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Resumo

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Resumo

As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) são um tipo de célula-tronco com potencial de diferenciação multidirecional. Em comparação com as BMMSCs derivadas de ossos apendiculares, as BMMSCs derivadas da mandíbula têm maior capacidade de diferenciação proliferativa e osteogênica, tornando-se gradualmente células sementes importantes para o reparo de defeitos da mandíbula. No entanto, a mandíbula tem uma estrutura óssea complexa e menos conteúdo esponjoso do que os ossos apendiculares. É difícil adquirir um grande número de células-tronco mesenquimais derivadas da medula da mandíbula de alta qualidade usando métodos tradicionais. Este estudo apresenta uma 'abordagem baseada em nicho sobre stemness' para isolar e cultivar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula de rato (JBMMSCs). JBMMSCs primárias de ratos foram isoladas e cultivadas usando o método aderente à medula óssea total combinado com o método de digestão de fatias ósseas. As células isoladas foram identificadas como JBMMSCs por meio de observação da morfologia celular, detecção de marcadores de superfície celular e indução de diferenciação multidirecional. As células extraídas por este método exibem uma forma de fuso 'semelhante a fibroblastos'. As células são longas, fusiformes e semelhantes a fibroblastos. A análise por citometria de fluxo mostra que essas células são positivas para CD29, CD44 e CD90, mas negativas para CD11b/c, CD34 e CD45, o que é congruente com as características das BMMSCs. As células apresentam forte capacidade de proliferação e podem sofrer diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Este estudo fornece um método eficaz e estável para obter JBMMSCs de alta qualidade suficientes com forte capacidade de diferenciação em um curto espaço de tempo, o que pode facilitar estudos adicionais sobre a exploração da função biológica, medicina regenerativa e aplicações clínicas relacionadas.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descobertas pela primeira vez na medula óssea, que mostraram a capacidade de formar colônias adesivas em cultura e forte potencial osteogênico1. Pittinger et al.2 encontraram ainda seu potencial de diferenciação multidirecional em relação a ossos, gordura e cartilagem. Embora todas as células-tronco mesenquimais de diferentes fontes tenham potencial para diferenciação multidirecional, as células-tronco mesenquimais da medula óssea têm o maior potencial de diferenciação condrogênica em comparação com as células-tronco mesenquimais derivadas de outros tecidos, tornando-as consideradas as melhores células candidatas para engenharia de tecido ósseo3. No entanto, muitos estudos comprovaram que as BMMSCs de diferentes origens apresentam características e propriedades específicas do local, como capacidade de diferenciação osteogênica e atividade proliferativa celular 4,5. Isso pode ser devido a diferentes camadas germinativas entre a mandíbula e os ossos apendiculares ou a crista ilíaca6.

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula (JBMMSCs) surgem das células da crista neural do neuroectoderma, enquanto as BMMSCs derivadas do fêmur se originam do mesoderma7. Em comparação com as BMMSCs derivadas de ossos longos e da crista ilíaca, as JBMMSCs têm maior taxa de proliferação, atividade de ALP e potencial osteogênico8. Além disso, o efeito de aplicação de BMMSCs em tecidos e órgãos pode variar dependendo de diferentes tipos de células e ambientes9. O reparo de defeitos da mandíbula depende principalmente do recrutamento de células-tronco mesenquimais derivadas da mandíbula. Portanto, o estudo de JBMMSCs pode fornecer uma base experimental para sua aplicação clínica na engenharia de tecidos ósseos da mandíbula10. No entanto, a pesquisa básica e as aplicações clínicas concentram-se principalmente nas BMMSCs derivadas de ossos apendiculares e axiais11. A pesquisa sobre JBMMSCs é limitada, e isso pode ser devido ao baixo teor de osso esponjoso na mandíbula e ao fato de que as mandíbulas dos ratos têm ainda menos conteúdo ósseo esponjoso12. Portanto, é difícil separar as células-tronco mesenquimais derivadas do osso maxilar usando o método comum de lavagem da medula óssea, que é comumente usado no isolamento de BMMSCs dos ossos apendiculares ou da crista ilíaca13. Com base nos métodos de Hong et al.14 e Cheng et al.15, levantamos a hipótese de que a combinação de digestão óssea densa e o método de lavagem da medula óssea poderia isolar eficientemente JBMMSCs de ratos.

Este estudo tem como objetivo estabelecer um método eficiente para isolar JBMMSCs de ratos e fornecer fontes de células-semente suficientes para a engenharia do tecido ósseo da mandíbula.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Hospital Geral do PLA Chinês. Ratos Wistar machos de treze semanas de idade foram usados para o experimento. Detalhes sobre os animais, reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

  1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo tesouras oftálmicas, pinças e rongeurs ósseos, em alta temperatura e pressão.
  2. Prepare os meios de cultura com antecedência.
    1. Prepare α-MEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
    2. Prepare colagenase tipo II a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    3. Prepare 50 mL de PBS com penicilina-estreptomicina a 1% em um tubo de centrífuga estéril descartável de 50 mL.

2. Isolamento e cultivo de JBMMSCs de ratos

  1. Isole a mandíbula do rato seguindo as etapas abaixo:
    NOTA: Para manter a esterilidade da amostra, todos os instrumentos cirúrgicos de metal devem ser desinfetados em alta temperatura em uma chama de lâmpada de álcool por pelo menos três segundos antes do uso.
    1. Anestesiar o rato com pentobarbital sódico a 2% (2 mL/kg) por injeção intraperitoneal.
    2. Sacrifique o rato anestesiado por luxação das vértebras cervicais (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) depois que sua frequência respiratória diminuir e os músculos relaxarem completamente.
    3. Mergulhe o rato em etanol a 75% por 30 min para desinfetá-lo e depois transfira-o para a mesa ultralimpa.
    4. Coloque o rato em um pano estéril descartável ou em um recipiente estéril e mantenha-o em decúbito dorsal.
    5. Corte e separe a pele e o músculo do ângulo da boca até a articulação ao longo do ramo e, em seguida, separe o côndilo da fossa glenoidal cortando o disco da articulação temporomandibular e os ligamentos periféricos bilaterais horizontalmente com tesoura oftálmica.
      NOTA: Determine a posição da articulação temporomandibular movendo a mandíbula e observando a posição do côndilo externamente.
    6. Corte e separe os músculos e tecidos conjuntivos da mandíbula lateral usando uma tesoura do sulco vestibular no lado vestibular dos incisivos inferiores para os lados esquerdo e direito.
    7. Incise os músculos linguais da mandíbula do frênulo lingual até a região posterior da mandíbula.
    8. Remova a mandíbula do crânio.
    9. Divida a mandíbula em metades cortando a sínfise entre os incisivos inferiores com uma tesoura oftálmica.
    10. Remova os músculos restantes, fáscia e outros tecidos moles da mandíbula cuidadosamente usando tesouras oftálmicas e pinças.
  2. Isole JBMMSCs.
    1. Coloque o bico do rongeur na junção dos incisivos e da parte mesial do primeiro molar, corte a conexão entre os incisivos inferiores e a mandíbula com o rongeur e extraia completamente os incisivos inferiores.
    2. Remova todos os molares com um rongeur ósseo.
    3. Remova o ramo mandibular com um rongeur ósseo e exponha a cavidade medular separando a parte central da mandíbula ao longo da borda distal do último molar16.
    4. Chupar α-MEM meio completo com uma seringa estéril descartável de 1 ml. Insira a agulha na cavidade da medula óssea e lave a medula óssea repetidamente na placa de cultura com meio completo α-MEM até que o osso fique branco.
    5. Colete a solução de lavagem da medula óssea em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue-o a 800 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    6. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender as células com 10 ml de meio completo de α-MEM e colocá-las numa nova placa de cultura de 10 cm.
    7. Divida a mandíbula lavada em fatias de osso de 1-3 mm³ com um rongeur e digeri-las com 3 mL de colagenase tipo II a 0,1% por 90 min em um agitador de 200 rpm / min a 37 ° C.
    8. Centrifugue a mandíbula digerida a 800 x g por 3 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
    9. Cultivar as células colhidas e as fatias de osso digeridas com meio completo de α-MEM a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 .
    10. Troque metade do meio de cultura por meio fresco após 72 h e, em seguida, troque-o completamente a cada 2 dias.
      NOTA: Não mova a placa de cultura nos primeiros três dias.
    11. Passe as células aderentes na proporção de 1:2 quando atingirem 80%-90% de confluência. Remova as fatias de osso durante a segunda subcultura. Use as células das gerações P2 ou P3 para experimentos.

3. Citometria de fluxo para identificação de marcadores de superfície celular

  1. Ressuspenda JBMMSCs da geração P2 em tampão de citometria de fluxo. Conte as células usando um contador de células automatizado e ajuste a concentração para 3 × 106 células/mL.
  2. Adicione 100 μL de suspensão celular e 2 μL de anticorpos monoclonais (CD11b / c, CD29, CD34, CD44, CD45 e CD90) a cada tubo de microcentrífuga. Incubar durante 30 min a 4 °C17,18.
  3. Lave a amostra duas vezes com 200 μL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue-a por 5 min a 250 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante.
  4. Adicione 100 μL de tampão de citometria de fluxo e 2 μL de anticorpo secundário fluorescente marcado com PE a cada tubo. Incubar a 4 °C durante 30 min.
  5. Repita a etapa 3.3.
  6. Ressuspenda JBMMSCs em 300-500 μL de tampão de citometria de fluxo por tubo.
  7. Efectuar a análise por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo.
    NOTA: Use anticorpos homólogos como controles negativos para eliminar a coloração de fundo causada pela combinação inespecífica de anticorpos.

4. Determinação da proliferação celular

  1. Semear JBMMSCs da geração P3 em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5 × 103 células por poço.
  2. Adicione 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço.
  3. Coloque a placa de 96 poços na incubadora por 2 h e meça a absorbância (valor OD a 450 nm) usando um leitor de microplacas.
    NOTA: Realize o teste no mesmo horário todos os dias por sete dias consecutivos.

5. Capacidade de formação de colônias

  1. Semear 1000 JBMMSCs da passagem 3 para placas de cultura de 10 cm e cultura a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Troque o meio de cultura a cada 3 dias.
  3. Realize a coloração violeta de cristal após cultivo contínuo por 15 dias.
  4. Em seguida, fixe as células com metanol por 5 min e pinte com 2% de cristal violeta por 5 min.

6. Diferenciação multilinhagem de JBMMSCs

NOTA: Use JBMMSCs de geração P3 para diferenciação de várias linhagens. O grupo controle foi cultivado com meio completo de α-MEM.

  1. Realizar diferenciação osteogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por poço em uma placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução osteogênica.
      NOTA: Troque o meio de indução osteogênica a cada 3 dias.
    3. Realize a coloração com fosfatase alcalina (ALP) após 7 dias de indução osteogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Pinte as células com solução de coloração ALP à temperatura ambiente por 30 min e proteja-as da luz.
    6. Enxágue as células até que não haja mais solução de coloração e observe as amostras ao microscópio.
    7. Realize a coloração com vermelho de alizarina após 21 dias de indução osteogênica.
    8. Manchar as células com solução de coloração vermelha de alizarina por 5 min após fixar as células com paraformaldeído a 4% por 30 min.
    9. Lave as células com PBS até que não haja solução de coloração vermelha de alizarina.
    10. Observe o número de nódulos de cálcio ao microscópio.
  2. Realizar diferenciação adipogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por alvéolo numa placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução adipogênico.
      NOTA: Troque o meio de indução adipogénica de três em três dias.
    3. Realize a coloração Oil red O após 14 dias de indução adipogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com solução fixadora de óleo vermelho O por 20-30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Remova a solução de fixação e lave as células com água destilada duas vezes.
    6. Mergulhe as células em isopropanol a 60% por 20-30 s.
    7. Remova o isopropanol 60% e core as células com coloração Oil red O por 20-30 min.
    8. Remova a solução de coloração, enxágue as células com isopropanol a 60% por 20-30 s e lave-as com água destilada.
    9. Manchar o núcleo com solução de hematoxilina por 1-2 min.
    10. Remova a solução de hematoxilina e lave as células 2-3 vezes com água destilada. Adicione o tampão Oil Red O por 1 min e remova-o.
    11. Observe o número de gotículas lipídicas ao microscópio.
  3. Realize a diferenciação condrogênica.
    1. Inocular 1 × 105 JBMMSCs por alvéolo numa placa de seis poços.
    2. Quando a confluência celular atingir 70%, troque o meio por meio de indução condrogênico.
      NOTA: Troque o meio de indução condrogênico a cada 3 dias.
    3. Realize a coloração com azul de Alcian após 21 dias de indução condrogênica.
    4. Remova o meio da placa de seis poços, fixe as células com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 30 min e depois lave-as com PBS três vezes.
    5. Manchar as células com coloração azul de Alcian a 37 °C durante 1 h.
    6. Enxágue as células até que não haja mais solução de coloração e observe-as ao microscópio.

7. PCR em tempo real

  1. Extraia o RNA total usando o kit de extração de RNA e meça a concentração de RNA com um marcador enzimático (seguindo as instruções do fabricante).
  2. Sintetizar cDNA usando 500 ng de RNA19.
  3. Realize qRT-PCR em um sistema em tempo real com 10 μL de mistura qRT-PCR contendo 1 μL de cDNA, 3,5 μL de água bidestilada
    NOTA: As sequências de primers estão listadas na Tabela 1. As condições de ciclagem térmica são as seguintes: 50 °C por 2 min, 95 °C por 2 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 2 min e, em seguida, incrementos de 0,5 °C por 5 s de 60 °C a 95 °C para a curva de fusão.
  4. Use o GAPDH como um controle interno16.

Resultados

Após 72 h de inoculação celular, a maioria das células estava suspensa e de formato redondo, com muito poucas aderidas à parede (Figura 1B). No quinto dia, surgiram colônias de células aderentes, exibindo fusos ou formas semelhantes a fibroblastos (Figura 1C). No sétimo dia, as células aderentes atingiram 90% de confluência, formando uma forma de "cardume de peixes" com um pequeno número de células suspensas intermitentes (Figura...

Discussão

As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSCs) representam um subconjunto de células-tronco não hematopoiéticas que residem na medula óssea, caracterizadas por suas capacidades de auto-renovação, potencial de diferenciação multidirecional e funções de suporte para hematopoiese. Essas células desempenham papéis fundamentais em vários processos fisiológicos, como regeneração tecidual, angiogênese e regulação das atividades celulares20. Consequentemente, as BMMSCs são f...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelos Projetos de Saúde do Departamento de Logística da Comissão Militar (19BJZ22), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7232154) e Fourth Mil Med Univ. projetos de pesquisa clínica (2021XB025).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin Red S Solution 0.2%SolarbioG1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time SystemBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Cell culture dish 10 cmCorning353003
CentrifugeEppendorf5810R
Centrifuge Tube 15 mL Corning430790
Centrifuge Tube 50 mL Corning430828
CO2 incubatorThermo Fisher3111
Constant-temperature oscillatorShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Fetal bovine serumBI04-001-1ACS
Flow cytometerBDFACS C6 
Inverted phase-contrast microscopeOlympusCKX41 
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit OricellRAXMX-09011
Multifunctional microplate reader BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldehyde 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penicillin-streptomycin 0.25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT Master Mix TakaraRR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kitOricellRAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kitOricellRAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kitOricellRAXMD-90021
RNA extraction kitTIANGENDP419
Super-clean benchBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%MACGENECC012
Type II collagenaseSolarbioC8150
Wistar ratBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium GibcoC12571500BT

Referências

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