裂解荧光素酶重组测定法测量活细胞中内质网-线粒体接触

摘要

我们已经建立了一种分裂荧光素酶重组测定法来监测活细胞中的内质网-线粒体接触。使用该测定法，我们描述了一种在化学处理条件下定量测量HEK293T细胞中这些细胞器间偶联水平的方案。

摘要

内质网 （ER）-线粒体接触位点在细胞健康和稳态中起关键作用，例如 Ca²⁺ 和脂质稳态的调节、线粒体动力学、自噬体和线粒体生物发生以及细胞凋亡。无法维持正常的 ER-线粒体偶联与许多神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫。探索 ER-线粒体接触的失调如何导致细胞死亡以及将这些接触修复到正常水平是否可以改善神经退行性疾病具有重要意义。因此，测量这些接触水平的改进检测可能有助于阐明这些疾病的致病机制。最终，建立简单可靠的检测方法将有助于开发新的治疗策略。在这里，我们描述了一种分裂荧光素酶测定法，用于定量测量活细胞中 ER-线粒体接触的水平。该测定可用于研究这些接触物的病理生理作用，以及在高通量筛选中鉴定它们的调节剂。

引言

ER 和线粒体之间的相互作用对于细胞稳态和存活至关重要 1,2,3,4。先前的证据表明，ER-线粒体接触位点的任何类型的破坏或失调都可能导致多种神经退行性疾病、代谢疾病和心血管疾病，以及癌症 5,6,7,8,9,10。例如，线粒体中 Ca²⁺ 摄取的异常增加可通过打开线粒体通透性转换孔导致细胞死亡，这在阿尔茨海默病的某些模型中很常见 ^5,11。同样，减少 ER-线粒体接触会导致 ATP 产生减少和 Ca²⁺ 摄入量受损，如肌萎缩侧索硬化症模型所示 ^5,11,12。随着在 ER-线粒体接触领域进行更多研究，正在发现可能影响这些接触的其他疾病相关蛋白质和基因。尽管目前的知识和证据显示了 ER-线粒体接触位点的作用，但仍需要大量工作来阐明这些接触如何导致细胞功能丧失并最终导致细胞死亡。

已经开发了多种方法来评估两个膜的接近程度、结构形态以及两个细胞器接触位点之间的距离 ^3,4,13。监测 ER-线粒体偶联的方法包括基于荧光标志物的成像^14,15、基于 FRET 报告基因的成像¹⁶ 和基于分离荧光探针的成像^17,18，^它们使用落射荧光和共聚焦显微镜。超分辨率和原子分辨率显微镜也是准确观察细胞器间接触的强大工具，尽管它们在接触部位分析中的使用仍然受到限制，因为它们需要高度专用的显微镜和技术专长¹⁹。此外，透射电子显微镜 （TEM）、扫描电子显微镜 （SEM） 和其他电子显微镜技术，如电子断层扫描 （ET） 和冷冻电子显微镜，也被普遍使用，因为它们提供接触部位的高分辨率超微结构成像，而使用其他实验方法通常无法探索这些成像 20,21,22.然而，这些基于 EM 的方法是一种非常低通量的技术，也会受到化学固定程序的影响。最近，基于接近标记的方法已被用于检测接触位点以及识别新的接触位点蛋白。例如，邻位连接测定 （PLA） 已用于量化细胞器邻近度^23,24，而抗坏血酸过氧化物酶 （APEX） 测定的修订版已用于鉴定新的接触位点蛋白^25,26。重要的是要认识到，上述所有这些方法在检测细胞器之间的接触方面都有优势和内在局限性。因此，需要配对不同的技术来获得对细胞器接触位点的全面解释。

以前我们已经建立了分裂海肾荧光素酶 8 重组测定（分裂 Rluc 测定）来监测 ER-线粒体膜接触的水平（图 1A）24,26,27。简而言之，海肾荧光素酶的每个分裂半都与一个 ER 或线粒体靶向序列偶联。当一起转染时，酶的每个分裂部分都在 ER 或线粒体膜中表达。当 ER 和线粒体彼此靠近时，分裂的两半聚集在一起并重建具有荧光素酶活性的整个酶。对于分裂 Rluc 构建体，我们使用 pBAD/Myc-His²⁷ 中的海肾荧光素酶 8 （Rluc8） 作为初始模板。根据先前的报道确定分裂位点（氨基酸 91 和 92 之间）²⁷。对于 Rluc8 的 N 端半部分，通过 PCR 将 Rluc8 的氨基酸 1-91 的 DNA 序列融合到 pcDNA3.1 TOPO 载体中 FLAG 标签的 3' 端和小鼠 AKAP1 线粒体靶向序列²⁷。对于靶向 ER 的 C 端一半，编码氨基酸 92-311 的 DNA 序列与 myc 标签和酵母 UBC6 ER 定位序列的 5' 端融合。在这里，我们升级了分裂 Rluc 质粒构建体，使得海肾荧光素酶的分裂两半在同一启动子下的单个载体 （pCAG） 中表达，随后切割成两个片段，因为 T2A（来自 Thosea asigna 病毒的自裂解肽 2A 序列）插入两个分裂的一半之间（图 1B）。质粒 DNA 图谱和序列在补充文件 1 和补充图 S1 中提供。使用该系统，我们测量了三种化学物质（抑制参与肌动蛋白聚合的 GTP 酶）对 ER-线粒体接触的影响。这种 split-Rluc 检测是一种简单但强大的检测系统，用于细胞器间接触调节剂的高通量筛选²⁴。

研究方案

1. 细胞维护和接种（第 1 天）

1. 将HEK293T细胞维持在含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FBS）（在 100 mm 培养皿中）的细胞培养基中，在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。
2. 在开始之前，通过在显微镜下观察来检查板的汇合度。当细胞达到大约 80-90% 的汇合度时，通过去除培养基并用 10 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤，准备将细胞接种在 6 孔培养板中。
3. 从培养皿中取出 DPBS，并用 1 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 酚红处理细胞。孵育 3 分钟，然后从培养箱中取出板，加入 9 mL 培养基（含 10% FBS 的 DMEM）以终止胰蛋白酶反应。缓慢上下移液，以确保仍粘附在板上的任何细胞脱落。将细胞悬液转移至 50 mL 试管中。
4. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。去除培养基，用 1 mL 新鲜培养基 （DMEM + 10% FBS） 重悬细胞沉淀。
5. 使用血细胞计数器计数细胞数。
   1. 通过轻轻旋转试管确保细胞均匀分布。立即取出 10 μL 细胞悬液，放入 1.7 mL 微量离心管中。将 90 μL 培养基添加到同一试管中。
   2. 轻轻混合细胞和培养基后，取细胞悬液，通过在盖玻片下方轻轻移液，将 10 μL 添加到血细胞计数器的每个腔室中。
   3. 使用 10 倍物镜，在显微镜下聚焦血细胞计数器的网格线。聚焦后，使用手动计数计数器计算一组 16 个方格（4 x 4 个方格）中的细胞数。重复直到所有四组 16 个方格都被计算完。
   4. 通过取平均细胞计数（来自 16 个角方块中的每一个）并将其乘以 10⁵ 来计算细胞总数/mL。
      注：根据制造商的说明，可以使用自动细胞计数仪来代替血细胞计数器进行细胞计数。
6. 细胞计数完成后，准备以 7.5 × 10⁵ 个细胞/孔的密度和 2 mL 培养基/孔的密度将细胞接种在 6 孔板中。在 50 mL 试管中，加入所需体积的细胞以及 13 mL 培养基。将 2 mL 稀释的细胞悬液分配到 6 个孔中。
   1. 铺板前，使用 C₁V₁ = C₂V₂ 计算 7.5 ×^{10 5} 个细胞/孔所需的细胞数，其中 C₁ 是初始细胞计数（细胞数/mL），V₁ 是初始细胞悬液所需的体积，C₂ 是所需的目标细胞密度（细胞数/mL）， V₂ 是细胞接种所需的最终体积。
7. 分液后，轻轻敲击板的所有侧面以铺展细胞，然后将其置于 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中过夜。

2.聚乙烯亚胺 （PEI） 介导的细胞转染和转染后细胞接种（第 2 天）

1. 从培养箱中取出 6 孔板，并从每个孔中吸出现有培养基。每孔加入 2 mL 新鲜培养基。
2. 用溶解在 TE 缓冲液 （pH 8.0） 中的分裂 Rluc 质粒 DMI（PCAG-MITORLUC N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry）转染细胞。
   1. 对于每个孔，在 1.7 mL 微量离心管中，将 DNA （750 ng） 和 PEI（DNA/PEI 比率 = 1：3）混合在 200 μL DMEM 中。在 8 级快速涡旋 DNA/PEI 约 2 秒，以确保它们充分混合形成复合物。之后，在微型离心机中短暂旋转（<3 秒）。
   2. 让 DNA/PEI 的混合物在室温下孵育 15 分钟，然后将混合物（通过滴加）添加到含有细胞的 6 孔板中的培养基表面。轻轻敲击板（以均匀分布混合物），并在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育 6 小时。
3. 孵育时，首先向每个孔中加入 70 μL PDL（50 μg/mL 的 DPBS），然后在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育至少 1 小时，制备聚-D-赖氨酸 （PDL） 包被的 96 孔板。取出 PDL 溶液，然后用 100 μL DPBS 洗涤每个孔 2 次。在第二次洗涤结束时，确保去除所有剩余的 DPBS。
4. 转染后 6 小时，准备将转染的细胞接种在 PDL 包被的 96 孔板中。
   1. 从培养箱中取出含有转染细胞的 6 孔板，吸出培养基，然后用 2 mL DPBS 洗涤每个孔。去除 DPBS 后，加入 350 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 酚红并孵育 1-2 分钟。要终止胰蛋白酶反应，请向每个孔中加入 1.7 mL 培养基。
   2. 将细胞和培养基转移到 50 mL 试管中后，在台式离心机中以 300 × g 离心试管 5 分钟。吸出培养基并用 1 mL 新鲜培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数器计数细胞数（如步骤 1.5 中所述）。
5. 在 100 μL 培养基中，以 4 × 10⁴ 个细胞/孔的密度将细胞接种在 PDL 包被的 96 孔板中。为此，在 50 mL 试管中，加入必要体积的细胞（计算见下文）以及适当体积的培养基（12 mL 总体积）。使用多通道移液器，将 100 μL 稀释的细胞悬液分配到 96 个孔中。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育 18 小时。
   1. 使用 C₁V₁ = C₂V₂ 计算 4 ×^{10 4} 个细胞/孔所需的细胞数，其中 C₁ 是初始细胞计数（细胞数/mL），V₁ 是初始细胞悬液所需的体积，C₂ 是所需的目标细胞密度（细胞数/mL），V₂ 是细胞接种所需的最终体积。

3. 活细胞中的化学处理和荧光素酶测定（第 3 天）

1. 在 1.7 mL 微量离心管中，以 1：1,000 的比例稀释每种储备液（50 mM Rhosin、25 mM Ehop-016 和 50 mL ZCL278;全部在 DMSO 中）1：1,000 的培养基储备液（5×0 mM Rhosin、25 mM Ehop-016 和 50 mL ZCL278;全部在 DMSO 中）的三种新鲜溶液。向每种溶液中加入 1：2,000 稀释的 海肾 荧光素酶活细胞底物（50 mM DMSO 原液）至终浓度为 25 μM。要制备 0.5、5 和 50 μM ZCL278 溶液，请在培养基中使用初始 50 μM ZCL278 进行连续稀释。
   注意：如果需要化学孵育时间少于 1-1.5 小时，则可以在用每种化学物质处理细胞之前将细胞与活细胞底物（用于 海肾 荧光素酶）预孵育 1-1.5 小时。我们同时添加化学品和活细胞底物，以优化高通量药物筛选的方案。
2. 从含有转染细胞的 96 孔板的每个孔中取出培养基，并向每个孔中加入 50 μL 化学和底物培养基混合物。
3. 将细胞孵育 1 小时、2 小时或 5 小时后，从培养箱中取出培养板，将其加载到发光读板器上，并测量发光。
   1. 在开始之前，请确保读板器已打开。访问微孔板检测仪软件，然后单击 New Session 创建新文件。单击“培养箱”，选中温度选项，然后键入 37 °C，将读板机的温度设置为 37 °C。在 Plate Layout（板布局）下，选择选项 Unknown（未知），然后通过单击和拖动指定要测量的孔。
   2. 在 Protocol （协议） 下，单击 Luminescence 并保持 默认设置。完成设置后，将带盖的板装入读板器，然后选择 Run Plate In（运行板输入）。单击 Start 开始 并保存文件 窗口将出现。通过重命名文件并单击 Save 将文件保存到桌面。
      注意：加入活细胞底物后，发光将继续产生 >24 小时。
4. 读数完成后，从读板机中取出板，然后单击“运行板入”以将读板机放回原处。完成后，将板放回加湿培养箱（37 °C，5% CO₂ ）中，直到下一次读数。
5. 完成后，将发光数据传输到绘图程序中，以绘制每个变量（例如化学物质或浓度）（x 轴）的相对发光单位 （RLU）（y 轴）并分析数据。

4. 用其他方法验证 split-Rluc 测定。

1. 进行其他测定，例如邻位连接测定 （PLA）、透射电子显微镜和线粒体钙摄取监测，以验证从分裂 Rluc 测定获得的结果，如前所述²⁴。

结果

我们使用上述方案来测量添加三种已知抑制特异性 GTP 酶的化合物后 ER-线粒体接触的水平。CDC42、RHO 和 RAC 是 GTP 酶，激活后可促进肌动蛋白聚合²⁸，并分别被 ZCL278、Rhosin 和 Ehop-016 抑制²⁴。HEK293T用 DMSO（对照）、ZCL278 （50 μM）、Rhosin （50 μM） 或 Ehop-016 （25 μM） 处理转染 split-Rluc 的细胞，并孵育 1 小时、2 小时和 5 小时。使用读...

讨论

我们使用分裂海肾荧光素酶 8 重组测定 （split-R luc 测定） 来量化 ER-线粒体偶联的水平。在这项研究中，我们通过生成单个载体 pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry 修改了原始的分裂 Rluc 构建体²⁴，编码每个分裂 Rluc 成分（MitoRluc^N 和 Rluc^CER）和来自 Thosea asigna 病毒的自裂解...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C