Modelo de Coma Isquêmico Cerebral Induzido por Oclusão Modificada de Quatro Vasos

Resumo

Este protocolo descreve o processo de indução de um modelo de coma isquêmico cerebral usando um método modificado de oclusão de quatro vasos.

Resumo

O coma causado por isquemia cerebral é a complicação mais grave da isquemia cerebral. A oclusão de quatro vasos pode estabelecer um modelo de coma isquêmico cerebral para pesquisa de doenças e desenvolvimento de medicamentos. No entanto, o método de oclusão de quatro vasos comumente usado envolve principalmente a inserção de uma caneta de eletrocoagulação no forame pterigóideo bilateral da primeira vértebra cervical atrás do pescoço para eletrocoagular as artérias vertebrais. Esse processo acarreta o risco de eletrocoagulação incompleta, sangramento e danos ao tronco encefálico e à medula espinhal. Vinte e quatro horas após a cirurgia, os ratos reanestesiados são submetidos à ligadura da artéria carótida na frente do pescoço. Duas cirurgias expõem os ratos a um risco maior de infecção e aumentam o período experimental. Neste estudo, durante um único procedimento cirúrgico, uma incisão cervical anterior foi usada para localizar o local-chave onde a artéria vertebral penetra na primeira vértebra cervical. As artérias vertebrais bilaterais foram eletrocauterizadas em condições visuais, enquanto as artérias carótidas comuns bilaterais foram separadas para colocar nós soltos. Quando os membros dos ratos começaram a se contorcer, as artérias carótidas comuns bilaterais foram rapidamente ligadas para induzir o coma isquêmico. Este método pode evitar o risco de infecção causada por duas operações cirúrgicas e é fácil de realizar com uma alta taxa de sucesso, fornecendo uma referência útil para profissionais relevantes.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico isquêmico é a lesão cerebral mais comum na prática clínica, sendo responsável por aproximadamente 75% dos casos de doenças cerebrovasculares. A isquemia pode levar a lesões cerebrais secundárias graves e doenças ^1,2, e o coma é o sintoma mais grave causado por lesão cerebral hipóxica isquêmica. É também o caminho final para muitas condições críticas³. O coma é uma doença crítica e grave na prática clínica de difícil manejo⁴. Quanto mais tempo durar o coma, maior será o perigo potencial. O despertar imediato é o objetivo principal na prevenção da deterioração e progressão da condição. Embora a injeção de naloxona tenha uma ampla gama de aplicações clínicas na promoção da vigília, ela ainda apresenta alguns efeitos colaterais⁵. Portanto, o desenvolvimento de medicamentos seguros e eficazes para promover a vigília é um problema urgente que precisa ser abordado. O estabelecimento de um modelo de coma isquêmico cerebral simples e fácil de operar é essencial para elucidar a patogênese do coma isquêmico e para o desenvolvimento de medicamentos ^6,7,8.

O objetivo deste estudo é apresentar um modelo de indução de coma isquêmico global por meio de eletrocoagulação de artérias vertebrais bilaterais (AV) e ligadura temporária de artérias carótidas comuns (ACC) bilaterais, que seja simples e de fácil utilização para iniciantes. O protocolo anterior envolvia a exposição do forame pterigóideo bilateral da primeira vértebra cervical posterior durante a primeira operação e a queima elétrica do forame pterigóideo para bloquear os AVs bilaterais. Uma segunda operação foi realizada 24 h depois para induzir o coma isquêmico total por ligadura dos CCAs bilaterais 9,10,11,12. No entanto, devido à invisibilidade, existe o risco de eletrocoagulação incompleta, sangramento, lesão do tronco encefálico e da medula espinhal, bem como um período experimental prolongado. Portanto, é necessário abordar essas questões.

Aqui, apresentamos um método aprimorado para modelar o coma isquêmico. O procedimento principal envolve fazer uma incisão anterior mediana no pescoço, realizar a ressecção elétrica dos AVs bilaterais em condições visuais e ligar brevemente os CCAs bilaterais durante uma única operação para bloquear o suprimento de sangue para todo o cérebro, causando inibição rápida do eletroencefalograma (EEG) e levando ao coma. Este método também induz um breve coma contínuo após a reperfusão. Este procedimento é fácil de executar, amigável para iniciantes e reduz o risco de infecção por trauma secundário em animais, encurtando assim o período experimental.

O protocolo é adequado para o estudo do coma isquêmico global causado por parada cardíaca. Também é ideal para o estudo da demência isquêmica, principalmente porque a área do cérebro do hipocampo é extremamente sensível à isquemia; Assim, a isquemia cerebral transitória pode levar a danos ou mesmo perda de neurônios hipocampais¹³, resultando em disfunção cognitiva. Portanto, o protocolo pode fornecer uma referência para os profissionais que estudam isquemia cerebral, coma isquêmico e demência isquêmica.

Protocolo

O protocolo experimental foi conduzido de acordo com os requisitos do Comitê de Uso de Animais de Laboratório e Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade de Foshan (número de registro: 2023-643656). Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) (200 g ± 20 g, 6-8 semanas de idade) foram utilizados para este estudo. Todos os dados de pesquisa com animais foram escritos de acordo com as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de eletrodos de EEG

1. Injetar 0,05mg/kg de atropina por via subcutânea 15 min antes da anestesia para evitar obstrução respiratória e asfixia causada por secreções. Administrar uma injeção intramuscular de 20 mg/kg de zoletil e 5 mg/kg de xilazina para anestesiar os ratos¹⁴. Use uma pinça para prender os dedos do rato para confirmar a anestesia profunda.
2. Remova o cabelo da cabeça do rato com um barbeador de cabelo. Fixe a cabeça do rato em um dispositivo estereotáxico cerebral usando barras de ouvido não penetrantes. Use bolas de algodão estéreis para aplicar etanol e iodopovidona três vezes no local da cirurgia para desinfetar a pele.
3. Corte a pele da cabeça do rato ao longo da sutura decapitada com uma lâmina cirúrgica. Remova o músculo que cobre o crânio e exponha completamente o crânio. Use cotonetes estéreis para parar o sangramento durante todo o processo.
4. Seque a superfície do crânio com uma bola de lavagem de orelha para ajudar o cimento dental a aderir firmemente ao crânio. Marque a posição de instalação da haste do crânio (Diâmetro 1.2 mm, Comprimento 3 mm) com um marcador preto (Figura 1, etapa 1). As posições específicas são o ponto da fontanela anterior e quatro outros locais.
5. Use a agulha de uma seringa de 10 mL para girar e perfurar quatro áreas em sequência. Insira quatro unhas do crânio no crânio em sequência, garantindo o contato com o córtex cerebral (Figura 1, etapas 2-3).
   NOTA: Use cotonetes estéreis para absorver o sangue em caso de sangramento para evitar a ferrugem das unhas ósseas.
6. Enrole o fio de prata do eletrodo de EEG ao redor da unha do crânio. Incorpore o eletrodo eletromiográfico no músculo e fixe-o com uma sutura 6-0.
7. Misture a resina da base da prótese com pó de dentadura autoajustável e fixe o eletrodo no crânio. Use uma bola de lavagem de ouvido para soprar ar na superfície do cimento dental para acelerar a cura.
8. Injete 10.000 unidades de penicilina para prevenir infecções. Alojar cada rato em uma gaiola separada para evitar rasgos mútuos e danos aos eletrodos. Injetado por via subcutânea 0,2 mg/kg de meloxicam por três dias consecutivos para aliviar a dor pós-operatória. Aguarde 3 dias para a recuperação de feridas de rato e fixação do eletrodo (Figura 1, etapa 4).

2. Processo cirúrgico do modelo de coma isquêmico cerebral

1. Três dias depois, reanestesiar os ratos e colocá-los em decúbito dorsal. Use bolas de algodão estéreis para desinfetar o local da cirurgia por meio de três aplicações repetidas de iodo seguidas de um enxágue/lenço umedecido com álcool. Faça uma incisão de cerca de 2-3 cm de comprimento com um bisturi da margem superior do esterno longitudinalmente ao longo do meio do pescoço (Figura 1, passo 5).
2. Separe sem rodeios o tecido subcutâneo e o músculo esterno-hióideo, expondo totalmente a traqueia e os músculos longos do pescoço em ambos os lados da traqueia¹⁵.
   NOTA: Evite estimular a traqueia durante todo o procedimento.
3. Separe sem rodeios os músculos longos do pescoço do nível da glândula tireoide para baixo, expondo a primeira e a segunda vértebras cervicais. Expanda a área do pescoço com um dilatador de tecido de rato, expondo totalmente o local da cirurgia.
4. Use uma pinça fina para separar cuidadosamente os músculos e tecidos visíveis no espaço intervertebral cervical, expondo o local característico onde a artéria vertebral entra na primeira vértebra cervical. Pode-se observar que a artéria vertebral passa pela primeira vértebra cervical (Figura 1, passo 6).
   NOTA: Colocar uma seringa de 1 mL sob o pescoço fornece um espaço de manipulação cirúrgica mais claro.
5. Pré-aqueça a caneta de eletrocoagulação e insira-a na área por 3-5 s para garantir que a artéria vertebral seja eletrocoagulada e cortada. Separe os músculos e a fáscia ao longo da borda interna do músculo esternocleidomastóideo, exponha e libere os CCAs bilaterais e dê um nó solto.
   NOTA: A caneta de eletrocoagulação deve ser pré-aquecida; caso contrário, não pode coagular rapidamente a artéria vertebral, levando ao sangramento. Ambas as artérias vertebrais são eletrocoaguladas e nós soltos são amarrados ao redor dos CCAs.
6. Aperte rapidamente o primeiro nó solto para bloquear o fluxo sanguíneo no CCA quando os ratos recuperarem a consciência e exibirem espasmos nos membros, enquanto o detector de EEG detecta sinais ativos de EEG e EMG. Os ratos lutarão por alguns segundos e depois perderão gradualmente a consciência (Figura 1, etapa 7).
7. Depois de liberar a fixação, observe que os membros do rato estão rígidos, o reflexo de endireitamento desaparece, mas a respiração é mantida. Nesse ponto, o eletromiograma (EMG) apresenta uma linha reta, e o EEG é rapidamente suprimido, indicando que o modelo de isquemia cerebral induzida por 4-VO foi bem-sucedido¹⁶.
   NOTA: A depressão respiratória ocorre em alguns ratos durante a ligadura bilateral da CCA. A estimulação mecânica rápida pode restaurar a respiração espontânea em alguns ratos.
8. De acordo com o "método de amarração de controle de agulha¹⁶", amarre o CCA com uma agulha de seringa de 0.5 mm de diâmetro usando fio de náilon 6-0 a cerca de 1.5 cm de distância da bifurcação do CCA, ICA e ECA. Puxe a agulha com cuidado; este segundo nó fará com que a artéria carótida se estreite (Figura 1, passo 8).
   NOTA: A ligadura usada para estenose CCA precisa ser feita de material de nylon, que é estável. O fio de nylon não é afetado pelo sangue e não engrossa; caso contrário, pode causar estenose extrema da ACC em ratos e aumentar a taxa de mortalidade.
9. Após 30 min de isquemia, desatar o primeiro nó, e a ACC sofrerá reperfusão, mas o segundo nó resultará em estenose da ACC, induzindo coma sustentado (Figura 1, passo 9). Feche o tecido subcutâneo com suturas de monofilamento absorvíveis e a pele com suturas de monofilamento não absorvíveis.

3. Recuperação de animais

1. Coloque os ratos em almofadas de isolamento e injete 10.000 unidades de penicilina para prevenir infecções. Injetar 0,2 mg/kg de meloxicam por via subcutânea durante três dias consecutivos para aliviar a dor pós-operatória.
2. Após 60 minutos de reperfusão, certifique-se de que os ratos se recuperem gradualmente.

Resultados

Devido à inflamação e outros estímulos causados pela implantação de eletrodos, o EEG pode ser instável, então os ratos precisam se recuperar por 3 dias. Ratos com EEG e EMG normais após 3 dias podem ser incluídos para a preparação do modelo de coma. Quando os ratos foram anestesiados, a atividade do EEG e EMG foi ligeiramente suprimida, mas prosseguiu suavemente. Não houve alteração significativa na atividade do EEG e EMG após a eletrocoagulação bloqueando os AVs bilate...

Discussão

A oclusão de quatro vasos induz lesão cerebral isquêmica e hipóxica global, que pode simular coma agudo, parada cardíaca, asfixia, choque, arritmia grave e outras condições clínicas críticas causadas por isquemia cerebral na prática clínica. Enquanto isso, a oclusão de quatro vasos pode causar danos principalmente no hipocampo^17,18, que é a principal área funcional do cérebro responsável pela memória cognitiva

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 channel microfiber photoelectrode array	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0 Surgical suture	Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.	B-104
6-0 Surgical suture	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
EEG electrode	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
Electrocoagulation pen	CONPUVON Company	465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging System	Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.	1336
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	180-220g
Skull nail	GLOBALEBIO,LTD	/
Stereotaxic instrument	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA