Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Zusammenfassung

Die Kontaktstellen des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle für die Zellgesundheit und Homöostase, wie z. B. die Regulation der Ca2⁺ - und Lipidhomöostase, die mitochondriale Dynamik, die Biogenese von Autophagosomen und Mitophagosomen sowie die Apoptose. Das Versagen der Aufrechterhaltung einer normalen ER-mitochondrialen Kopplung ist an vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, amyotropher Lateralsklerose und hereditärer spastischer Querschnittslähmung beteiligt. Es ist von erheblicher Bedeutung zu untersuchen, wie die Dysregulation von ER-mitochondrialen Kontakten zum Zelltod führen könnte und ob die Reparatur dieser Kontakte auf das normale Niveau neurodegenerative Zustände verbessern könnte. Daher könnten verbesserte Assays, die das Niveau dieser Kontakte messen, dazu beitragen, die pathogenen Mechanismen dieser Krankheiten zu beleuchten. Letztendlich wird die Etablierung einfacher und zuverlässiger Assays die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien erleichtern. Hier beschreiben wir einen Split-Luciferase-Assay zur quantitativen Messung des Ausmaßes von ER-Mitochondrien-Kontakten in lebenden Zellen. Dieser Assay kann verwendet werden, um die pathophysiologische Rolle dieser Kontakte zu untersuchen und ihre Modulatoren im Hochdurchsatz-Screening zu identifizieren.

Einleitung

Die Wechselwirkungen zwischen dem ER und den Mitochondrien sind entscheidend für die zelluläre Homöostase und das Überleben 1,2,3,4. Frühere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass jede Art von Störung oder Dysregulation in den Kontaktstellen der ER-Mitochondrien zu verschiedenen neurodegenerativen, metabolischen und kardiovaskulären Erkrankungen sowie zu Krebs beitragen^kann 5,6,7,8,9,10.

Protokoll

1. Zellerhaltung und Aussaat (Tag 1)

1. Bewahren Sie HEK293T Zellen in Zellkulturmedien auf, die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (in 100 mm Kulturschalen) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ enthalten.
2. Bevor Sie beginnen, überprüfen Sie die Konfluenz der Platte, indem Sie sie unter dem Mikroskop betrachten. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80-90 % erreichen, bereiten Sie die Aussaat der Zellen in einer 6-Well-Kulturplatte vor, indem Sie das Medium entfernen und mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) w....

Diskussion

Wir haben einen Split-Renilla-Luciferase-8-Reassemblierungs-Assay (Split-R luc-Assay) verwendet, um den Grad der ER-Mitochondrien-Kopplungen zu quantifizieren. In dieser Studie haben wir das ursprüngliche split-Rluc-Konstrukt²⁴ modifiziert, indem wir einen einzelnen Vektor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry, erzeugt haben, der für jede split-Rluc-Komponente (MitoRluc^N und R

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C