Modèle de coma ischémique cérébral induit par une occlusion modifiée à quatre vaisseaux

Résumé

Ce protocole décrit le processus d’induction d’un modèle de coma ischémique cérébral à l’aide d’une méthode d’occlusion modifiée à quatre vaisseaux.

Résumé

Le coma causé par l’ischémie cérébrale est la complication la plus grave de l’ischémie cérébrale. L’occlusion à quatre vaisseaux peut établir un modèle de coma ischémique cérébral pour la recherche sur les maladies et le développement de médicaments. Cependant, la méthode d’occlusion à quatre vaisseaux couramment utilisée consiste principalement à insérer un stylo d’électrocoagulation dans le foramen ptérygoïdien bilatéral de la première vertèbre cervicale derrière le cou pour électrocoaguler les artères vertébrales. Ce processus comporte un risque d’électrocoagulation incomplète, de saignement et de lésions du tronc cérébral et de la moelle épinière. Vingt-quatre heures après l’opération, les rats réanesthésiés subissent une ligature de l’artère carotide devant le cou. Deux interventions chirurgicales exposent les rats à un risque plus élevé d’infection et prolongent la période expérimentale. Dans cette étude, au cours d’une seule intervention chirurgicale, une incision cervicale antérieure a été utilisée pour localiser le site clé où l’artère vertébrale pénètre dans la première vertèbre cervicale. Les artères vertébrales bilatérales ont été électrocautérisées dans des conditions visuelles, tandis que les artères carotides communes bilatérales ont été séparées pour former des nœuds lâches. Lorsque les membres des rats ont commencé à se contracter, les artères carotides communes bilatérales ont été rapidement ligaturées pour induire un coma ischémique. Cette méthode permet d’éviter le risque d’infection causé par deux opérations chirurgicales et est facile à réaliser avec un taux de réussite élevé, fournissant une référence utile pour les praticiens concernés.

Introduction

Le traumatisme crânien ischémique est le traumatisme crânien le plus fréquent en pratique clinique, représentant environ 75 % des cas de maladies cérébrovasculaires. L’ischémie peut entraîner de graves lésions cérébrales secondaires et des maladies ^1,2, et le coma est le symptôme le plus grave causé par une lésion cérébrale hypoxique ischémique. C’est aussi la voie finale pour de nombreuses conditions critiques³. Le coma est une maladie critique et grave dans la pratique clinique qui est difficile à gérer⁴. Plus le coma dure longtemps, plus le danger potentiel est grand. Un réveil rapide est l’objectif principal pour prévenir la détérioration et la progression de la maladie. Bien que l’injection de naloxone ait un large éventail d’applications cliniques pour favoriser l’éveil, elle a tout de même des effets secondaires⁵. Par conséquent, la mise au point de médicaments sûrs et efficaces favorisant l’éveil est un problème urgent qui doit être résolu. L’établissement d’un modèle simple et facile à utiliser du coma ischémique cérébral est essentiel pour élucider la pathogenèse du coma ischémique et pour le développement de médicaments ^6,7,8.

Le but de cette étude est d’introduire un modèle d’induction d’un coma ischémique global par électrocoagulation des artères vertébrales bilatérales (AV) et ligature temporaire des artères carotides communes bilatérales (ACC), qui est simple et convivial pour les novices. Le protocole précédent consistait à exposer le foramen ptérygoïdien bilatéral de la première vertèbre cervicale postérieure lors de la première opération et à brûler électriquement le foramen ptérygoïdien pour bloquer les AV bilatérales. Une seconde opération a été réalisée 24 h plus tard pour induire un coma ischémique total par ligature des ACC bilatéraux 9,10,11,12. Cependant, en raison de l’invisibilité, il existe un risque d’électrocoagulation incomplète, d’hémorragie, de lésion du tronc cérébral et de la moelle épinière, ainsi qu’une période expérimentale prolongée. Par conséquent, il est nécessaire de s’attaquer à ces questions.

Ici, nous présentons une méthode améliorée pour modéliser le coma ischémique. La procédure principale consiste à faire une incision médiane antérieure du cou, à effectuer une résection électrique des AV bilatérales dans des conditions visuelles et à ligaturer brièvement les ACC bilatéraux au cours d’une seule opération pour bloquer l’apport sanguin à l’ensemble du cerveau, provoquant une inhibition rapide de l’électroencéphalogramme (EEG) et conduisant au coma. Cette méthode induit également un bref coma continu après reperfusion. Cette procédure est facile à réaliser, adaptée aux novices et réduit le risque d’infection traumatique secondaire chez les animaux, raccourcissant ainsi la période expérimentale.

Le protocole est adapté à l’étude du coma ischémique global causé par un arrêt cardiaque. Il est également idéal pour l’étude de la démence ischémique, principalement parce que la région cérébrale de l’hippocampe est extrêmement sensible à l’ischémie ; Ainsi, l’ischémie cérébrale transitoire peut entraîner des dommages, voire une perte de neurones de l’hippocampe¹³, entraînant un dysfonctionnement cognitif. Par conséquent, le protocole peut fournir une référence pour les praticiens qui étudient l’ischémie cérébrale, le coma ischémique et la démence ischémique.

Protocole

Le protocole expérimental a été réalisé conformément aux exigences du Comité d’utilisation des animaux de laboratoire et du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Foshan (Numéro d’enregistrement : 2023-643656). Des rats Sprague Dawley (SD) mâles (200 g ± 20 g, âgés de 6 à 8 semaines) ont été utilisés pour cette étude. Toutes les données de la recherche sur les animaux ont été rédigées conformément aux directives ARRIVE (Animal Research : Reporting In Vivo Experiments). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Implantation d’électrodes EEG

1. Injecter 0,05 mg/kg d’atropine par voie sous-cutanée 15 min avant l’anesthésie pour prévenir l’obstruction respiratoire et l’asphyxie causées par les sécrétions. Administrer une injection intramusculaire de 20 mg/kg de zoletil et de 5 mg/kg de xylazine pour anesthésier les rats¹⁴. Utilisez une pince à épiler pour pincer les orteils du rat afin de confirmer une anesthésie profonde.
2. Retirez les poils de la tête du rat avec un rasoir à cheveux. Fixez la tête du rat sur un appareil stéréotaxique cérébral à l’aide de barres d’oreille non pénétrantes. Utilisez des boules de coton stériles pour appliquer trois fois de l’éthanol et de la povidone iodée sur le site chirurgical afin de désinfecter la peau.
3. Coupez la peau de la tête du rat le long de la suture décapitée avec une lame chirurgicale. Retirez le muscle recouvrant le crâne et exposez complètement le crâne. Utilisez des cotons-tiges stériles pour arrêter les saignements tout au long du processus.
4. Séchez la surface du crâne à l’aide d’une boule de lavage d’oreille pour aider le ciment dentaire à adhérer fermement au crâne. Marquez la position d’installation de l’ongle crâne (diamètre 1,2 mm, longueur 3 mm) à l’aide d’un marqueur noir (Figure 1, étape 1). Les positions spécifiques sont la pointe de la fontanelle antérieure et quatre autres sites.
5. À l’aide de l’aiguille d’une seringue de 10 ml, faites pivoter et percez quatre zones en séquence. Insérez quatre clous du crâne dans le crâne en séquence, en assurant le contact avec le cortex cérébral (Figure 1, étapes 2-3).
   REMARQUE : Utilisez des cotons-tiges stériles pour absorber le sang en cas de saignement afin d’éviter la rouille des ongles osseux.
6. Enroulez le fil d’argent de l’électrode EEG autour de l’ongle du crâne. Insérez l’électrode électromyographique dans le muscle et fixez-la avec une suture 6-0.
7. Mélangez la résine de base de la prothèse avec de la poudre pour prothèses auto-fixantes et fixez l’électrode sur le crâne. Utilisez une boule de lavage d’oreille pour souffler de l’air sur la surface du ciment dentaire afin d’accélérer le durcissement.
8. Injectez 10 000 unités de pénicilline pour prévenir l’infection. Placez chaque rat dans une cage séparée pour éviter les déchirures mutuelles et les dommages aux électrodes. Injection sous-cutanée de 0,2 mg/kg de méloxicam pendant trois jours consécutifs pour soulager la douleur postopératoire. Prévoyez 3 jours pour la récupération des plaies de rat et la fixation des électrodes (Figure 1, étape 4).

2. Processus chirurgical du modèle de coma ischémique cérébral

1. Trois jours plus tard, anesthésie à nouveau les rats et place-les en position couchée. Utilisez des boules de coton stériles pour désinfecter le site chirurgical par trois applications répétées d’iode suivies d’un rinçage/essuyage à l’alcool. Faites une incision d’environ 2 à 3 cm de long à l’aide d’un scalpel à partir du bord supérieur du sternum dans le sens de la longueur le long du milieu du cou (Figure 1, étape 5).
2. Séparez brutalement le tissu sous-cutané et le muscle sterno-hyoïdien, exposant complètement la trachée et les muscles longs des deux côtés de la trachée¹⁵.
   REMARQUE : Évitez de stimuler la trachée tout au long de la procédure.
3. Séparez brutalement les muscles longus colli du niveau de la glande thyroïde vers le bas, exposant les première et deuxième vertèbres cervicales. Élargissez la région du cou avec un dilatateur de tissu de rat, exposant complètement le site chirurgical.
4. À l’aide d’une pince fine, séparez soigneusement les muscles et les tissus visibles dans l’espace intervertébral cervical, exposant ainsi l’endroit caractéristique où l’artère vertébrale pénètre dans la première vertèbre cervicale. On peut observer que l’artère vertébrale passe par la première vertèbre cervicale (Figure 1, étape 6).
   REMARQUE : Le fait de placer une seringue de 1 mL sous le cou permet de dégager un espace de manipulation chirurgicale plus clair.
5. Préchauffez le stylo d’électrocoagulation et insérez-le dans la zone pendant 3 à 5 secondes pour vous assurer que l’artère vertébrale est électrocoagulée et sectionnée. Séparez les muscles et le fascia le long du bord interne du muscle sterno-cléido-mastoïdien, exposez et libérez les ACC bilatéraux et faites un nœud lâche.
   REMARQUE : Le stylo d’électrocoagulation doit être préchauffé ; Sinon, il ne peut pas coaguler rapidement l’artère vertébrale, ce qui entraîne des saignements. Les deux artères vertébrales sont électrocoagulées et des nœuds lâches sont noués autour des ACC.
6. Serrez rapidement le premier nœud lâche pour bloquer le flux sanguin dans le CCA lorsque les rats reprennent conscience et présentent des contractions des membres, tandis que le détecteur EEG détecte les signaux EEG et EMG actifs. Les rats se débattent pendant quelques secondes, puis perdent progressivement conscience (Figure 1, étape 7).
7. Après avoir relâché la fixation, observez que les membres du rat sont raides, que le réflexe de redressement disparaît, mais que la respiration est maintenue. À ce stade, l’électromyogramme (EMG) présente une ligne droite et l’EEG est rapidement supprimé, ce qui indique que le modèle d’ischémie cérébrale induite par 4-VO a été couronné de succès¹⁶.
   REMARQUE : Une dépression respiratoire survient chez certains rats lors de la ligature bilatérale de l’ACC. Une stimulation mécanique rapide peut rétablir la respiration spontanée chez certains rats.
8. Selon la « méthode de l’attache de contrôle de l’aiguille¹⁶ », lier l’ACC avec une aiguille de seringue de 0,5 mm de diamètre à l’aide d’un fil de nylon 6-0 à environ 1,5 cm de la bifurcation de l’ACC, de l’ICA et de l’ECA. Retirez délicatement l’aiguille ; ce deuxième nœud provoquera par la suite un rétrécissement de l’artère carotide (Figure 1, étape 8).
   REMARQUE : La ligature utilisée pour la sténose CCA doit être faite d’un matériau en nylon, qui est stable. Le fil de nylon n’est pas affecté par le sang et ne s’épaissit pas ; sinon, il peut provoquer une sténose extrême de l’ACC chez le rat et augmenter le taux de mortalité.
9. Après 30 minutes d’ischémie, défaites le premier nœud et l’ACC subira une reperfusion, mais le deuxième nœud entraînera une sténose de l’ACC, induisant un coma durable (Figure 1, étape 9). Fermez le tissu sous-cutané avec des sutures monofilaments résorbables et la peau avec des sutures monofilaments non résorbables.

3. Récupération des animaux

1. Placez les rats sur des coussinets isolants et injectez 10 000 unités de pénicilline pour prévenir l’infection. Injecter par voie sous-cutanée 0,2 mg/kg de méloxicam pendant trois jours consécutifs pour soulager la douleur postopératoire.
2. Après 60 min de reperfusion, assurez-vous que les rats se rétablissent progressivement.

Résultats

En raison de l’inflammation et d’autres stimulations causées par l’implantation d’électrodes, l’EEG peut être instable, de sorte que les rats doivent récupérer pendant 3 jours. Les rats avec un EEG et un EMG normaux après 3 jours pourraient être inclus pour la préparation du modèle de coma. Lorsque les rats ont été anesthésiés, l’activité EEG et EMG a été légèrement supprimée mais s’est déroulée sans heurts. Il n’y a pas eu de changement significatif ...

Discussion

L’occlusion à quatre vaisseaux induit des lésions cérébrales ischémiques et hypoxiques globales, qui peuvent simuler un coma aigu, un arrêt cardiaque, une asphyxie, un choc, une arythmie sévère et d’autres conditions cliniques critiques causées par l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique. Pendant ce temps, l’occlusion à quatre vaisseaux peut entraîner des lésions principalement dans l’hippocampe^17,18

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 channel microfiber photoelectrode array	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0 Surgical suture	Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.	B-104
6-0 Surgical suture	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
EEG electrode	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
Electrocoagulation pen	CONPUVON Company	465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging System	Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.	1336
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	180-220g
Skull nail	GLOBALEBIO,LTD	/
Stereotaxic instrument	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA