改良四支血管闭塞诱导的脑缺血性昏迷模型

摘要

该协议描述了使用改良的四支血管闭塞方法诱导脑缺血性昏迷模型的过程。

摘要

脑缺血引起的昏迷是脑缺血最严重的并发症。四支血管闭塞可以建立脑缺血性昏迷模型，用于疾病研究和药物开发。但常用的四支血管闭塞法主要是将电凝笔插入颈部后方第一颈椎的双侧翼状孔，对椎动脉进行电凝。这个过程存在电凝不完全、出血以及脑干和脊髓损伤的风险。手术后 24 小时，再麻醉的大鼠在颈部前进行颈动脉结扎术。两次手术使大鼠面临更高的感染风险并增加了实验期。在这项研究中，在单个外科手术中，使用颈椎前切口来定位椎动脉穿透第一颈椎的关键部位。双侧椎动脉在视觉条件下进行电灼化，而双侧颈总动脉分离以放置松散的结。当大鼠的四肢开始抽搐时，双侧颈总动脉被迅速结扎以诱发缺血性昏迷。这种方法可以避免两次外科手术引起的感染风险，并且操作简单，成功率高，为相关从业者提供有用的参考。

引言

缺血性脑损伤是临床实践中最常见的脑损伤，约占脑血管疾病病例的 75%。缺血可导致严重的继发性脑损伤和疾病 ^1,2，^昏迷是缺血性缺氧性脑损伤引起的最严重症状。它也是许多危急情况的最终途径³。昏迷在临床实践中是一种难以控制的危重疾病⁴。昏迷持续时间越长，潜在危险就越大。迅速觉醒是防止病情恶化和进展的主要目标。虽然纳洛酮注射液在促进觉醒方面有广泛的临床应用，但它仍然存在一些副作用⁵。因此，开发安全有效的促进觉醒药物是一个亟待解决的问题。建立简单易操作的脑缺血性昏迷模型对于阐明缺血性昏迷的发病机制和药物开发至关重要 ^6,7,8。

本研究的目的是介绍一种通过双侧椎动脉电凝和双侧颈总动脉 （CCA） 临时结扎诱导全面缺血性昏迷的模型，该模型简单且对新手友好。之前的方案包括在第一次手术中暴露第一颈椎后椎的双侧翼状孔，并电烧翼状孔以阻断双侧 VA。24 小时后进行第二次手术，通过结扎双侧 CCA^{9、10、11、12} 诱导完全缺血性昏迷。然而，由于不可见，存在电凝不完全、出血、脑干和脊髓损伤的风险，以及实验期延长的风险。因此，有必要解决这些问题。

在这里，我们提出了一种改进的缺血性昏迷建模方法。主要手术包括做一个正中颈前切口，在视觉条件下对双侧 VA 进行电切除，并在一次手术中短暂结扎双侧 CCA，以阻断整个大脑的血液供应，导致快速脑电图 （EEG） 抑制并导致昏迷。这种方法也会在再灌注后诱发短暂的持续昏迷。该程序易于执行，对新手友好，并降低了动物继发性创伤感染的风险，从而缩短了实验时间。

该方案适用于心脏骤停引起的全面缺血性昏迷的研究。它也是研究缺血性痴呆的理想选择，主要是因为海马脑区对缺血极为敏感;因此，短暂性脑缺血可导致海马神经元损伤甚至丢失¹³，从而导致认知功能障碍。因此，该方案可为研究脑缺血、缺血性昏迷和缺血性痴呆的从业者提供参考。

研究方案

实验方案是根据佛山大学实验动物使用和机构动物护理和使用委员会的要求进行的（记录编号：2023-643656）。雄性 Sprague Dawley （SD） 大鼠 （200 g ± 20 g，6-8 周龄） 用于本研究。所有动物研究数据均已根据 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南编写。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 植入脑电图电极

1. 麻醉前15 min皮下注射0.05mg/kg阿托品，防止分泌物引起呼吸阻塞和窒息。肌肉注射 20 mg/kg zoletil 和 5 mg/kg 甲苯噻嗪以麻醉大鼠¹⁴。用镊子夹住大鼠的脚趾，确认深度麻醉。
2. 用剃须刀去除老鼠头上的毛发。使用非穿透式耳杆将大鼠的头部固定在大脑立体定位装置上。使用无菌棉球将乙醇和聚维酮碘涂抹在手术部位 3 次，对皮肤进行消毒。
3. 用手术刀片沿着斩首的缝合线切开大鼠头部的皮肤。去除覆盖颅骨的肌肉，完全暴露颅骨。在整个过程中使用无菌棉签止血。
4. 用洗耳球吹干颅骨表面，以帮助牙科粘接剂紧紧粘附在颅骨上。用黑色记号笔标记颅骨钉的安装位置（直径 1.2 毫米，长度 3 毫米）（图 1，步骤 1）。具体位置是前囟点和其他四个部位。
5. 使用 10 mL 注射器的针头依次旋转和钻穿四个区域。按顺序将四个颅骨钉插入颅骨，确保与大脑皮层接触（图 1，步骤 2-3）。
   注意：使用无菌棉签吸收血液，以防出血，以防止骨甲生锈。
6. 将 EEG 电极的银线缠绕在颅骨甲上。将肌电图电极嵌入肌肉中，并用 6-0 缝合线固定。
7. 将义齿基托树脂与自凝性义齿粉混合，并将电极固定在颅骨上。使用洗耳球将空气吹到牙科粘结剂的表面，以加速固化。
8. 注射 10,000 单位青霉素以防止感染。将每只大鼠安置在单独的笼子中，以防止相互撕裂和损坏电极。皮下注射 0.2 mg/kg 美洛昔康，连续 3 天减轻术后疼痛。允许 3 天以恢复大鼠伤口和电极固定（图 1，步骤 4）。

2. 脑缺血性昏迷模型的手术过程

1. 三天后，重新麻醉大鼠并将它们置于仰卧位。使用无菌棉球对手术部位进行消毒，重复施碘 3 次，然后用酒精冲洗/擦拭。用手术刀从胸骨上缘沿颈部中部纵向切开约 2-3 厘米长的切口（图 1，步骤 5）。
2. 钝性分离皮下组织和胸骨舌骨肌，充分暴露气管两侧的气管和长骨肌¹⁵.
   注意： 在整个过程中避免刺激气管。
3. 将长颈肌与甲状腺水平钝性地向下分离，露出第一和第二颈椎。用大鼠组织扩张器扩大颈部区域，完全暴露手术部位。
4. 使用细镊子小心地分离颈椎间隙可见的肌肉和组织，露出椎动脉进入第一颈椎的特征位置。可以观察到，椎动脉穿过第一颈椎（图1，步骤 6）。
   注意：将 1 mL 注射器放在颈部下方可提供更清晰的手术操作空间。
5. 预热电凝笔并将其插入该区域 3-5 秒，以确保椎动脉电凝并切断。沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，暴露并释放双侧 CCA，并打一个松散的结。
   注意：电凝笔必须预热;否则，它不能迅速凝固椎动脉，导致出血。两条椎动脉都是电凝的，松散的结打结打在 CCA 周围。
6. 当大鼠恢复意识并表现出肢体抽搐时，迅速收紧第一个松结以阻止 CCA 中的血流，同时 EEG 检测器检测主动的 EEG 和 EMG 信号。大鼠会挣扎几秒钟，然后逐渐失去知觉（图 1，第 7 步）。
7. 松开固定后，观察大鼠的四肢僵硬，扶正反射消失，但呼吸保持。此时，肌电图 （EMG） 呈现一条直线，脑电图迅速受到抑制，表明 4-VO 诱导的脑缺血模型成功¹⁶。
   注意：在双侧 CCA 结扎期间，一些大鼠会出现呼吸抑制。快速机械刺激可以恢复一些大鼠的自主呼吸。
8. 根据“针控扎法¹⁶”，在距离 CCA、ICA 和 ECA 分叉处约 1.5 cm 处使用 6-0 尼龙线用直径为 0.5 mm 的注射器针头捆绑 CCA。小心地拔出针头;第二个结随后将导致颈动脉变窄（图 1，步骤 8）。
   注意：用于 CCA 狭窄的结扎线需要由尼龙材料制成，稳定。尼龙线不受血液影响，不会变粗;否则，可引起大鼠 CCA 极度狭窄，增加死亡率。
9. 缺血 30 分钟后，解开第一个结，CCA 将发生再灌注，但第二个结会导致 CCA 狭窄，诱发持续昏迷（图 1，步骤 9）。用可吸收的单丝缝合线缝合皮下组织，用不可吸收的单丝缝合线缝合皮肤。

3. 动物恢复

1. 将大鼠放在绝缘垫上，注射 10,000 单位青霉素以防止感染。皮下注射 0.2 mg/kg 美洛昔康连续 3 天以减轻术后疼痛。
2. 再灌注 60 分钟后，确保大鼠逐渐恢复。

结果

由于植入电极引起的炎症和其他刺激，脑电图可能不稳定，因此大鼠需要恢复 3 天。可纳入 3 天后脑电图和肌电图正常的大鼠进行昏迷模型制备。当大鼠被麻醉时，脑电图和肌电活动略微受到抑制，但进展顺利。电凝阻断双侧 VAs 后 EEG 和 EMG 活动无显着变化。约 30 min 后，药物代谢，大鼠逐渐恢复意识，脑电图和肌电活动增加。当大鼠表现出肢体抽搐时，当 EEG 和 EMG 信号...

讨论

四支血管闭塞诱发整体缺血性低氧性脑损伤，可模拟临床上脑缺血引起的急性昏迷、心脏骤停、窒息、休克、严重心律失常等危重临床病症。同时，四支血管闭塞主要导致海马体^17,18 的损伤，海马体是负责认知记忆的主要功能性大脑区域 19,20,21。因此，四支...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 channel microfiber photoelectrode array	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0 Surgical suture	Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.	B-104
6-0 Surgical suture	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
EEG electrode	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
Electrocoagulation pen	CONPUVON Company	465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging System	Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.	1336
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	180-220g
Skull nail	GLOBALEBIO,LTD	/
Stereotaxic instrument	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA