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요약

본 프로토콜은 편측 요관 폐색의 단계적이고 재현 가능한 모델을 설명합니다.

초록

편측성 요관 폐쇄(UUO)는 만성 신장 질환(CKD)의 흔한 원인으로, 신장 간질성 섬유증의 진행을 초래하고 궁극적으로 돌이킬 수 없는 신장 손상을 초래합니다. UUO의 완화는 매우 중요합니다. 가역적 편측 요관 폐색(RUUO)에 대한 여러 동물 모델이 문헌에 확립되어 구조적 변화 및 기능적 손상을 관찰하는 동시에 요관 폐색의 완화에 따른 생리학적 및 병태생리학적 변화를 시뮬레이션할 수 있습니다. 본 연구에서는 실리콘 튜브를 이용하여 편측 쥐 요관에 가역적 폐색 모델을 확립하였다. 폐색이 완화되기 전에 상당한 신장 손상이 관찰되었으며, 그 후 부분적인 회복이 관찰되었다. UUO와 달리 이 모델은 진행성 신증을 예방하여 뚜렷한 병리학적 결과를 초래합니다. 이 간단한 수술은 높은 성공률을 보여주며 가역적 폐쇄성 신병증 및 신장 간질성 섬유증에 대한 잠재적 치료법을 조사하기 위한 고전적인 모델로서 유망합니다. 또한 폐쇄성 신병증, 신세포 재생 및 조직 리모델링의 회복 메커니즘을 연구하기 위한 실용적인 플랫폼을 제공합니다.

서문

요도 폐색은 신장 간질성 섬유증(interstitial fibrosis)과 만성 신장 질환(chronic kidney disease, CKD)을 유발하며, 잠재적으로 신장의 돌이킬 수 없는 구조적 손상과 기능 장애를 초래할 수 있다1. 편측성 요관 폐쇄(UUO)는 신장 손상 및 CKD를 연구하는 데 널리 사용되지만, 폐색체 제거 후 발생하는 자발적 회복 메커니즘을 정확하게 복제하지는 않습니다. UUO 모델은 좌측 요관을 봉합사로 결찰하여 영구적인 폐색, 요관 확장, 신증, 신장 실질 압박 및 피질 얇아짐을 초래합니다. 조직학적 검사에서는 일반적으로 세뇨관 확장, 세뇨관 상피 세포 괴사, 진행성 간질 염증 및 섬유증이 밝혀진다2. 이 모델은 주로 신장 간질성 섬유증과 지속적인 폐색으로 인한 비가역적 신장 기능 상실을 조사합니다.

그러나 요관 결석이나 종양으로 인한 폐색과 같이 임상 실습에서 접하는 많은 신장 질환은 되돌릴 수 있습니다. 가역적 편측 요관 폐쇄(RUUO) 모델은 신장 구조와 요로 기능의 부분적 복원을 허용하여 궁극적으로 신증을 해결합니다. 영상 기법, 조직학적 검사 및 바이오마커 분석을 통해 회복을 평가하여 신장 손상 및 섬유증의 감소를 정량화할 수 있습니다3. 이 모델은 임상 환경에서 폐쇄성 신병증의 회복 단계를 밀접하게 모방하며 염증, 면역 반응, 세포 재생 및 조직 리모델링과 같은 주요 과정을 연구하는 데 UUO보다 더 적합합니다 4,5,6,7,8.

RUUO 모델을 통해 연구자들은 부상 완화 후 신장 복구 및 재생을 분석하여 동적 연구에서 UUO의 한계를 해결할 수 있습니다. 폐색 전후의 다양한 시점을 비교함으로써 연구자들은 염증, 세포사멸, 섬유증 및 재생을 포함하여 손상 및 복구와 관련된 분자 경로를 조사할 수 있습니다. 이 접근법은 신장 회복 메커니즘에 대한 이해를 높이고 잠재적인 치료 표적을 식별합니다 2,3,4,5,8,9,10. 신장 섬유증은 종종 돌이킬 수 없는 것으로 간주되지만, 임상 관찰에 따르면 초기 섬유증 단계에서 폐색이 조기에 완화되면 질병 진행을 멈추거나 역전시킬 수 있습니다. RUUO 모델은 이러한 현상을 조사하기 위한 귀중한 실험 플랫폼을 제공합니다11.

또한, RUUO 모델은 폐색 완화 후 섬유증 역전의 연구를 촉진하여 회복 메커니즘과 잠재적인 항섬유화 요법에 대한 통찰력을 제공합니다 3,4. 결과적으로 이 모델은 중개 연구에 매우 실용적입니다. 이 실험 모델의 주요 목적은 요관 삽관술을 통해 폐쇄성 신병증을 유도한 다음 일관성을 보장하기 위해 미리 정의된 시점에서 표준화된 완화를 수행하는 것입니다. 단순성, 재현성 및 안전성에 최적화되어 있어 실험 연구에 효과적인 도구입니다.

프로토콜

이 동물 연구는 헬싱키 선언의 지침을 준수했으며 충칭 의과 대학 아동 병원 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 총 27마리의 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐를 상업적으로 획득하여 충칭 의과대학 아동병원 실험동물센터(SPF, 라이선스 번호: SYXK (Chongqing) 2007-0016)에 보관했습니다. 쥐는 12시간의 라이트/다크 사이클로 제어된 온도 조건에서 유지되었으며 음식과 물에 임시로 접근할 수 있었습니다.

이 프로토콜은 6-8주 령의 수컷 SD 쥐를 대상으로 수행되었으며 양측 요관이 있는 모든 연령의 쥐에 적용할 수 있습니다. 이 연구에서는 6주 된 수컷 SD 쥐 15마리를 토착 그룹(n = 5), UUO 그룹(n = 5), RUUO 그룹(n = 5)의 세 그룹에 무작위로 할당했습니다. 또한, 8주 된 SD 쥐 5마리(n=5)를 추가 대조군으로 포함시켰다. RUUO 모델을 확립하기 위해 12마리의 쥐를 사용했으며, 수술 중 및 수술 후 사망률, 수술 실패, 불완전한 폐색 및 실패한 역전과 같은 잠재적 위험을 설명하기 위해 7마리의 쥐를 추가로 조달했습니다. 이를 통해 후속 분석을 위해 그룹당 최소 5마리의 쥐를 확보할 수 있었습니다.

모든 수술 절차는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 및 국가 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 수술진은 수술용 마스크, 장갑, 가운을 포함한 개인 보호 장비(PPE) 프로토콜을 준수했습니다. 각 절차에는 멸균 수술 기구가 사용되었으며 무균 상태를 유지하기 위해 사용 전후에 고압멸균 처리되었습니다. 날카로운 물건 및 생물학적 표본을 포함한 폐기물은 오염 위험을 완화하고 안전을 보장하기 위해 유해 폐기물 관리 프로토콜에 따라 처리되었습니다.

1. 동물 및 기구 준비

  1. 멸균(오토클레이브) 기구 및 소모품을 사용하여 모든 절차를 수행합니다. 멸균된 실리콘 튜브(내경: 1.5mm, 외경: 2.5mm)를 약 1cm 크기로 자릅니다. 나중에 사용할 수 있도록 튜브 벽의 한쪽을 따라 세로로 절개합니다.
  2. 펜토바르비탈(40mg/kg)의 복강내 주사를 통해 쥐를 마취합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 발가락이 꼬집힐 때 페달 철수 반사와 같은 반사 반응이 없는지 확인하여 적절한 마취를 확인하십시오. 마취 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 수의학 안과 연고를 눈에 바르십시오.
  3. 쥐의 복부를 xiphoid process에서 치골 symphysis까지 제모하고 양측으로 정중선까지 확장하십시오.
  4. 가열된 수술 패드 위에 쥐를 누운 자세로 놓고 고무 로프로 팔다리를 고정합니다.
  5. 멸균 필드를 유지하기 위해 멸균 천공 시트를 드레이핑합니다. 포비돈 요오드 용액으로 피부를 준비합니다. 복부를 따라 정중선 피부를 절개하여 배꼽 바로 아래까지 확장하여 신장과 상부 요관이 적절하게 노출되도록 합니다.
  6. 수술용 가위를 사용하여 정중선을 따라 피하 조직과 근막을 절개합니다. 피부와 기저 조직을 층층이 꼼꼼하게 절개하고 조직 겸자를 사용하여 후복막 공간을 완전히 노출시킵니다.

2. 가역적 편측 요관 폐색에 대한 폐쇄 수술

  1. 좌측 요관을 직접 볼 수 있도록 멸균 면봉을 사용하여 장을 복강 오른쪽으로 후퇴시킵니다. 건조를 방지하기 위해 식염수에 적신 거즈로 요관을 덮습니다.
  2. 현미경 겸자를 사용하여 좌측 요관을 절개하고 동원하여 주변 조직으로부터 약 1.5cm를 분리합니다.
  3. 1cm 길이의 실리콘 튜브(내경: 1.5mm, 외경: 2.5mm)를 비우는 요관 아래에 놓습니다. 집게를 사용하여 튜브 내부를 완전히 감싸십시오.
  4. 실리콘 튜브와 요관의 중간 부분을 3-0 명사를 사용하여 접합하여 요관 폐색을 유도합니다. 과도한 접합력을 피하십시오. 요관의 세로축을 따라 실리콘 튜브를 서서히 당겨 안전하지만 미끄러지지 않는 결찰을 보장합니다.
  5. 복막강 내에서 장을 조심스럽게 재배치하여 긴장이나 방해 없이 적절한 정렬을 보장합니다.
  6. 2-0 비흡수성 봉합사와 구부러진 절단 바늘을 사용하여 복부 근육과 근막층을 연속적으로 봉합하여 적절한 인장 강도를 제공합니다. 4-0 비흡수성 봉합사로 피부를 닫고 해부학적 정렬과 균일한 긴장을 보장하여 치유를 촉진하고 상처 탈락의 위험을 최소화합니다.
  7. 절개 부위를 포비돈 요오드 용액으로 소독합니다. 쥐가 7일 동안 일정한 온도에서 통제된 조건에서 회복할 수 있도록 합니다.

3. 가역적 편측 요관 폐색의 완화 수술

  1. 필요한 동물과 기구를 준비하여 복부 재개방 및 복강의 완전한 노출을 위한 멸균 설정을 보장합니다.
  2. 메스 칼날을 사용하여 실리콘 튜브의 매듭을 조심스럽게 절개합니다. 튜브를 제거하고 복강에 생리식염수를 세척하여 유착 및 감염 위험을 최소화합니다.
  3. 장의 위치를 조정하고 4-0 비흡수성 봉합사를 사용하여 복벽 절개 부위를 여러 겹으로 봉합합니다. 절개 부위를 포비돈 요오드 용액으로 소독합니다. 수술 후 7일의 회복 기간 동안 쥐를 온도가 조절된 환경에 두십시오.
  4. 수술 후 14일째에 쥐를 마취하고(1.2단계에서 언급한 절차에 따라) 신장을 두 반으로 가로로 절편하여 신장 샘플을 채취한다9.
  5. 조직 병리학 검사를 위해 4 % 파라 포름 알데히드에 절반을 보관하고 후속 분자 분석을 위해 -80 °C에서 보관하기 위해 다른 절반을 액체 질소에 빠르게 동결시킵니다. 생화학 분석을 위한 혈액 샘플을 수집합니다.
  6. CO2 질식을 통한 안락사를 수행한 후 윤리 지침에 따라 자궁경부 탈구를 수행합니다.

4. 후속 평가

  1. RUUO 후 체중을 추적하여 전반적인 회복을 평가합니다. 체중 변화를 대조군 및 UUO 그룹과 비교합니다.
  2. 신장 무게와 신장 용적을 측정하여 신장 회복을 평가합니다.
  3. 신장 기능 개선의 지표로 혈청 크레아티닌(Scr) 수치 모니터링9.
  4. 메틸렌 블루를 신장 골반에 주입하여 요관 개통을 확인합니다. 요관 연동 운동과 착색을 관찰하여 폐색 후 회복을 평가합니다.
  5. RUUO 8,10 이후 세뇨관 무결성 및 신장 구조를 평가하기 위해 H&E 염색을 수행합니다.
  6. 신장 간질성 섬유증 퇴행을 평가하기 위해 Masson의 삼색 염색을 실시합니다 8,10.
  7. 조직 회복을 정량화하기 위해 UUO와 RUUO 그룹 간의 신장 손상 점수 3,8을 비교합니다.

결과

표 1에 요약된 바와 같이 체중, 신장 중량, 신장 용적 및 혈청 크레아티닌(Scr) 수치에 대한 UUO 및 후속 방출(RUUO)의 효과를 평가했습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되며 그룹당 n = 5입니다.

6주가 되었을 때 토착 그룹은 평균 체중 234g ± 16g, 신장 체중 0.9107g ± 0.0475g, 신장 부피 0.8962cm³ ± 0.0502cm³를 보였습니다. 8주가 지났을 때, ?...

토론

이 모델은 실리콘 튜브를 사용하여 요관을 둘러싸고 구조적 지지를 제공한 다음 견주실로 결찰하여 압박을 통해 요관을 완전히 폐쇄합니다. 7일 후, 신장 감압술과 요로 무결성 및 기능 회복을 촉진하기 위해 결찰과 실리콘 튜브를 제거합니다.

실리콘 엘라스토머로 제조된 실리콘 튜브는 뛰어난 유연성, 생체 적합성, 내화학성 및 열 안정성을 제공합?...

공개

없음.

감사의 말

이 작업은 충칭 의과대학(Chongqing Medical University, W0056), 충칭 과학 및 보건 공동 TCM 기술 혁신 및 응용 개발 프로젝트(2020ZY023877)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ForcepsShanghai Medical Devices Co.,Ltd20220032
GauzeSichuan Kelun Co., Ltd20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain KitSolarbioG1120
Insulin needlesKDL Medical Devices20193140938
Masson’s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
Medical Cotton ballsSichuan Kelun Co., Ltd20170037
Medical Cotton sticksSichuan Kelun Co., Ltd20172140026
Methylene blueTianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory14038-43-8
Microscopic forcepsSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS50985
Needle holdersSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS7005
Povidone-iodine SolutionSichuan Kelun Co., Ltd514001
SalineSichuan Kelun Co., Ltd20220004
SD RatsSPF(Beijing)Biotechnology Co.,LtdD025
Silicone tubingTaizhou Chunshi New Materials Co., LtdCS356
Silk suture Qiangsheng Medical Devices Co.,LtdSA84G
Surgical bladeHuanan Yunyue Medical Devices Co.,LtdCE0434
Surgical scissorsShanghai Medical Devices Co.,LtdJ21130
SyringeTongmai medical devices20183140304
Tissue ForcepsJiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., LtdJ36030

참고문헌

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