Zerebrales ischämisches Komamodell, induziert durch modifizierten Vier-Gefäß-Verschluss

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess zur Induktion eines zerebralen ischämischen Komamodells unter Verwendung einer modifizierten Viergefäß-Verschlussmethode.

Zusammenfassung

Das durch zerebrale Ischämie verursachte Koma ist die schwerwiegendste Komplikation der zerebralen Ischämie. Der Verschluss von vier Gefäßen kann ein zerebrales ischämisches Komamodell für die Krankheitsforschung und Arzneimittelentwicklung etablieren. Bei der gebräuchlichen Viergefäß-Verschlussmethode wird jedoch hauptsächlich ein Elektrokoagulationsstift in das beidseitige Foramen pterygoideus des ersten Halswirbels hinter dem Hals eingeführt, um die Wirbelarterien zu elektrokoagulieren. Dieser Prozess birgt das Risiko einer unvollständigen Elektrokoagulation, Blutungen und einer Schädigung des Hirnstamms und des Rückenmarks. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation werden erneut anästhesierte Ratten vor dem Hals einer Karotis-Ligatur unterzogen. Zwei Operationen setzen die Ratten einem höheren Infektionsrisiko aus und verlängern den Versuchszeitraum. In dieser Studie wurde während eines einzigen chirurgischen Eingriffs ein vorderer zervikaler Schnitt verwendet, um die Schlüsselstelle zu lokalisieren, an der die Wirbelarterie in den ersten Halswirbel eindringt. Die beidseitigen Wirbelarterien wurden unter Sehbedingungen elektrokauterisiert, während die beidseitigen Arteria carotis communis durchtrennt wurden, um lose Knoten zu setzen. Als die Gliedmaßen der Ratten zu zucken begannen, wurden die beidseitigen Halsschlagadern schnell ligiert, um ein ischämisches Koma auszulösen. Diese Methode kann das Infektionsrisiko vermeiden, das durch zwei chirurgische Eingriffe verursacht wird, und ist einfach durchzuführen mit einer hohen Erfolgsquote, was eine nützliche Referenz für relevante Behandler darstellt.

Einleitung

Die ischämische Hirnverletzung ist die häufigste Hirnverletzung in der klinischen Praxis und macht etwa 75 % der Fälle von zerebrovaskulären Erkrankungen aus. Ischämie kann zu schweren sekundären Hirnverletzungen und -erkrankungen führen ^1,2, und Koma ist das schwerste Symptom, das durch ischämische hypoxische Hirnverletzungen verursacht wird. Es ist auch der letzte Weg für viele kritische Zustände³. Das Koma ist eine kritische und schwere Erkrankung in der klinischen Praxis, die schwer zu behandeln ist⁴. Je länger das Koma andauert, desto größer ist die potenzielle Gefahr. Sofortiges Erwachen ist das primäre Ziel, um die Verschlechterung und das Fortschreiten des Zustands zu verhindern. Obwohl die Naloxon-Injektion ein breites Spektrum an klinischen Anwendungen zur Förderung der Wachheit hat, hat sie dennoch einige Nebenwirkungen⁵. Daher ist die Entwicklung sicherer und wirksamer wachheitsfördernder Medikamente ein dringendes Problem, das angegangen werden muss. Die Etablierung eines einfachen und leicht zu bedienenden ischämischen Komamodells des Gehirns ist für die Aufklärung der Pathogenese des ischämischen Komas und für die Arzneimittelentwicklung unerlässlich ^6,7,8.

Das Ziel dieser Studie ist es, ein Modell zur Induktion eines globalen ischämischen Komas durch Elektrokoagulation bilateraler Wirbelarterien (VA) und temporärer Ligatur der bilateralen Arteria carotis communis (CCA) vorzustellen, das für Anfänger einfach und benutzerfreundlich ist. Das vorherige Protokoll beinhaltete die Freilegung des beidseitigen Foramen pterygoideus des ersten hinteren Halswirbels während der ersten Operation und das elektrische Brennen des Foramen pterygoideus, um die bilateralen VAs zu blockieren. Eine zweite Operation wurde 24 Stunden später durchgeführt^, um durch Ligatur der bilateralen CCAs 9,10,11,12 ein totales ischämisches Koma zu induzieren. Aufgrund der Unsichtbarkeit besteht jedoch das Risiko einer unvollständigen Elektrokoagulation, Blutungen, Hirnstamm- und Rückenmarksverletzungen sowie einer längeren Versuchsdauer. Daher ist es notwendig, sich mit diesen Fragen zu befassen.

Hier stellen wir eine verbesserte Methode zur Modellierung des ischämischen Komas vor. Der Haupteingriff besteht darin, einen Schnitt im mittleren vorderen Hals vorzunehmen, eine elektrische Resektion der bilateralen VAs unter visuellen Bedingungen durchzuführen und die bilateralen CCAs während einer einzigen Operation kurzzeitig zu ligieren, um die Blutversorgung des gesamten Gehirns zu blockieren, was zu einer schnellen Hemmung des Elektroenzephalogramms (EEG) führt und zum Koma führt. Diese Methode induziert auch ein kurzes kontinuierliches Koma nach der Reperfusion. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen, anfängerfreundlich und reduziert das Risiko einer sekundären Traumainfektion bei Tieren, wodurch die Versuchsdauer verkürzt wird.

Das Protokoll eignet sich für die Untersuchung des globalen ischämischen Komas, das durch einen Herzstillstand verursacht wird. Es ist auch ideal für die Untersuchung von ischämischer Demenz, vor allem, weil der Bereich des Hippocampus-Gehirns extrem empfindlich auf Ischämie reagiert; So kann eine vorübergehende zerebrale Ischämie zu einer Schädigung oder sogar zum Verlust von Hippocampus-Neuronen^{führen 13}, was zu kognitiven Funktionsstörungen führt. Daher kann das Protokoll als Referenz für Praktiker dienen, die zerebrale Ischämie, ischämisches Koma und ischämische Demenz untersuchen.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde in Übereinstimmung mit den Anforderungen des Ausschusses für die Verwendung von Labortieren und der institutionellen Tierpflege und -verwendung an der Universität Foshan (Aktenzeichen: 2023-643656) durchgeführt. Für diese Studie wurden männliche Sprague Dawley (SD) Ratten (200 g ± 20 g, 6-8 Wochen alt) verwendet. Alle Tierforschungsdaten wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) verfasst. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Implantation von EEG-Elektroden

1. Injizieren Sie 15 Minuten vor der Anästhesie 0,05 mg/kg Atropin subkutan, um Atemwegsobstruktion und Erstickung durch Sekrete zu verhindern. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von 20 mg/kg Zoletil und 5 mg/kg Xylazin, um die Ratten zu betäuben¹⁴. Klemmen Sie die Zehen der Ratte mit einer Pinzette fest, um eine tiefe Anästhesie zu bestätigen.
2. Entferne die Haare vom Kopf der Ratte mit einem Haarrasierer. Befestigen Sie den Rattenkopf mit nicht durchdringenden Ohrstangen an einem stereotaktischen Gerät des Gehirns. Tragen Sie mit sterilen Wattebällchen dreimal Ethanol und Povidon-Jod auf die Operationsstelle auf, um die Haut zu desinfizieren.
3. Schneiden Sie die Haut des Rattenkopfes entlang der enthaupteten Naht mit einer chirurgischen Klinge ein. Entfernen Sie den Muskel, der den Schädel bedeckt, und legen Sie den Schädel vollständig frei. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um Blutungen während des gesamten Prozesses zu stoppen.
4. Föhnen Sie die Oberfläche des Schädels mit einer Ohrspülkugel, damit der Zahnzement fest am Schädel haftet. Markieren Sie die Einbauposition des Schädelnagels (Durchmesser 1,2 mm, Länge 3 mm) mit einem schwarzen Marker (Abbildung 1, Schritt 1). Die spezifischen Positionen sind der vordere Fontanellenpunkt und vier weitere Stellen.
5. Verwenden Sie die Nadel einer 10-ml-Spritze, um vier Bereiche nacheinander zu drehen und zu durchbohren. Führen Sie vier Schädelnägel nacheinander in den Schädel ein und stellen Sie dabei den Kontakt mit der Großhirnrinde sicher (Abbildung 1, Schritte 2-3).
   HINWEIS: Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um im Falle von Blutungen Blut aufzunehmen und ein Rosten der Knochennägel zu verhindern.
6. Wickeln Sie den Silberdraht der EEG-Elektrode um den Schädelnagel. Betten Sie die elektromyographische Elektrode in den Muskel ein und fixieren Sie sie mit einer 6-0-Naht.
7. Mischen Sie das Prothesenbasisharz mit selbsthärtendem Prothesenpulver und befestigen Sie die Elektrode am Schädel. Verwenden Sie eine Ohrspülkugel, um Luft auf die Oberfläche des Zahnzementes zu blasen, um die Aushärtung zu beschleunigen.
8. Injizieren Sie 10.000 Einheiten Penicillin, um eine Infektion zu verhindern. Bringen Sie jede Ratte in einem separaten Käfig unter, um ein gegenseitiges Reißen und Beschädigen der Elektroden zu verhindern. 0,2 mg/kg Meloxicam wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen subkutan injiziert, um die postoperativen Schmerzen zu lindern. Warten Sie 3 Tage für die Genesung der Rattenwunden und die Elektrodenfixierung (Abbildung 1, Schritt 4).

2. Chirurgischer Ablauf des zerebralen ischämischen Komamodells

1. Drei Tage später betäuben Sie die Ratten erneut und bringen Sie sie in Rückenlage. Verwenden Sie sterile Wattebällchen, um die Operationsstelle durch dreimalige Anwendungen von Jod zu desinfizieren, gefolgt von einer Alkoholspülung/einem Alkoholwischer. Machen Sie mit einem Skalpell einen ca. 2-3 cm langen Schnitt vom oberen Rand des Brustbeins längs entlang der Halsmitte (Abbildung 1, Schritt 5).
2. Das Unterhautgewebe und der Musculus sternohyoideus werden stumpf getrennt, wobei die Luftröhre und die Musculus longus colli auf beiden Seiten der Luftröhre vollständig freigelegt^{werden 15}.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Luftröhre während des gesamten Eingriffs zu stimulieren.
3. Trennen Sie die Musculus longus colli stumpf von der Höhe der Schilddrüse nach unten, so dass der erste und zweite Halswirbel freigelegt werden. Erweitern Sie den Halsbereich mit einem Rattengewebedilatator, wodurch die Operationsstelle vollständig freigelegt wird.
4. Trennen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Muskeln und das Gewebe, die im Halswirbelraum sichtbar sind, und legen Sie die charakteristische Stelle frei, an der die Wirbelarterie in den ersten Halswirbel eintritt. Es ist zu beobachten, dass die Wirbelarterie durch den ersten Halswirbel verläuft (Abbildung 1, Schritt 6).
   HINWEIS: Wenn Sie eine 1-ml-Spritze unter den Hals legen, erhalten Sie einen klareren Raum für chirurgische Manipulationen.
5. Heizen Sie den Elektrokoagulationsstift vor und führen Sie ihn für 3-5 s in den Bereich ein, um sicherzustellen, dass die Wirbelarterie elektrokoaguliert und durchtrennt wird. Trennen Sie die Muskeln und Faszien entlang der Innenkante des Musculus sternocleidomastoideus, legen Sie die beidseitigen CCAs frei und binden Sie einen lockeren Knoten.
   HINWEIS: Der Elektrokoagulationsstift muss vorgewärmt sein; Andernfalls kann es die Wirbelarterie nicht schnell koagulieren, was zu Blutungen führt. Beide Wirbelarterien sind elektrokoaguliert und um die CCAs werden lose Knoten gebunden.
6. Ziehen Sie schnell den ersten losen Knoten fest, um den Blutfluss im CCA zu blockieren, wenn die Ratten wieder zu Bewusstsein kommen und Zucken der Gliedmaßen zeigen, während der EEG-Detektor aktive EEG- und EMG-Signale erkennt. Die Ratten kämpfen einige Sekunden lang und verlieren dann allmählich das Bewusstsein (Abbildung 1, Schritt 7).
7. Nach dem Lösen der Fixierung ist zu beobachten, dass die Gliedmaßen der Ratte steif sind, der Aufrichtreflex verschwindet, die Atmung jedoch aufrechterhalten wird. Zu diesem Zeitpunkt zeigt das Elektromyogramm (EMG) eine gerade Linie und das EEG wird schnell unterdrückt, was darauf hindeutet, dass das 4-VO-induzierte zerebrale Ischämie-Modell erfolgreich war¹⁶.
   HINWEIS: Atemdepression tritt bei einigen Ratten während der bilateralen CCA-Ligatur auf. Eine schnelle mechanische Stimulation kann bei einigen Ratten die Spontanatmung wiederherstellen.
8. Gemäß der "Nadelkontrollmethode¹⁶" binden Sie den CCA mit einer Spritzennadel mit einem Durchmesser von 0,5 mm unter Verwendung eines 6-0-Nylonfadens etwa 1,5 cm von der Bifurkation von CCA, ICA und ECA entfernt. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus; Dieser zweite Knoten führt in der Folge zu einer Verengung der Halsschlagader (Abbildung 1, Schritt 8).
   HINWEIS: Die Ligatur, die für die CCA-Stenose verwendet wird, muss aus Nylonmaterial bestehen, das stabil ist. Der Nylonfaden wird nicht durch Blut beeinträchtigt und verdickt sich nicht; Andernfalls kann es bei Ratten zu einer extremen Stenose des CCA kommen und die Sterblichkeitsrate erhöhen.
9. Nach 30 Minuten Ischämie, lösen Sie den ersten Knoten, und der CCA wird einer Reperfusion unterzogen, aber der zweite Knoten führt zu einer CCA-Stenose, die ein anhaltendes Koma induziert (Abbildung 1, Schritt 9). Verschließen Sie das Unterhautgewebe mit resorbierbaren monofilen Nähten und die Haut mit nicht resorbierbaren monofilen Nähten.

3. Bergung der Tiere

1. Legen Sie die Ratten auf Isolierpads und injizieren Sie 10.000 Einheiten Penicillin, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Sie 0,2 mg/kg Meloxicam subkutan an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
2. Stellen Sie nach 60 Minuten Reperfusion sicher, dass sich die Ratten allmählich erholen.

Ergebnisse

Aufgrund von Entzündungen und anderen Stimulationen, die durch die Implantation von Elektroden verursacht werden, kann das EEG instabil sein, so dass sich die Ratten 3 Tage lang erholen müssen. Ratten mit normalem EEG und EMG nach 3 Tagen könnten zur Vorbereitung des Komamodells einbezogen werden. Wenn die Ratten anästhesiert wurden, war die EEG- und EMG-Aktivität leicht unterdrückt, verlief aber reibungslos. Es gab keine signifikante Veränderung der EEG- und EMG-Aktivität nach d...

Diskussion

Der Verschluss von vier Gefäßen induziert eine globale ischämische und hypoxische Hirnverletzung, die in der klinischen Praxis akutes Koma, Herzstillstand, Erstickung, Schock, schwere Herzrhythmusstörungen und andere kritische klinische Zustände simulieren kann, die durch zerebrale Ischämie verursacht werden. In der Zwischenzeit kann ein Verschluss von vier Gefäßen zu einer Schädigung vor allem im Hippocampus^{führen 17,18}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 channel microfiber photoelectrode array	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0 Surgical suture	Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.	B-104
6-0 Surgical suture	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
EEG electrode	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
Electrocoagulation pen	CONPUVON Company	465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging System	Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.	1336
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	180-220g
Skull nail	GLOBALEBIO,LTD	/
Stereotaxic instrument	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA