裂解荧光素酶重组测定法测量活细胞中内质网-线粒体接触

摘要

我们已经建立了一种分裂荧光素酶重组测定法来监测活细胞中的内质网-线粒体接触。使用该测定法，我们描述了一种在化学处理条件下定量测量HEK293T细胞中这些细胞器间偶联水平的方案。

摘要

内质网 （ER）-线粒体接触位点在细胞健康和稳态中起关键作用，例如 Ca²⁺ 和脂质稳态的调节、线粒体动力学、自噬体和线粒体生物发生以及细胞凋亡。无法维持正常的 ER-线粒体偶联与许多神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫。探索 ER-线粒体接触的失调如何导致细胞死亡以及将这些接触修复到正常水平是否可以改善神经退行性疾病具有重要意义。因此，测量这些接触水平的改进检测可能有助于阐明这些疾病的致病机制。最终，建立简单可靠的检测方法将有助于开发新的治疗策略。在这里，我们描述了一种分裂荧光素酶测定法，用于定量测量活细胞中 ER-线粒体接触的水平。该测定可用于研究这些接触物的病理生理作用，以及在高通量筛选中鉴定它们的调节剂。

引言

ER 和线粒体之间的相互作用对于细胞稳态和存活至关重要 1,2,3,4。先前的证据表明，ER-线粒体接触位点的任何类型的破坏或失调都可能导致多种神经退行性疾病、代谢疾病和心血管疾病，以及癌症 5,6,7,8,9,10。例如，线粒体中 Ca²⁺ 摄取的异常增加可通过打开线粒体通透性转换孔导致细胞死亡，这在阿尔茨海默病的某些模型中很常见 ^5,11。同样，减少 ER-线粒体接触会导致 ATP 产生减少和 Ca²⁺ 摄入量受损，如肌萎缩侧索硬化症模型所示

研究方案

1. 细胞维护和接种（第 1 天）

1. 将HEK293T细胞维持在含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FBS）（在 100 mm 培养皿中）的细胞培养基中，在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
2. 在开始之前，通过在显微镜下观察来检查板的汇合度。当细胞达到大约 80-90% 的汇合度时，通过去除培养基并用 10 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤，准备将细胞接种在 6 孔培养板中。
3. 从培养皿中取出 DPBS，并用 1 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 酚红处理细胞。孵育 3 分钟，然后从培养箱中取出板，加入 9 mL 培养基（含 10% FBS 的 DMEM）以终止胰蛋白酶反应。缓慢上下移液，以确保仍粘附在板上的任何细胞脱落。将细胞悬液转移至 50 mL 试管中。
4. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。去除培养基，用 1 mL 新鲜培养基 （DMEM + 10% FBS） 重悬细胞沉淀。
5. 使用血细胞计数器计数细胞数。
   1. 通过轻轻旋转试管确保细胞均匀分布。立即取出 10 μL 细胞悬液，放入 1.7 mL 微量离心管中。将 90 μL 培养基添加到同一试管中。
   2. 轻轻混....

讨论

我们使用分裂海肾荧光素酶 8 重组测定 （split-R luc 测定） 来量化 ER-线粒体偶联的水平。在这项研究中，我们通过生成单个载体 pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry 修改了原始的分裂 Rluc 构建体²⁴，编码每个分裂 Rluc 成分（MitoRluc^N 和 Rluc^CER）和来自 Thosea asigna 病毒的自裂解.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C