טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה

Summary

לתאי גזע מזנכימליים ממח עצם הלסת תפקידים משמעותיים בהתמיינות מגוונת, התחדשות עצמית ומודולציה חיסונית. הם התגלו כמאגר חיוני של תאים מקדימים בריפוי גנטי, הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. כאן אנו מציגים שיטה ייחודית לבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת בחולדות.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים ממח עצם (BMMSCs) הם סוג של תאי גזע בעלי פוטנציאל התמיינות רב-כיווני. בהשוואה ל- BMMSCs שמקורם בעצמות התוספתן, BMMSCs שמקורם בלסת הם בעלי יכולת שגשוג והתמיינות אוסטאוגנית גבוהה יותר, והופכים בהדרגה לתאי זרע חשובים לתיקון פגמים בלסת. עם זאת, הלסת התחתונה יש מבנה גרמי מורכב תוכן ביטול פחות מאשר עצמות appendicular. קשה לרכוש מספר רב של תאי גזע מזנכימליים באיכות גבוהה שמקורם במח הלסת בשיטות מסורתיות. מחקר זה מציג "גישה מבוססת נישה על גזעיות" לבידוד וטיפוח תאי גזע מזנכימליים של מח עצם בלסת חולדה (JBMMSCs). חולדות ראשוניות בודדו ותורבתו בשיטת הדבקת מח עצם שלמה בשילוב עם שיטת עיכול פרוסות העצם. התאים שבודדו זוהו כ-JBMMSCs באמצעות תצפית במורפולוגיה של התא, גילוי סמני פני התא והשראת התמיינות רב-כיוונית. התאים המופקים בשיטה זו מציגים צורת ציר 'דמוית פיברובלסט'. התאים ארוכים, דמויי ציר ודמויי פיברובלסט. ניתוח ציטומטריית הזרימה מראה כי תאים אלה חיוביים עבור CD29, CD44 ו- CD90 אך שליליים עבור CD11b/c, CD34 ו- CD45, אשר תואם את מאפייני BMMSC. התאים מראים יכולת התרבות חזקה ויכולים לעבור התמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית. מחקר זה מספק שיטה יעילה ויציבה להשגת מספיק JBMMSCs באיכות גבוהה עם יכולת בידול חזקה בזמן קצר, אשר יכול להקל על מחקרים נוספים של חקר תפקוד ביולוגי, רפואה רגנרטיבית, ויישומים קליניים קשורים.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) התגלו לראשונה במוח העצם, אשר הראו יכולת ליצור מושבות דבק בתרבית ופוטנציאל אוסטאוגני חזק¹. Pittinger et ^al.2 מצאו גם את פוטנציאל ההתמיינות הרב-כיווני שלהם לכיוון עצמות, שומן וסחוס. למרות שלכל תאי הגזע המזנכימליים ממקורות שונים יש פוטנציאל להתמיינות רב-כיוונית, לתאי גזע מזנכימליים ממח עצם יש את פוטנציאל ההתמיינות הכונדרוגני החזק ביותר בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמות אחרות, מה שהופך אותם לתאים המועמדים הטובים ביותר להנדסת רקמת עצם³. עם זאת, מחקרים רבים הוכיחו כי BMMSCs ממקורות שונים מציגים מאפיינים ותכונות ספציפיים לאתר כגון יכולת התמיינות אוסטאוגנית ופעילות שגשוג תאית ^4,5. זה יכול להיות בגלל שכבות נבט שונות בין הלסת לבין עצמות התוספתן או הפסגה iliac⁶.

תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת (JBMMSCs) נובעים מתאי הפסגה העצבית של הנוירואקטודרם (neuroectoderm), בעוד שתאי BMMSC שמקורם בשריר הירך מקורם במזודרם⁷. בהשוואה ל-BMMSCs שמקורם בעצמות ארוכות ובפסגה האיליאקית, ל-JBMMSCs יש שיעור התרבות גבוה יותר, פעילות ALP ופוטנציאל אוסטאוגני⁸. חוץ מזה, השפעת היישום של BMMSCs ברקמות ובאיברים עשויה להשתנות בהתאם לסוגי תאים שונים וסביבות⁹. תיקון פגמים בלסת תלוי בעיקר בגיוס תאי גזע מזנכימליים שמקורם בלסת. לכן, חקר JBMMSCs יכול לספק בסיס ניסיוני ליישומו הקליני בהנדסת רקמת עצם הלסת¹⁰. עם זאת, המחקר הבסיסי והיישומים הקליניים מתמקדים בעיקר ב- BMMSCs שמקורם בעצמות התוספתן והצירי¹¹. המחקר על JBMMSCs מוגבל, וזה יכול להיות בגלל התוכן הנמוך של עצם ביטול בלסת התחתונה והעובדה כי לסתות של חולדות יש אפילו פחות ביטול^{עצם 12}. לכן, קשה להפריד תאי גזע מזנכימליים שמקורם בעצם הלסת באמצעות שיטת שטיפת מח העצם הרגילה, המשמשת בדרך כלל לבידוד BMMSCs מעצמות התוספתן או מסמל האיליאק¹³. בהתבסס על השיטות של Hong et ^al.14 ו- Cheng et ^al.15, שיערנו כי השילוב של עיכול עצם צפוף ושיטת שטיפת מח העצם יכול לבודד ביעילות JBMMSCs חולדות.

מחקר זה נועד לבסס שיטה יעילה לבידוד JBMMSCs של חולדות ולספק מקורות תאי זרע מספיקים להנדסת רקמת עצם הלסת.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים בבית החולים הכללי של ה-PLA הסיני. חולדות וויסטאר זכרים בני שלושה עשר שבועות שימשו לניסוי. פרטים על בעלי החיים, הריאגנטים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

1. יש לעקר את כל כלי הניתוח, כולל מספריים אופתלמיים, פינצטה ורונג'ורים לעצמות, בטמפרטורה ולחץ גבוהים.
2. הכינו מראש את מדיית התרבות.
   1. הכינו מדיום מלא α-MEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. הכינו 0.1% קולגנאז מסוג II במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   3. הכינו 50 מ"ל PBS עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין בצינור צנטריפוגה סטרילי חד פעמי של 50 מ"ל.

2. בידוד וטיפוח חולדות JBMMSCs

1. בודדו את לסת החולדה לפי השלבים הבאים:
   הערה: כדי לשמור על סטריליות הדגימה, יש לחטא את כל כלי הניתוח ממתכת בטמפרטורה גבוהה על להבת מנורת אלכוהול לפחות שלוש שניות לפני השימוש.
   1. מרדימים את החולדה עם 2% נתרן pentobarbital (2 מ"ל / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal.
   2. הקריבו את החולדה המורדמת על ידי פריקת חוליות צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) לאחר שקצב הנשימה שלה יורד והשרירים נרגעים לחלוטין.
   3. טבלו את החולדה באתנול 75% למשך 30 דקות כדי לחטא אותה ואז העבירו אותה לשולחן נקי במיוחד.
   4. הניחו את החולדה על מטלית סטרילית חד פעמית או במיכל סטרילי ושמרו אותה במצב שכיבה.
   5. חותכים ומפרידים את העור והשריר מהאנגולוס אוריס למפרק לאורך הרמוס, ולאחר מכן מפרידים את הקונדיל מהפוסה הגלנואידית על ידי חיתוך דיסק המפרק הרקתי והרצועות ההיקפיות הדו-צדדיות אופקית עם מספריים אופתלמיים.
      הערה: לקבוע את המיקום של המפרק temporomandibular על ידי הזזת הלסת התחתונה והתבוננות במיקום של קונדיל חיצונית.
   6. חותכים ומפרידים את השרירים ורקמות החיבור של הלסת התחתונה הצידית באמצעות מספריים מחריץ שיווי המשקל בצד הבוקאלי של החותכות התחתונות לצד שמאל וימין.
   7. חותכים את השרירים הלשוניים של הלסת התחתונה מהפרנום הלשוני לאזור האחורי של הלסת התחתונה.
   8. הסר את הלסת התחתונה מהגולגולת.
   9. מחלקים את הלסת התחתונה לחצאים על ידי חיתוך הסימפיזיס בין החותכות התחתונות עם מספריים אופתלמיים.
   10. הסר את השרירים המחוברים הנותרים, הפאשיה ורקמות רכות אחרות על הלסת התחתונה בזהירות באמצעות מספריים ומלקחיים אופתלמיים.
2. בודד JBMMSCs.
   1. מניחים את המקור של הרונגר בצומת של החותכות והחלק המזיאלי של הטוחנת הראשונה, מנתקים את הקשר בין החותכות התחתונות ללסת התחתונה עם הרונגר, ומחלצים את החותכות התחתונות לחלוטין.
   2. הסר את כל הטוחנות עם רונגור עצם.
   3. הסר את הרמוס המנדיבולרי עם רונגור עצם וחשף את חלל המח על ידי הפרדת החלק המרכזי של הלסת לאורך הקצה הדיסטלי של הטוחנת האחרונה¹⁶.
   4. למצוץ α-MEM מדיום שלם עם מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"ל. הכניסו את המחט לחלל מח העצם ושטפו את מח העצם שוב ושוב לתוך צלחת התרבית עם מדיום מלא α-MEM עד שהעצם הופכת לבנה.
   5. אספו את תמיסת שטיפת מח העצם לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה אותה במהירות של 800 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את התאים עם 10 מ"ל של מדיום שלם α-MEM, והכניסו אותם לצלחת תרבית חדשה בקוטר 10 ס"מ.
   7. מחלקים את הלסת התחתונה הסמוקה לפרוסות עצם של 1-3 מ"מ מ"ק עם רונגור ומעכלים אותן עם 3 מ"ל של 0.1% collagenase מסוג II למשך 90 דקות בשייקר של 200 סל"ד לדקה ב-37°C.
   8. צנטריפוגה את הלסת המעוכלת ב 800 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.
   9. תרבית את התאים שנקטפו ואת פרוסות העצם המעוכלת בתווך מלא α-MEM ב-37°C באינקובטור לח של 5% CO₂ .
   10. שנה חצי ממדיום התרבית במדיום טרי לאחר 72 שעות ולאחר מכן שנה אותו לחלוטין כל יומיים.
       הערה: אין להזיז את מנת התרבית במשך שלושת הימים הראשונים.
   11. עוברים את התאים הדבקים ביחס של 1:2 כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-90%. מוציאים פרוסות עצם במהלך תת-התרבות השנייה. השתמש בתאים של דורות P2 או P3 לניסויים.

3. ציטומטריית זרימה לזיהוי סמני פני התא

1. השהה מחדש JBMMSCs מדור P2 במאגר ציטומטריית זרימה. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי והתאם את הריכוז ל 3 × 10⁶ תאים / מ"ל.
2. הוסף 100 μL של תרחיף תאים ו 2 μL של נוגדנים חד שבטיים (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 ו- CD90) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. יש לדגור במשך 30 דקות ב-4°C^17,18.
3. שטפו את הדגימה פעמיים עם 200 מיקרוליטר של חיץ ציטומטריית זרימה וצנטריפוגו אותה למשך 5 דקות ב 250 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant.
4. הוסף 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה ו- 2 μL של נוגדן פלואורסצנטי משני המסומן בתווית PE לכל צינור. יש לדגור ב-4°C למשך 30 דקות.
5. חזור על שלב 3.3.
6. השהה מחדש JBMMSCs ב 300-500 μL של חיץ ציטומטריית זרימה לכל צינור.
7. בצע את הניתוח הציטומטרי של הזרימה באמצעות ציטומטר זרימה.
   הערה: השתמש בנוגדנים הומולוגיים כבקרות שליליות כדי למנוע כתמי רקע הנגרמים על-ידי שילוב לא ספציפי של נוגדנים.

4. קביעת התפשטות תאים

1. זרע JBMMSCs של דור P3 לתוך צלחת 96 באר בצפיפות של 5 × 10³ תאים לכל באר.
2. הוסף 10 μL של תמיסת CCK-8 לכל באר.
3. הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות באינקובטור למשך שעתיים ומדדו את הספיגה (ערך OD ב-450 ננומטר) באמצעות קורא מיקרו-לוחות.
   הערה: בצע את הבדיקה באותה שעה בכל יום במשך שבעה ימים רצופים.

5. יכולת היווצרות מושבה

1. זרעו 1000 JBMMSCs ממעבר 3 ל-10 ס"מ כלי תרבית ותרבות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
2. שנה את מדיום התרבות כל 3 ימים.
3. בצע צביעה סגולה קריסטלית לאחר טיפוח מתמשך במשך 15 ימים.
4. לאחר מכן, לתקן את התאים עם מתנול במשך 5 דקות וכתם עם 2% סגול קריסטל במשך 5 דקות.

6. הבחנה מרובת שושלות של JBMMSCs

הערה: השתמש בקובצי JBMMSC מדור P3 לבידול בין שושלות מרובות. קבוצת הביקורת תורבתה עם מדיום מלא של α-MEM.

1. בצע התמיינות אוסטאוגנית.
   1. חסן 1 × 10⁵ JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
   2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את התווך למדיום אינדוקציה אוסטאוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראה האוסטאוגנית כל 3 ימים.
   3. בצע צביעה אלקליין פוספטאז (ALP) לאחר 7 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית.
   4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
   5. צבעו את התאים בתמיסת צביעת ALP בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות והגנו עליהם מפני אור.
   6. שוטפים את התאים עד שלא נשארת תמיסת צביעה, ומתבוננים בדגימות תחת מיקרוסקופ.
   7. בצע צביעה אדומה Alizarin לאחר 21 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית.
   8. הכתימו את התאים בתמיסת צביעה אדומה אליזרין למשך 5 דקות לאחר קיבוע התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות.
   9. שטפו את התאים עם PBS עד שלא תישאר תמיסת צביעה אדומה של אליזרין.
   10. שימו לב למספר גושי הסידן תחת מיקרוסקופ.
2. בצע בידול אדיפוגני.
   1. חסן 1 × 10⁵ JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
   2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את המדיום למדיום אינדוקציה אדיפוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראות האידיפוגניות כל שלושה ימים.
   3. יש לבצע צביעת שמן אדום O לאחר 14 יום של אינדוקציה אדיפוגנית.
   4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם שמן אדום O פתרון תיקון במשך 20-30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
   5. הסר את תמיסת התיקון ושטוף את התאים במים מזוקקים פעמיים.
   6. לטבול את התאים 60% isopropanol במשך 20-30 שניות.
   7. יש להסיר 60% איזופרופנול ולהכתים את התאים בשמן אדום O מכתים למשך 20-30 דקות.
   8. הסר את תמיסת הצביעה, לשטוף את התאים עם 60% isopropanol במשך 20-30 s, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים מזוקקים.
   9. מכתימים את הגרעין בתמיסת המטוקסילין למשך 1-2 דקות.
   10. הסר את תמיסת hematoxylin ולשטוף את התאים 2-3 פעמים עם מים מזוקקים. מוסיפים חיץ O אדום שמן למשך דקה אחת ומסירים אותו.
   11. שימו לב למספר טיפות השומנים תחת מיקרוסקופ.
3. בצע התמיינות כונדרוגנית.
   1. חסן 1 × 10⁵ JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
   2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את מדיום האינדוקציה הבינוני לכונדרוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראות הכונדרוגניות כל 3 ימים.
   3. יש לבצע צביעה כחולה לאחר 21 יום של השראת כונדרוגני.
   4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
   5. לצבוע את התאים עם צביעה כחולה Alcian ב 37 ° C במשך 1 שעה.
   6. שוטפים את התאים עד שלא נשארת תמיסת צביעה, ומתבוננים בהם תחת מיקרוסקופ.

7. PCR בזמן אמת

1. יש לחלץ את סך הרנ"א באמצעות ערכת מיצוי ה-RNA ולמדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות סמן אנזים (בהתאם להוראות היצרן).
2. סנתז cDNA באמצעות 500 ng של RNA¹⁹.
3. בצע qRT-PCR במערכת בזמן אמת עם 10 μL של תערובת qRT-PCR המכילה 1 μL של cDNA, 3.5 μLof מים מזוקקים כפול, 5 μL של SYBR, ו 0.5 μL של תערובת פריימר (0.1 μM).
   הערה: רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1. תנאי המחזור התרמי הם כדלקמן: 50 ° C במשך 2 דקות, 95 ° C במשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° C במשך 15 שניות, 60 ° C במשך 2 דקות, ולאחר מכן מרווחים של 0.5 ° C עבור 5 s מ 60 ° C ל 95 ° C עבור עקומת ההתכה.
4. השתמש ב- GAPDH כבקרה פנימית¹⁶.

תוצאות

לאחר 72 שעות של חיסון תאים, רוב התאים היו מרחפים ועגולים בצורתם, ומעט מאוד נדבקו לקיר (איור 1B). ביום החמישי הופיעו מושבות תאים דבקים, שהציגו צירים או צורות דמויות פיברובלסטים (איור 1C). ביום השביעי, תאים דבקים הגיעו למפגש של 90%, ויצרו צורת "אסכולת דגים" עם מספר קטן...

Discussion

תאי גזע מזנכימליים ממח עצם (BMMSCs) מייצגים תת-קבוצה של תאי גזע לא המטופויטיים השוכנים במח העצם, המאופיינים ביכולות ההתחדשות העצמית שלהם, פוטנציאל התמיינות רב-כיווני ופונקציות תומכות להמטופויזה. תאים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים בתהליכים פיזיולוגיים שונים כגון התחדשות רקמות, אנגיוגנזה וויסו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin Red S Solution 0.2%	Solarbio	G1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime	C3206
Bio-Rad CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
CCK8 Kit	Dujindo	CK04
Cell culture dish 10 cm	Corning	353003
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge Tube 15 mL	Corning	430790
Centrifuge Tube 50 mL	Corning	430828
CO2 incubator	Thermo Fisher	3111
Constant-temperature oscillator	Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.	ZWY-100H
Fetal bovine serum	BI	04-001-1ACS
Flow cytometer	BD	FACS C6
Inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Mesenchymal Stem Cell (Rat) Surface marker Detection Kit	Oricell	RAXMX-09011
Multifunctional microplate reader	BioTek	Synergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain Kit	Solarbio	G1262
Paraformaldehyde 4%	Solarbio	P1110
PBS	MACGENE	CC008
penicillin-streptomycin 0.25%	MACGENE	CC004
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher	A25742
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90031
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Chondrogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMX-90041
Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation kit	Oricell	RAXMD-90021
RNA extraction kit	TIANGEN	DP419
Super-clean bench	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.	KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%	MACGENE	CC012
Type II collagenase	Solarbio	C8150
Wistar rat	Beijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM culture medium	Gibco	C12571500BT