可逆的片側尿管閉塞の未熟マウスモデル

要約

本プロトコルは、単行尿管閉塞の段階的な再現可能なモデルを記述しています。

要約

片側性尿管閉塞(UUO)は、慢性腎臓病(CKD)の一般的な原因であり、腎間質性線維症の進行につながり、最終的には不可逆的な腎障害を引き起こします。UUOの軽減は非常に重要です。可逆的片側尿管閉塞(RUUO)のいくつかの動物モデルが文献で確立されており、構造変化と機能損傷の観察を可能にし、尿管閉塞の緩和後の生理学的および病態生理学的変化をシミュレートします。本研究では、シリコンチューブを用いて片側マウス尿管に可逆的閉塞モデルを確立した。閉塞の軽減前に重大な腎障害が観察され、その後に部分的な回復が認められました。UUOとは異なり、このモデルは進行性の水腎症を予防し、明確な病理学的結果をもたらします。この簡単な外科的処置は高い成功率を示しており、可逆性閉塞性腎症および腎間質性線維症の潜在的な治療法を調査するための古典的なモデルとして有望です。さらに、閉塞性腎症からの回復、腎細胞再生、および組織リモデリングのメカニズムを研究するための実用的なプラットフォームを提供します。

概要

尿道閉塞は、腎間質性線維症や慢性腎臓病(CKD)の大きな原因となり、腎臓に不可逆的な構造的損傷や機能障害をもたらす可能性があります¹。片側尿管閉塞(UUO)は、腎障害やCKDの研究に広く使用されていますが、閉塞の除去後に発生する自然回復メカニズムを正確に再現するものではありません。UUOモデルでは、左尿管を縫合糸で結紮し、永久閉塞、尿管拡張、水腎症、腎実質の圧迫、皮質の菲薄化を引き起こします。組織学的検査では、通常、尿細管拡張、尿細管上皮細胞壊死、進行性間質性炎症および線維症が明らかになります²。このモデルは、主に腎間質性線維症と持続的な閉塞による不可逆的な腎機能喪失を調査します。

しかし、尿管結石や腫瘍による閉塞など、臨床診療で遭遇する多くの腎疾患は可逆的です。可逆的片側尿管閉塞(RUUO)モデルは、腎臓の構造と尿路機能の部分的な回復を可能にし、最終的に水腎症を解消します。回復は、画像技術、組織学的検査、およびバイオマーカー分析を通じて評価でき、腎障害と線維症の減少を定量化できます³。このモデルは、臨床現場での閉塞性腎症の回復段階を厳密に模倣しており、炎症、免疫応答、細胞再生、組織リモデリングなどの主要なプロセスを研究するためにUUOよりも適しています4,5,6,7,8。

RUUOモデルにより、研究者は損傷緩和後の腎臓の修復と再生を解析し、動的研究におけるUUOの限界に対処することができます。閉塞の前後の異なる時点を比較することで、研究者は炎症、アポトーシス、線維症、再生など、損傷と修復に関与する分子経路を調査できます。このアプローチにより、腎回復メカニズムの理解が深まり、潜在的な治療標的^が特定されます 2,3,4,5,8,9,10。腎線維症はしばしば不可逆的であると考えられていますが、臨床観察は、初期の線維化段階での閉塞の早期緩和が疾患の進行を止めるか、さらには逆転させる可能性があることを示唆しています。RUUOモデルは、この現象を調査するための貴重な実験プラットフォームを提供します¹¹。

さらに、RUUOモデルは、閉塞緩和後の線維症の逆転の研究を容易にし、回復メカニズムと潜在的な抗線維化療法に関する洞察を提供します^3,4。したがって、このモデルはトランスレーショナルリサーチに非常に実用的です。この実験モデルの主な目的は、尿管カニューレ挿入を通じて閉塞性腎症を誘発し、その後、一貫性を確保するために事前定義された時点で標準化された緩和を行うことです。シンプルさ、再現性、安全性が最適化されているため、実験研究に有効なツールとなっています。

プロトコル

この動物実験は、ヘルシンキ宣言のガイドラインに準拠し、重慶医科大学小児病院の研究倫理委員会によって承認されました。合計27匹の雄のSprague Dawley(SD)ラットが商業的に入手され、重慶医科大学小児病院実験動物センター(SPF、ライセンス番号:SYXK(重慶)2007-0016)に収容されました。ラットは、12時間の明暗サイクルで制御された温度条件下で維持され、食物と水に 自由 にアクセスできました。

このプロトコルは、6〜8週齢の雄SDラットで実施され、両側尿管を持つすべての年齢のラットに適用できます。本研究では、6週齢の雄SDラット15匹を、ネイティブグループ(n = 5)、UUOグループ(n = 5)、RUUOグループ(n = 5)の3つのグループにランダムに割り当てた。さらに、5匹の8週齢のSDラット(n = 5)を追加の対照群として含めました。RUUO モデルを確立するために、12 匹のラットを使用し、術中および術後の死亡率、外科的失敗、不完全な閉塞、失敗した逆転などの潜在的なリスクを考慮して、さらに 7 匹のラットを調達しました。これにより、その後の分析のために、グループごとに最低5匹のラットが確保されました。

すべての外科的処置は、実験動物の世話と使用に関する施設および国のガイドラインに厳密に従って行われました。外科スタッフは、サージカルマスク、手袋、ガウンなどの個人用保護具(PPE)プロトコルを順守しました。各処置には滅菌手術器具を使用し、使用前と使用後にオートクレーブ滅菌して無菌性を維持しました。鋭利物や生体試料などの廃棄物は、汚染リスクを軽減し、安全性を確保するために、有害廃棄物管理プロトコルに準拠して処分されました。

1. 動物と器具の準備

1. すべての手順は、滅菌済み(オートクレーブ済み)の器具と消耗品を使用して行ってください。滅菌したシリコンチューブ(内径1.5mm、外径2.5mm)を約1cmのセグメントにカットします。その後の使用のために、チューブ壁の片側に沿って縦方向に切開します。
2. ペントバルビタール (40 mg/kg) の腹腔内注射 により ラットに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。つま先をつまんだときに、ペダルの引きこもり反射などの反射反応がないことを確認して、適切な麻酔を確認します。麻酔中の角膜の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を目に塗布します。.
3. ラットの腹部を剣状突起から恥骨結合まで脱毛し、正中線まで両側に伸ばします。
4. ラットを加熱された手術用パッドの仰臥位に置き、ゴム製のロープで手足を固定します。
5. 滅菌フィールドを維持するために、滅菌穴あきシートをドレープします。ポビドンヨード溶液で皮膚を準備します。腹部に沿って正中線の皮膚切開を行い、剣状突起下領域から臍のすぐ下まで伸びて、腎臓と上部尿管が適切に露出するようにします。
6. 手術用ハサミを使用して、正中線に沿って皮下組織と筋膜を切開します。皮膚とその下にある組織を層ごとに細心の注意を払って解剖し、組織鉗子を使用して後腹膜腔を完全に露出させます。

2. 可逆性片側尿管閉塞に対する閉塞手術

1. 滅菌綿棒を使用して腸を腹腔の右側に引っ込め、左尿管の直接視覚化を容易にします。尿管を生理食塩水に浸したガーゼで覆い、乾燥を防ぎます。
2. 顕微鏡的鉗子を使用して左尿管を解剖し、周囲の組織から約1.5cm解放します。
3. 長さ1cmのシリコンチューブ(内径1.5mm、外径2.5mm)を遊離尿管の下に置きます。鉗子を使用して、チューブ内に完全に包まれていることを確認します。
4. シリコンチューブと尿管の中央部を3-0シルク糸で結紮し、尿管閉塞を誘発します。過度の結紮力を避けてください。シリコンチューブを尿管の縦軸に沿って徐々に引っ張り、しっかりと滑りにくい結紮を確保します。
5. 腸を腹腔内に慎重に再配置し、張力や障害物のない適切な位置合わせを確保します。
6. 2-0の非吸収性縫合糸と湾曲した切断針を連続的に使用して、腹筋層と筋膜層を縫合し、適切な引張強度を提供します。4-0の非吸収性縫合糸で皮膚を閉じ、解剖学的なアライメントと均一な張力を確保して治癒を促進し、創傷裂開のリスクを最小限に抑えます。
7. 切開部位をポビドンヨード溶液で消毒します。ラットを一定の温度で7日間制御された条件下で回復させます。

3. 可逆的片側尿管閉塞の緩和手術

1. 必要な動物や器具を準備し、腹部の再開と腹腔の完全な露出のための無菌状態を確保します。
2. メスの刃を使用して、シリコンチューブの結び目を慎重に解剖します。チューブを取り外し、通常の生理食塩水で腹腔を洗浄して、癒着と感染のリスクを最小限に抑えます。
3. 腸の位置を変え、腹壁切開部を4-0非吸収性縫合糸を使用して層状に縫合します。切開部位をポビドンヨード溶液で滅菌します。ラットを制御された温度環境に置き、術後7日間の回復期間を過ごします。
4. 術後14日目に、ラットに麻酔をかけ(ステップ1.2で述べた手順に従って)、腎臓を横切開して腎臓サンプルを2つの半分⁹に切断して採取する。
5. 半分を4%パラホルムアルデヒドで保存して病理組織学的検査を行い、残りの半分を液体窒素で急速凍結して-80°Cで保存し、その後の分子分析に役立てます。生化学分析のために血液サンプルを採取します。
6. CO₂ 窒息による安楽死と、それに続く倫理ガイドラインに従って子宮頸部脱臼を行います。

4. フォローアップ評価

1. RUUO後の体重を追跡して、全体的な回復を評価します。体重の変化を対照グループとUUOグループで比較します。
2. 腎臓の体重と腎臓の体積を測定して、腎臓の回復を評価します。
3. 腎機能改善の指標として血清クレアチニン(Scr)レベルをモニターします⁹。
4. 腎盂にメチレンブルーを注入して、尿管の開存性を確認します。尿管の蠕動運動と着色を観察して、閉塞後の回復を評価します。
5. H&E染色を実施して、RUUO ^8,10後の尿細管の完全性と腎構造を評価します。
6. Massonのトリクローム染色を実施して、腎間質性線維症の退縮を評価します^8,10。
7. UUOグループとRUUOグループの間で腎障害スコア^3,8を比較して、組織の回復を定量化します。

結果

表1に要約されているように、UUOおよびその後の放出(RUUO)が体重、腎臓重量、腎臓容積、および血清クレアチニン(Scr)レベルに及ぼす影響を評価した。データは平均±標準偏差(SD)として表され、グループごとにn = 5です。

6週間後、ネイティブグループの平均体重は234 g±16 g、腎臓重量は0.9107 g±0.0475 g、腎臓容積は0.8962 cm³±0.0502 cm³でし...

ディスカッション

このモデルは、尿管を囲むためにシリコーンチューブを使用して構造的なサポートを提供し、その後、絹糸で結紮して圧縮によって完全な尿管閉塞を誘発します。7日後、結紮とシリコンチューブを取り外して、腎臓の減圧と尿路の完全性と機能の回復を促進します。

シリコーンエラストマーから製造されたシリコーンチューブは、優れた柔軟性...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030