可逆性单侧输尿管梗阻的未成熟小鼠模型

摘要

本方案描述了单侧输尿管梗阻的循序渐进、可重复的模型。

摘要

单侧输尿管梗阻 （UUO） 是慢性肾脏病 （CKD） 的常见原因，导致肾间质纤维化进展，最终导致不可逆的肾损伤。缓解 UUO 至关重要。文献中已经建立了几种可逆性单侧输尿管梗阻 （RUUO） 的动物模型，能够观察结构变化和功能损伤，同时还可以模拟输尿管梗阻缓解后的生理和病理生理变化。在本研究中，使用硅胶管在单侧小鼠输尿管中建立了可逆性梗阻模型。在梗阻缓解之前观察到明显的肾损伤，之后观察到部分恢复。与 UUO 不同，该模型可防止进行性肾积水，从而导致不同的病理结果。这种简单的外科手术显示出很高的成功率，并有望成为研究可逆性梗阻性肾病和肾间质纤维化潜在治疗方法的经典模型。此外，它为研究阻塞性肾病的恢复机制、肾细胞再生和组织重塑提供了一个实用平台。

引言

尿道梗阻显着导致肾间质纤维化和慢性肾病 （CKD），可能导致肾脏不可逆的结构损伤和功能障碍¹。虽然单侧输尿管梗阻 （UUO） 被广泛用于研究肾损伤和 CKD，但它并不能准确复制梗阻清除后发生的自发恢复机制。UUO 模型涉及用缝合线结扎左输尿管，导致永久性梗阻、输尿管扩张、肾积水、肾实质压迫和皮质变薄。组织学检查通常显示肾小管扩张、肾小管上皮细胞坏死和进行性间质炎症和纤维化²。该模型主要研究肾间质纤维化和由于持续性梗阻引起的不可逆肾功能丧失。

然而，临床上遇到的许多肾脏疾病，如输尿管结石或肿瘤引起的梗阻，都是可逆的。可逆性单侧输尿管梗阻 （RUUO） 模型允许部分恢复肾脏结构和尿路功能，最终解决肾积水。可以通过成像技术、组织学检查和生物标志物分析来评估恢复情况，以量化肾损伤和纤维化的减少³。该模型在临床环境中密切模拟阻塞性肾病的恢复阶段，比 UUO 更适合研究炎症、免疫反应、细胞再生和组织重塑等关键过程 4,5,6,7,8。

RUUO 模型使研究人员能够分析损伤缓解后的肾脏修复和再生，解决了 UUO 在动态研究中的局限性。通过比较梗阻前后的不同时间点，研究人员可以研究参与损伤和修复的分子途径，包括炎症、细胞凋亡、纤维化和再生。这种方法增强了对肾脏恢复机制的理解，并确定了潜在的治疗靶点 2,3,4,5,8,9,10。虽然肾纤维化通常被认为是不可逆的，但临床观察表明，在纤维化初期早期缓解梗阻可能会阻止甚至逆转疾病进展。RUUO 模型为研究这种现象提供了一个有价值的实验平台¹¹。

此外，RUUO 模型有助于研究梗阻缓解后纤维化逆转，为恢复机制和潜在的抗纤维化疗法提供见解 ^3,4。因此，该模型对于转化研究非常实用。该实验模型的主要目标是通过输尿管插管诱导梗阻性肾病，然后在预定义的时间点进行标准化缓解以确保一致性。它针对简单性、可重复性和安全性进行了优化，使其成为实验研究的有效工具。

研究方案

这项动物研究遵循了《赫尔辛基宣言》的指导方针，并获得了重庆医科大学附属儿童医院研究伦理委员会的批准。共获得 27 只雄性 Sprague Dawley （SD） 大鼠，饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心（SPF，许可证号：SYXK（重庆）2007-0016）。大鼠维持在受控温度条件下，光照/黑暗循环 12 小时，并可以 随意 获取食物和水。

该方案是在 6-8 周龄的雄性 SD 大鼠上进行的，适用于具有双侧输尿管的所有年龄的大鼠。本研究将 15 只 6 周龄雄性 SD 大鼠随机分为 3 组：天然组 （n = 5）、UUO 组 （n = 5） 和 RUUO 组 （n = 5）。此外，包括 5 只 8 周龄 SD 大鼠 （n = 5） 作为附加对照组。为了建立 RUUO 模型，使用了 12 只大鼠，并额外购买了 7 只大鼠，以考虑潜在风险，例如术中和术后死亡率、手术失败、不完全梗阻和逆转不成功。这确保了每组至少 5 只大鼠用于后续分析。

所有外科手术均严格按照机构和国家实验动物护理和使用指南进行。手术人员遵守个人防护设备 （PPE） 协议，包括外科口罩、手套和防护服。每个程序都使用无菌手术器械，并在使用前后进行高压灭菌以保持无菌。包括尖锐物品和生物标本在内的废料按照危险废物管理协议进行处理，以降低污染风险并确保安全。

1. 动物和器械的准备

1. 使用无菌（高压灭菌）器械和耗材执行所有程序。将消毒过的硅胶管（内径：1.5 毫米，外径：2.5 毫米）切成约 1 厘米的段。沿管壁的一侧做一个纵向切口，以备后续使用。
2. 通过腹膜内注射戊巴比妥 （40 mg/kg） 麻醉大鼠（遵循机构批准的方案）。通过检查脚趾捏合时是否有反射反应（例如踏板撤退反射），确认麻醉充分。将兽用眼药膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 将大鼠的腹部从剑突分离到耻骨联合，并向双侧延伸至中线。
4. 将大鼠仰卧在加热的手术垫上，并用橡胶绳固定其四肢。
5. 覆盖无菌开孔床单以保持无菌区域。用聚维酮碘溶液准备皮肤。沿腹部做一个中线皮肤切口，从剑突下区域延伸到脐部正下方，以提供肾脏和输尿管上部的充分暴露。
6. 使用手术剪刀沿中线切开皮下组织和筋膜。逐层细致地解剖皮肤和皮下组织，并使用组织钳充分暴露腹膜后间隙。

2. 可逆性单侧输尿管梗阻的梗阻手术

1. 使用无菌拭子将肠道缩回腹腔右侧，以便于直接观察左输尿管。用浸有盐水的纱布覆盖输尿管，以防止干燥。
2. 使用显微镊子解剖和动员左输尿管，从周围组织释放约 1.5 cm。
3. 将一根 1 厘米长的硅胶管（内径：1.5 毫米，外径：2.5 毫米）放在释放的输尿管下方。使用镊子确保完全包裹在管内。
4. 用 3-0 丝线结扎硅胶管和输尿管中部，以诱发输尿管梗阻。避免过度的结扎力。沿输尿管的纵轴逐渐拉动硅胶管，以确保安全但防滑的结扎。
5. 小心地将肠道重新定位在腹膜腔内，确保正确对齐而没有张力或阻塞。
6. 使用 2-0 不可吸收缝合线和弯曲的切割针连续缝合腹部肌肉和筋膜层，以提供足够的抗拉强度。用 4-0 不可吸收缝合线闭合皮肤，确保解剖对齐和均匀张力，以促进愈合并最大限度地降低伤口裂开的风险。
7. 用聚维酮碘溶液对切口部位进行消毒。让大鼠在受控条件下在恒温下恢复 7 天。

3. 可逆性单侧输尿管梗阻的缓解手术

1. 准备必要的动物和器械，确保无菌设置以重新打开腹部和完全暴露腹腔。
2. 使用手术刀刀片仔细解剖硅胶管的结。取出管子并用生理盐水冲洗腹腔，以尽量减少粘连和感染风险。
3. 重新定位肠道并使用 4-0 不可吸收缝合线分层缝合腹壁切口。用聚维酮碘溶液对切口部位进行消毒。将大鼠置于受控温度环境中，进行术后 7 天的恢复期。
4. 在术后第 14 天，麻醉大鼠（按照步骤 1.2 中提到的程序）并通过将肾脏横向切成两半来收集肾脏样本⁹。
5. 将一半储存在 4% 多聚甲醛中用于组织病理学检查，并将另一半快速冷冻在液氮中，在 -80 °C 下储存用于后续分子分析。采集血液样本进行生化分析。
6. 按照道德准则 通过 CO₂ 窒息进行安乐死，然后进行颈椎脱位。

4. 随访评估

1. 跟踪 RUUO 后的体重以评估整体恢复情况。将体重变化与对照组和 UUO 组进行比较。
2. 测量肾脏重量和肾脏体积以评估肾脏恢复情况。
3. 监测血清肌酐 （Scr） 水平作为肾功能改善的指标⁹.
4. 将亚甲蓝注射到肾盂中，以确认输尿管通畅。观察输尿管蠕动和颜色变化，以评估梗阻后恢复情况。
5. 进行 H&E 染色以评估 RUUO ^8,10 后的肾小管完整性和肾脏结构。
6. 进行 Masson 三色染色以评估肾间质纤维化消退 ^8,10。
7. 比较 UUO 组和 RUUO 组之间的肾损伤评分 ^3,8 以量化组织恢复。

结果

评估了 UUO 及其随后的释放 （RUUO） 对体重、肾脏重量、肾脏体积和血清肌酐 （Scr） 水平的影响，如 表 1 所示。数据以平均值±标准差 （SD） 表示，每组 n = 5。

6 周时，天然组的平均体重为 234 g ± 16 g，肾脏重量为 0.9107 g ± 0.0475 g，肾脏体积为 0.8962 cm³ ± 0.0502 cm³。到 8 周时，对照组体重 （291 g ± 20 g，P < 0.05）、肾脏重量 （1.1443...

讨论

该模型采用硅胶管环绕输尿管，提供结构支撑，然后用丝线结扎，通过压迫诱导完全输尿管阻塞。7 天后，移除结扎和硅胶管，以促进肾脏减压和恢复尿路完整性和功能。

硅胶管由有机硅弹性体制成，具有出色的柔韧性、生物相容性、耐化学性和热稳定性。医用级硅橡胶专为需要卓越机械性能的应用而设计，包括长期植入，而普通硅胶管则包含一系?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030