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要約

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。

要約

小胞体(ER)-ミトコンドリア接触部位は、Ca2+ および脂質恒常性の調節、ミトコンドリアダイナミクス、オートファゴソームおよびミトファゴソームの生合成、アポトーシスなど、細胞の健康および恒常性において重要な役割を果たします。正常なERとミトコンドリアの結合を維持できないことは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺など、多くの神経変性疾患に関与しています。ERとミトコンドリアの接触の調節不全がどのように細胞死につながるか、そしてこれらの接触を正常なレベルに修復することで神経変性疾患を改善できるかどうかを調査することは非常に重要です。したがって、これらの接触のレベルを測定する改良されたアッセイは、これらの疾患の病原性メカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります。最終的には、シンプルで信頼性の高いアッセイを確立することで、新しい治療戦略の開発が容易になります。ここでは、生細胞内のER-ミトコンドリア接触レベルを定量的に測定するためのスプリットルシフェラーゼアッセイについて説明します。このアッセイは、これらの接触の病態生理学的役割を研究するためだけでなく、ハイスループットスクリーニングにおけるそれらのモジュレーターの同定にも使用できます。

概要

小胞体とミトコンドリアとの間の相互作用は、細胞の恒常性と生存に不可欠です1,2,3,4。以前の証拠は、ER-ミトコンドリア接触部位におけるあらゆる種類の混乱または調節不全が、いくつかの神経変性疾患、代謝性疾患、および心血管疾患、ならびに癌5,6,7,8,9,10に寄与する可能性があることを示しています。例えば、ミトコンドリアへのCa2+の取り込みが異常に増加すると、アルツハイマー病の一部のモデルでよく見られるミトコンドリア透過性遷移孔が開き、細胞死につながる可能性があります5,11。同様に、ERとミトコンドリアの接触の減少は、筋萎縮性側索硬化症のモデルに見られるように、ATP産生の減少とCa2+摂取の障害をもたらす可能性があります5,11,12。ERとミトコンドリアの接触の領域でより多くの研究が行われるにつれて、これらの接触に影響を与える可能性のある追加の疾患関連タンパク質と遺伝子が発見されています。ERとミトコンドリアの接触部位の役割を示す現在の知識と証拠にもかかわらず、これらの接触がどのように細胞機能の喪失、そして最終的には細胞死につながるかを解明するには、まだ多くの研究が必要です。

2つの膜の近接性、構造形態、および2つの細胞小器官接触部位3,4,13間の距離を評価するために、さまざまな方法が開発されてきました。ER-ミトコンドリア結合をモニターするアプローチには、蛍光マーカーベースのイメージング14,15、FRETレポーターベースのイメージング16、および分外蛍光プローブベースのイメージング17,18が含まれ、落射蛍光および共焦点顕微鏡を使用する。超解像顕微鏡法および原子分解能顕微鏡法も、オルガネラ間接触を正確に視覚化するための強力なツールであるが、接触部位分析におけるそれらの利用は、高度に専用の顕微鏡と技術的専門知識を必要とするため、依然として限られている19。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、および電子線トモグラフィー(ET)やクライオ電子顕微鏡などの他のEM技術は、接触部位の高解像度の超微細構造イメージングを提供するため、一般的に使用されていますが、これは他の実験的アプローチでは探索が不可能なことが多い20,21,22。.しかし、これらのEMベースの方法は、非常にロースループットの手法であり、化学固定手順の影響も受ける可能性があります。最近では、近接ラベリングベースの方法を使用して、接触部位を検出したり、新しい接触部位タンパク質を同定したりしています。例えば、近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、オルガネラの近接性を定量するために使用されてきた23,24一方、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)アッセイの改訂版は、新しい接触部位タンパク質の同定に利用されてきた25,26。上記のすべての方法には、オルガネラ間の接触を検出する上で長所と固有の制限があることを認識することが重要です。したがって、オルガネラ接触部位の徹底的な解釈を得るためには、異なる技術の組み合わせが必要です。

以前に、ERミトコンドリア膜接触のレベルを監視するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を確立しました(図1A)24,26,27。簡単に言うと、Renillaルシフェラーゼの各分割された半分は、ERまたはミトコンドリアの標的配列と結合されています。一緒にトランスフェクトすると、酵素の各分割された半分はERまたはミトコンドリア膜のいずれかで発現します。ERとミトコンドリアが互いに近接して配置されると、分割された半分が一緒になり、ルシフェラーゼ活性を持つ酵素全体が再構成されます。split-Rluc コンストラクトでは、初期テンプレートに pBAD/Myc-His27 の Renilla luciferase 8 (Rluc8) を使用しました。分裂部位(アミノ酸91と92の間)は、以前の報告27に基づいて決定された。Rluc8のN末端半分については、PCR27により、R luc8のアミノ酸1-91のDNA配列をFLAGタグの3'末端とマウスAKAP1ミトコンドリア標的配列のpcDNA3.1 TOPOベクターに融合させた。小胞体を標的とするC末端の半分については、アミノ酸92-311をコードするDNA配列をmycタグの5'末端と酵母UBC6 ER局在配列に融合させた。ここでは、Renillaルシフェラーゼの分割半分が同じプロモーターの下で単一ベクター(pCAG)で発現し、その後、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列であるT2Aが2つの分割半分の間に挿入されるときに2つのフラグメントに切断されるように、split-R lucプラスミドコンストラクトをアップグレードしました(図1B)。プラスミドDNAマップおよび配列は、補足ファイル1および補足図S1に記載されています。このシステムを用いて、3つの化学物質(アクチン重合に関与するGTPaseを阻害する物質)がER-ミトコンドリアの接触に及ぼす影響を測定しました。このsplit-Rlucアッセイは、細胞小器官間接触モジュレーター24のハイスループットスクリーニングのためのシンプルでありながら堅牢なアッセイシステムです。

プロトコル

1. 細胞の維持と播種(1日目)

  1. HEK293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)(100 mm培養皿)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む細胞培養培地で、37°C、5%CO2の加湿インキュベーターで維持します。
  2. 開始する前に、顕微鏡で観察してプレートの合流点を確認してください。細胞が約80〜90%の密度に達したら、培地を取り出し、10 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄することにより、6ウェル培養プレートで細胞を播種する準備をします。
  3. 培養皿からDPBSを取り出し、0.05%トリプシン-EDTAフェノールレッド1mLで細胞を処理します。3分間インキュベートした後、インキュベーターからプレートを取り出し、9 mLの培地(DMEMと10% FBS)を加えてトリプシン反応を停止します。ゆっくりとピペットで上下に動かし、プレートに付着したままの細胞が取り除かれていることを確認します。細胞懸濁液を50mLチューブに移します。
  4. 300 × g で室温で5分間遠心分離します。培地を取り出し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な培地(DMEM + 10% FBS)で再懸濁します。
  5. 血球計算盤を使用して細胞の数を数えます。
    1. チューブを静かに渦巻かせることで、細胞が均一に分布するようにします。直ちに10 μLの細胞懸濁液を取り出し、1.7 mLの微量遠心チューブに入れます。同じチューブに90μLの培地を加えます。
    2. 細胞と培地を穏やかに混合した後、細胞懸濁液を取り、カバーガラスの下で静かにピペッティングして、血球計算盤の各チャンバーに10μLを適用します。
    3. 10倍対物レンズを使用して、顕微鏡下で血球計算盤のグリッド線に焦点を合わせます。焦点を合わせたら、ハンドタリーカウンターを使用して、16個の正方形(4 x 4個の正方形)の1セットのセルの数を数えます。16個の正方形の4つのセットがすべてカウントされるまで繰り返します。
    4. 平均細胞数(16個の角のそれぞれから)を取り、それに10:5を掛けて、細胞数/mLの合計を計算します。
      注:血球計算盤を使用して細胞をカウントする代わりに、製造元の指示に従って自動セルカウンターを使用することができます。
  6. 細胞計数が完了したら、6ウェルプレートで細胞を7.5 × 105細胞/ ウェル密度で2 mLの培地/ウェルでプレートする準備をします。50 mLのチューブに、必要な量の細胞と13 mLの培地を加えます。希釈した細胞懸濁液2 mLを6つのウェルのそれぞれに分注します。
    1. めっきする前に、C1V1 = C2V2を用いて、7.5 × 105細胞/ウェルに必要な細胞数を計算します。ここで、C1は初期細胞数(細胞数/mL)、V1は初期細胞懸濁液から必要な容量、C2は所望の標的細胞密度(細胞数/mL)、 V2は、細胞播種に必要な最終量です。
  7. 分注後、プレートの四方を軽くたたいて細胞を広げ、5% CO2 を加えた 37 °C の加湿インキュベーターに一晩置きます。

2. ポリエチレンイミン(PEI)を介した細胞トランスフェクションとトランスフェクション後の細胞播種(2日目)

  1. インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、各ウェルから既存の培地を吸引します。ウェルあたり2 mLの新鮮な培地を加えます。
  2. TEバッファー(pH 8.0)に溶解したsplit-RlucプラスミドDNA(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)を細胞にトランスフェクションします。
    1. 各ウェルについて、DNA(750 ng)とPEI(DNA/PEIの比率=1:3)を1.7 mLの微量遠心チューブ内の200 μLのDMEMに混合します。レベル 8 の DNA/PEI を約 2 秒間すばやくボルテックスして、それらがよく混ざり合って複合体を形成することを確認します。その後、ミニ遠心分離機で短時間(<3秒)スピンダウンします。
    2. DNA/PEIの混合物を室温で15分間インキュベートし、細胞を含む6ウェルプレートの培地の表面に混合物を滴下して加えます。プレートを軽くたたいて(混合物を均等に分散させるため)、加湿インキュベーターで37°C、5%CO2 で6時間インキュベートします。
  3. インキュベート中に、まず70 μLのPDL(DPBSで50 μg/mL)を各ウェルに加え、加湿インキュベーターで5% CO 2を5%CO2 で少なくとも1時間インキュベートして、Poly-D-Lysine(PDL)コーティング96ウェルプレートを調製します。PDL溶液を取り出し、各ウェルを100 μLのDPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄の最後に、残りのDPBSがすべて除去されていることを確認してください。
  4. トランスフェクション後6時間で、トランスフェクションした細胞をPDLでコーティングした96ウェルプレートに播種する準備をします。
    1. トランスフェクションした細胞を含む6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引し、各ウェルを2 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを取り外した後、0.05%トリプシン-EDTAフェノールレッドを350μL加え、1〜2分間インキュベートします。トリプシン反応を止めるには、各ウェルに1.7 mLの培地を加えます。
    2. 細胞を培地とともに50 mLチューブに移した後、卓上遠心分離機でチューブを300 × g で5分間回転させます。培地を吸引し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な培地で再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞の数をカウントします(ステップ1.5で説明)。
  5. PDLでコーティングした96ウェルプレートに、100μLの培地に4×104 細胞/ウェルの密度で細胞を播種します。このためには、50 mLのチューブに、必要な量の細胞(計算については下記参照)と適切な量の培地(合計容量12 mL)を追加します。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した細胞懸濁液100 μLを96ウェルのそれぞれに分注します。細胞を加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で18時間インキュベートします。
    1. C1V1 = C2V2 を使用して、4 × 104 cells/well に必要な細胞数を計算します。ここで、C1 は初期細胞数 (細胞数/mL)、V1 は初期細胞懸濁液から必要な容量、C2 は目的の標的細胞密度 (細胞数/mL)、V2 は細胞播種に必要な最終容量です。

3. 生細胞における化学処理とルシフェラーゼアッセイ(3日目)

  1. 1.7 mLのマイクロチューブに、50 μM Rhosin(DMSOに50 mMストック)、25 μM Ehop-016(DMSOに25 mMストック)、50 μM ZCL278(DMSOに50 mMストック)の3種類のフレッシュ溶液を、各ストック溶液(50 mM Rhosin、25 mM Ehop-016、50 mL ZCL278、すべてDMSO中)を必要量(50 μL/ウェル×ウェル数)の培地に1:1,000で希釈して調製します。各溶液に、最終濃度25 μMまで1:2,000に希釈した Renilla ルシフェラーゼ用の生細胞基質(DMSO中の50 mMストック)を添加します。0.5、5、50 μM ZCL278溶液を調製するには、培養培地で最初の50 μM ZCL278を使用して段階希釈を行います。
    注:化学的インキュベーション時間が1〜1.5時間未満で必要な場合は、細胞を生細胞基質( Renilla ルシフェラーゼ用)と1〜1.5時間予備インキュベートしてから、各化学物質で処理することができます。化学物質と生細胞基質を同時に添加することで、ハイスループットな薬物スクリーニングのためのプロトコールを最適化します。
  2. トランスフェクションされた細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルから培地を取り出し、各ウェルに50 μLの化学培地と基質培地の混合物を加えます。
  3. 細胞を1時間、2時間、または5時間インキュベートした後、インキュベーターから培養プレートを取り出し、発光プレートリーダーにロードして発光を測定します。
    1. 開始する前に、プレートリーダーがオンになっていることを確認してください。マイクロプレートリーダーソフトウェアにアクセスし、[ New Session]をクリックして新しいファイルを作成します。プレートリーダー の温度 を 37°C に設定するには、 インキュベーターをクリックし、温度オプションをチェックして、 37°Cと入力します。 [プレート レイアウト] で [不明] オプションを選択し、クリックしてドラッグして測定するウェルを指定します。
    2. [プロトコル] で [Luminescence] をクリックし、デフォルト設定のままにします。セットアップが終了したら、蓋を外した状態でプレートをプレートリーダーにロードし、[プレートインの実行]を選択します。[開始]をクリックすると、ファイルの保存ウィンドウが表示されます。ファイルの名前を変更して [保存] をクリックし、デスクトップに保存します。
      注:発光は、生細胞基質の添加後>24時間にわたって生成され続けます。
  4. 読み取りが完了したら、プレートリーダーからプレートを取り外し、[プレートインを実行]をクリックしてリーダーを元に戻します。完了したら、プレートを加湿インキュベーター(37°C、5%CO2)に戻し、次の読み取りまで待ちます。
  5. 終了したら、発光データをグラフプログラムに転送して、各変数(化学物質や濃度など)(x軸)の相対発光単位(RLU)(y軸)をプロットし、データを分析します。

4. split-Rluc assayの他法によるバリデーション

  1. 近接ライゲーションアッセイ(PLA)、透過型電子顕微鏡法、およびミトコンドリアカルシウム取り込みモニタリングなどの他のアッセイを実施して、前述の24のsplit-Rlucアッセイから得られた結果を検証する。

結果

我々は、上記のプロトコルを使用して、特定のGTPaseを阻害することが知られている3つの化合物を添加したときのER-ミトコンドリア接触のレベルを測定しました。CDC42、RHO、およびRACは、活性化されるとアクチン重合28を促進するGTPアーゼであり、それぞれZCL278、Rhosin、およびEhop-016によって阻害される24。split-Rlucでトランス?...

ディスカッション

私たちは、ER-ミトコンドリアカップリングのレベルを定量するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を使用しました。本研究では、ルシフェラーゼの各分割半分が同量の発現を確保するために、各split-Rluc成分(MitoRlucNおよびRlucCER)およびThosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者らは、原稿の批判的なレビューについて、Jeffrey Golden博士(Cedars-Sinai Medical Center)に感謝しています。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS, R01NS113516)から一部資金提供を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge TubeSorenson16070
6-well plate TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μL pipette tips OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon352070
96-Well Flipper Microtube RacksThermoFisher Scientific8770-11
96-well plate TC Treated USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated DishUSA ScientificCC7682-3394
1250 μL Tips OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated CentrifugeEppendorf5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, high glucoseThermoFisher Scientific11965092
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell SubstratePromegaE6481Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipetteEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipetteEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipetteEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12-channelEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipetteEppendorf 3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regionsThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless SteelThermoFisher Scientific381
Hand tally counterSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting ChamberLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
MicroscopeZeissAxiovert 25 CFL
Mini centrifugeBenchmark ScientificC1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge TubesBoekel Scientific120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin hydrochlorideBio-Techne Tocris5003Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX multimode microplate readerThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365level 8
VWR Vacuum Aspiration SystemVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Dissolve in DMSO; store at -70 °C

参考文献

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