    1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 α-MEM 완전한 배지를 준비합니다.
    2. 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.1% II형 콜라겐분해효소를 제조합니다.
    3. 일회용 멸균 50mL 원심분리 튜브에 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 50mL의 PBS를 준비합니다.

2. 랫드 JBMMSC의 분리 및 배양

  1. 아래 단계에 따라 쥐 하악골을 분리합니다.
    알림: 샘플 무균 상태를 유지하기 위해 모든 금속 수술 기구는 사용하기 전에 최소 3초 동안 알코올 램프 화염에서 고온으로 소독해야 합니다.
    1. 복강 내 주사로 2% 펜토바르비탈 나트륨(2mL/kg)으로 쥐를 마취합니다.
    2. 호흡수가 감소하고 근육이 완전히 이완된 후 경추 탈구(기관에서 승인된 프로토콜에 따라)로 마취된 쥐를 희생시킵니다.
    3. 쥐를 75% 에탄올에 30분 동안 담가 소독한 다음 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다.
    4. 쥐를 일회용 멸균 천이나 멸균 용기에 넣고 누운 자세로 보관하십시오.
    5. 안구(angulus oris)에서 라무스(ramus)를 따라 관절까지 피부와 근육을 절단하여 분리한 후, 턱관절 디스크와 양측 말초 인대를 안과 가위로 수평으로 절단하여 과두와 협두를 편두엽(glenoid fossa)에서 분리합니다.
      NOTE: 턱관절의 위치는 하악골을 움직이고 외부에서 과두의 위치를 관찰하여 결정합니다.
    6. 하악골의 근육과 결합 조직을 가위를 사용하여 아래 앞니의 협측 쪽 전정 홈에서 좌우로 절단하고 분리합니다.
    7. 하악골의 설측 근육을 설측 격골에서 하악골의 후방까지 절개합니다.
    8. 두개골에서 하악골을 제거합니다.
    9. 하악골을 반으로 나누어 아래 앞니 사이의 대칭을 안과 가위로 잘라냅니다.
    10. 하악골에 붙어 있는 나머지 근육, 근막 및 기타 연조직을 안과 가위와 집게를 사용하여 조심스럽게 제거합니다.
  2. JBMMSC를 격리합니다.
    1. 룽게르의 부리를 앞니와 첫 번째 어금니의 근막 부분이 만나는 곳에 놓고 아래 앞니와 하악골의 연결을 롱게르로 차단하고 아래 앞니를 완전히 발치합니다.
    2. 뼈 rongeur로 모든 어금니를 제거하십시오.
    3. 뼈 룽으로 하악골을 제거하고 마지막 어금니16의 원위 가장자리를 따라 하악골의 중앙 부분을 분리하여 골수를 노출시킵니다.
    4. 1mL 일회용 멸균 주사기로 α-MEM complete medium을 흡입합니다. 바늘을 골수강에 삽입하고 뼈가 하얗게 변할 때까지 α-MEM 완전 배지를 사용하여 골수를 배양 접시에 반복적으로 플러시합니다.
    5. 골수 세척액을 15mL 원심분리 튜브에 모으고 실온에서 800 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
    6. 피펫으로 상층액을 버리고 10mL의 α-MEM 완전 배지로 세포를 재현탁한 다음 새로운 10cm 배양 접시에 담습니다.
    7. 세척된 하악골을 rongeur로 1-3mm³ 뼈 조각으로 나누고 37°C에서 200rpm/min 셰이커에서 90분 동안 0.1% II형 콜라겐분해효소 3mL로 소화합니다.
    8. 상온에서 800 x g 에서 3분 동안 분해된 하악골을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    9. 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C의 α-MEM 완전 배지로 수확된 세포와 분해된 뼈 절편을 배양합니다.
    10. 72시간 후 배양 배지의 절반을 새 배지로 교체한 다음 2일마다 완전히 교체합니다.
      알림: 처음 3일 동안은 배양 접시를 움직이지 마십시오.
    11. 부착 세포가 80%-90% 밀도에 도달할 때 1:2의 비율로 통과시킵니다. 두 번째 하위 배양 중에 뼈 조각을 제거합니다. P2 또는 P3 세대의 셀을 실험에 사용합니다.

3. 세포 표면 마커 식별을 위한 유세포 분석

  1. P2 생성의 JBMMSC를 유세포 분석 버퍼에 재현탁합니다. 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 세고 농도를 3 × 106 cells/mL로 조정합니다.
  2. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 100μL의 세포 현탁액과 2μL의 단클론 항체(CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 및 CD90)를 추가합니다. 4 °C에서 30분 동안 배양합니다17,18.
  3. 200 μL의 유세포 분석 완충액으로 시료를 2회 세척하고 실온에서 250 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
  4. 각 튜브에 100μL의 유세포 분석 완충액과 2μL의 PE 표지 형광 2차 항체를 추가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
  5. 3.3단계를 반복합니다.
  6. 튜브당 300-500 μL의 유세포 분석 버퍼에 JBMMSC를 재현탁시킵니다.
  7. 유세포분석기를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다.
    참고: 비특이적 항체 조합으로 인한 배경 염색을 제거하기 위해 상동 항체를 음성 대조군으로 사용하십시오.

4. 세포 증식 측정

  1. P3 세대의 JBMMSC를 웰당 5 × 103 셀의 밀도로 96웰 플레이트에 시드합니다.
  2. 각 웰에 10μL의 CCK-8 용액을 추가합니다.
  3. 96웰 플레이트를 인큐베이터에 2시간 동안 놓고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도(450nm에서 OD 값)를 측정합니다.
    참고: 연속 7일 동안 매일 같은 시간에 테스트를 수행합니다.

5. 콜로니 형성 능력

  1. 통로 3에서 10cm 배양 접시에 1000 JBMMSC를 파종하고 37 ° C에서 5 % CO2로 배양합니다.
  2. 배양 배지는 3일마다 교체합니다.
  3. 15일 동안 연속 배양 후 크리스탈 바이올렛 염색을 수행합니다.
  4. 다음으로, 5분 동안 메탄올로 세포를 고정하고 5분 동안 2% 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다.

6. JBMMSC의 다계통 분화

참고: 다중 계보 차별화를 위해 P3 세대의 JBMMSC를 사용합니다. 대조군은 α-MEM 완전 배지로 배양하였다.

  1. 골형성 분화를 수행합니다.
    1. 6웰 플레이트에 웰당 1 × 105 JBMMSC를 접종합니다.
    2. 세포 합류도가 70%에 도달하면 배지를 골형성 유도 배지로 변경합니다.
      알림: 골형성 유도 매체는 3일마다 교체하십시오.
    3. 골형성 유도 7일 후 ALP(Alkaline Phosphatase) 염색을 수행합니다.
    4. 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
    5. ALP 염색 용액으로 실온에서 30분 동안 세포를 염색하고 빛으로부터 보호합니다.
    6. 염색 용액이 남지 않을 때까지 세포를 헹구고 현미경으로 샘플을 관찰합니다.
    7. 골형성 유도 21일 후 Alizarin 적색 염색을 수행합니다.
    8. 5분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 후 Alizarin 빨간색 염색액으로 세포를 30분 동안 염색합니다.
    9. Alizarin red 염색 용액이 남지 않을 때까지 PBS로 세포를 세척합니다.
    10. 현미경으로 칼슘 결절의 수를 관찰합니다.
  2. 지방 분화를 수행합니다.
    1. 6웰 플레이트에 웰당 1 × 105 JBMMSC를 접종합니다.
    2. 세포 합류가 70%에 도달하면 배지를 지방 유도 매체로 변경합니다.
      알림: 지방 유도 매체는 3일마다 교체하십시오.
    3. 지방 유도 14일 후 Oil red O 염색을 수행합니다.
    4. 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 Oil red O 고정 용액으로 셀을 20-30분 동안 고정한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
    5. 정착액을 제거하고 증류수로 세포를 두 번 세척합니다.
    6. 세포를 60% 이소프로판올에 20-30초 동안 담그십시오.
    7. 60% 이소프로판올을 제거하고 20-30분 동안 Oil red O 염색으로 세포를 염색합니다.
    8. 염색 용액을 제거하고 60% 이소프로판올로 20-30초 동안 세포를 헹구고 증류수로 세척합니다.
    9. 1-2분 동안 헤마톡실린 용액으로 핵을 염색합니다.
    10. 헤마톡실린 용액을 제거하고 증류수로 세포를 2-3회 세척합니다. 오일 레드 O 버퍼를 1분 동안 넣고 제거합니다.
    11. 현미경으로 지질 방울의 수를 관찰합니다.
  3. 연골 형성 분화를 수행합니다.
    1. 6웰 플레이트에 웰당 1 × 105 JBMMSC를 접종합니다.
    2. 세포 합류도가 70%에 도달하면 배지를 연골 유도 배지로 변경합니다.
      알림: 연골 유도 매체는 3일마다 교체하십시오.
    3. 연골 유도 21일 후 Alcian blue 염색을 수행합니다.
    4. 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
    5. 37°C에서 1시간 동안 Alcian blue 염색으로 세포를 염색합니다.
    6. 염색 용액이 남지 않을 때까지 세포를 헹구고 현미경으로 관찰합니다.

7. Real-time PCR

  1. RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하고 효소 마커로 RNA 농도를 측정합니다(제조업체의 지침에 따름).
  2. 500ng의 RNA19를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
  3. 1 μL의 cDNA, 3.5 μL의 이중 증류수, 5 μL의 SYBR 및 0.5 μL의 프라이머 믹스(0.1 μM)를 포함하는 10 μL의 qRT-PCR 혼합물을 사용하여 실시간 시스템에서 qRT-PCR을 수행합니다.
    참고: 프라이머 염기서열은 표 1에 나열되어 있습니다. 열 순환 조건은 다음과 같습니다: 2분 동안 50°C, 2분 동안 95°C, 15초 동안 95°C, 2분 동안 60°C의 40회 사이클, 그리고 용융 곡선에 대해 60°C에서 95°C까지 5초 동안 0.5°C씩 증가합니다.
  4. GAPDH를 내부 통제로 사용16.

결과

72시간의 세포 접종 후, 대부분의 세포는 부유하고 둥근 모양이었으며 벽에 부착된 세포는 거의 없었습니다(그림 1B). 5일째 되는 날에는 부착성 세포 콜로니가 나타나 방추체 또는 섬유아세포와 같은 모양을 나타냈습니다(그림 1C). 7일째 되는 날, 부착 세포는 90%의 밀도에 도달하여 소수의 간헐적 부유 세포가 있는 "물고기 학교" 모양을 형성했습니다(

토론

골수 중간엽 줄기 세포(BMMSC)는 골수에 존재하는 비조혈 줄기 세포의 하위 집합을 나타내며, 자가 재생 능력, 다방향 분화 가능성 및 조혈 지원 기능을 특징으로 합니다. 이 세포는 조직 재생, 혈관 형성 및 세포 활동 조절과 같은 다양한 생리적 과정에서 중추적인 역할을 합니다20. 결과적으로, BMMSC는 조직 복구 및 재생 공학에서 최적의 종자 세포 공급원으로 자주 활용됩니다

공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 군사위원회 군수국의 건강 관리 프로젝트(19BJZ22), 베이징 자연과학 재단(7232154) 및 Fourth Mil Med Univ. 임상 연구 프로젝트(2021XB025)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin Red S Solution 0.2%SolarbioG1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time SystemBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Cell culture dish 10 cmCorning353003
CentrifugeEppendorf5810R
Centrifuge Tube 15 mL Corning430790
Centrifuge Tube 50 mL Corning430828
CO2 incubatorThermo Fisher3111
Constant-temperature oscillatorShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Fetal bovine serumBI04-001-1ACS
Flow cytometerBDFACS C6 
Inverted phase-contrast microscopeOlympusCKX41 
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit OricellRAXMX-09011
Multifunctional microplate reader BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldehyde 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penicillin-streptomycin 0.25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT Master Mix TakaraRR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kitOricellRAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kitOricellRAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kitOricellRAXMD-90021
RNA extraction kitTIANGENDP419
Super-clean benchBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%MACGENECC012
Type II collagenaseSolarbioC8150
Wistar ratBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium GibcoC12571500BT

참고문헌

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