Un modello murino immaturo di ostruzione ureterale unilaterale reversibile

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un modello passo-passo riproducibile di ostruzione ureterale unilaterale.

Abstract

L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è una causa comune di malattia renale cronica (CKD), che porta alla progressione della fibrosi interstiziale renale e, infine, a danno renale irreversibile. L'attenuazione dell'UUO è fondamentale. In letteratura sono stati stabiliti diversi modelli animali di ostruzione ureterale unilaterale reversibile (RUUO), che consentono l'osservazione dei cambiamenti strutturali e del danno funzionale, simulando anche i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici a seguito del sollievo dall'ostruzione ureterale. In questo studio, è stato stabilito un modello di ostruzione reversibile nell'uretere murino unilaterale utilizzando un tubo di silicone. Un danno renale significativo è stato osservato prima del sollievo dall'ostruzione, con un parziale recupero osservato in seguito. A differenza dell'UUO, questo modello previene l'idronefrosi progressiva, portando a esiti patologici distinti. Questa semplice procedura chirurgica dimostra un alto tasso di successo ed è promettente come modello classico per lo studio della nefropatia ostruttiva reversibile e dei potenziali trattamenti per la fibrosi interstiziale renale. Inoltre, fornisce una piattaforma pratica per studiare i meccanismi di recupero dalla nefropatia ostruttiva, dalla rigenerazione delle cellule renali e dal rimodellamento dei tessuti.

Introduzione

L'ostruzione uretrale contribuisce in modo significativo alla fibrosi interstiziale renale e alla malattia renale cronica (CKD), portando potenzialmente a danni strutturali irreversibili e menomazioni funzionali nel rene¹. Sebbene l'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) sia ampiamente utilizzata per studiare il danno renale e la CKD, non replica accuratamente i meccanismi di recupero spontaneo che si verificano dopo la rimozione di un'ostruzione. Il modello UUO prevede la legatura dell'uretere sinistro con punti di sutura, con conseguente ostruzione permanente, dilatazione ureterale, idronefrosi, compressione del parenchima renale e assottigliamento corticale. L'esame istologico rivela tipicamente dilatazione tubulare, necrosi delle cellule epiteliali tubulari, infiammazione interstiziale progressiva e fibrosi². Questo modello studia principalmente la fibrosi interstiziale renale e la perdita irreversibile della funzionalità renale dovuta a un'ostruzione persistente.

Tuttavia, molte malattie renali riscontrate nella pratica clinica, come l'ostruzione causata da calcoli ureterali o tumori, sono reversibili. Il modello di ostruzione ureterale unilaterale reversibile (RUUO) consente il ripristino parziale della struttura renale e della funzione delle vie urinarie, risolvendo infine l'idronefrosi. Il recupero può essere valutato attraverso tecniche di imaging, esame istologico e analisi dei biomarcatori per quantificare la riduzione del danno renale e della fibrosi³. Questo modello imita da vicino la fase di recupero della nefropatia ostruttiva in ambito clinico ed è più adatto dell'UUO per studiare processi chiave come l'infiammazione, le risposte immunitarie, la rigenerazione cellulare e il rimodellamento dei tessuti 4,5,6,7,8.

Il modello RUUO consente ai ricercatori di analizzare la riparazione e la rigenerazione renale dopo il sollievo dalla lesione, affrontando i limiti dell'UUO negli studi dinamici. Confrontando diversi punti temporali prima e dopo l'ostruzione, i ricercatori possono studiare i percorsi molecolari coinvolti nella lesione e nella riparazione, tra cui infiammazione, apoptosi, fibrosi e rigenerazione. Questo approccio migliora la comprensione dei meccanismi di recupero renale e identifica potenziali bersagli terapeutici 2,3,4,5,8,9,10. Sebbene la fibrosi renale sia spesso considerata irreversibile, le osservazioni cliniche suggeriscono che il sollievo precoce dall'ostruzione durante le fasi iniziali della fibrosi può arrestare o addirittura invertire la progressione della malattia. Il modello RUUO fornisce una preziosa piattaforma sperimentale per studiare questo fenomeno¹¹.

Inoltre, il modello RUUO facilita lo studio dell'inversione della fibrosi dopo il sollievo dall'ostruzione, offrendo approfondimenti sui meccanismi di recupero e sulle potenziali terapie antifibrotiche ^3,4. Di conseguenza, questo modello è molto pratico per la ricerca traslazionale. L'obiettivo principale di questo modello sperimentale è indurre la nefropatia ostruttiva attraverso l'incannulamento ureterale, seguito da un sollievo standardizzato in un momento predefinito per garantire la coerenza. È ottimizzato per semplicità, riproducibilità e sicurezza, il che lo rende uno strumento efficace per la ricerca sperimentale.

Protocollo

Questo studio sugli animali ha aderito alle linee guida della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca dell'Ospedale Pediatrico dell'Università di Medicina di Chongqing. Un totale di 27 ratti maschi di Sprague Dawley (SD) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati nel Laboratory Animal Center dell'Ospedale Pediatrico dell'Università di Medicina di Chongqing (SPF, numero di licenza: SYXK (Chongqing) 2007-0016). I ratti sono stati mantenuti in condizioni di temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua.

Il protocollo è stato condotto su ratti SD maschi di età compresa tra 6 e 8 settimane ed è applicabile a ratti di tutte le età con ureteri bilaterali. In questo studio, quindici ratti SD maschi di 6 settimane sono stati assegnati in modo casuale a tre gruppi: il gruppo nativo (n = 5), il gruppo UUO (n = 5) e il gruppo RUUO (n = 5). Inoltre, cinque ratti SD di 8 settimane (n = 5) sono stati inclusi come gruppo di controllo aggiuntivo. Per stabilire il modello RUUO, sono stati utilizzati 12 ratti, con 7 ratti aggiuntivi procurati per tenere conto di potenziali rischi come mortalità intraoperatoria e postoperatoria, fallimenti chirurgici, ostruzione incompleta e inversione non riuscita. Ciò ha garantito un minimo di 5 ratti per gruppo per le analisi successive.

Tutte le procedure chirurgiche sono state condotte in stretta conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il personale chirurgico ha aderito ai protocolli dei dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui maschere chirurgiche, guanti e camici. Per ogni procedura sono stati utilizzati strumenti chirurgici sterili e sono stati sterilizzati in autoclave prima e dopo l'uso per mantenere la sterilità. I materiali di scarto, compresi i campioni taglienti e biologici, sono stati smaltiti nel rispetto dei protocolli di gestione dei rifiuti pericolosi per mitigare i rischi di contaminazione e garantire la sicurezza.

1. Preparazione degli animali e degli strumenti

1. Eseguire tutte le procedure utilizzando strumenti e materiali di consumo sterili (autoclavati). Tagliare il tubo di silicone sterilizzato (diametro interno: 1,5 mm, diametro esterno: 2,5 mm) in segmenti di circa 1 cm. Praticare un'incisione longitudinale lungo un lato della parete del tubo per un uso successivo.
2. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (40 mg/kg) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare un'anestesia adeguata controllando l'assenza di risposte riflesse, come il riflesso di ritiro del pedale, al momento del pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante l'anestesia.
3. Depilare l'addome del ratto dal processo xifoideo alla sinfisi pubica ed estenderlo bilateralmente alla linea mediana.
4. Posizionare il ratto in posizione supina su un cuscinetto chirurgico riscaldato e fissare i suoi arti con corde di gomma.
5. Stendere un foglio fenestrato sterile per mantenere un campo sterile. Preparare la pelle con una soluzione di iodio povidone. Praticare un'incisione cutanea sulla linea mediana lungo l'addome, che si estende dalla regione subxifoidea fino a poco sotto l'ombelico, per fornire un'adeguata esposizione dei reni e degli ureteri superiori.
6. Incidere i tessuti sottocutanei e la fascia lungo la linea mediana utilizzando le forbici chirurgiche. Seziona meticolosamente la pelle e i tessuti sottostanti strato per strato ed esponi completamente lo spazio retroperitoneale usando una pinza per tessuti.

2. Chirurgia ostruttiva per ostruzione ureterale unilaterale reversibile

1. Ritrarre l'intestino sul lato destro della cavità addominale utilizzando un tampone sterile per facilitare la visualizzazione diretta dell'uretere sinistro. Coprire l'uretere con una garza imbevuta di soluzione salina per evitare che si secchi.
2. Sezionare e mobilizzare l'uretere sinistro utilizzando una pinza microscopica, liberando circa 1,5 cm dai tessuti circostanti.
3. Posizionare un tubo di silicone lungo 1 cm (diametro interno: 1,5 mm, diametro esterno: 2,5 mm) sotto l'uretere liberato. Utilizzare una pinza per garantire il completo involucro all'interno del tubo.
4. Legare il tubo di silicone e la parte centrale dell'uretere utilizzando un filo di seta 3-0 per indurre l'ostruzione ureterale. Evitare un'eccessiva forza di legatura. Tirare gradualmente il tubo di silicone lungo l'asse longitudinale dell'uretere per garantire una legatura sicura ma non scivolante.
5. Riposizionare con cura l'intestino all'interno della cavità peritoneale, assicurandosi un corretto allineamento senza tensioni o ostruzioni.
6. Sutura il muscolo addominale e gli strati fasciali utilizzando una sutura 2-0 non assorbibile con un ago da taglio curvo in modo continuo per fornire un'adeguata resistenza alla trazione. Chiudere la pelle con una sutura 4-0 non assorbibile, garantendo l'allineamento anatomico e una tensione uniforme per favorire la guarigione e ridurre al minimo il rischio di deiscenza della ferita.
7. Disinfettare il sito dell'incisione con una soluzione di iodio povidone. Lasciare che i ratti si riprendano in condizioni controllate a una temperatura costante per 7 giorni.

3. Chirurgia di sollievo dell'ostruzione ureterale unilaterale reversibile

1. Preparare gli animali e gli strumenti necessari, garantendo una configurazione sterile per la riapertura addominale e la piena esposizione della cavità addominale.
2. Sezionare accuratamente il nodo del tubo di silicone utilizzando una lama di bisturi. Rimuovere il tubo e irrigare la cavità addominale con soluzione fisiologica normale per ridurre al minimo l'adesione e il rischio di infezione.
3. Riposizionare l'intestino e suturare l'incisione della parete addominale a strati utilizzando suture 4-0 non assorbibili. Sterilizzare il sito di incisione con una soluzione di iodio povidone. Posizionare il ratto in un ambiente a temperatura controllata per un periodo di recupero postoperatorio di 7 giorni.
4. Il giorno 14 postoperatorio, anestetizzare i ratti (seguendo la procedura menzionata al punto 1.2) e raccogliere campioni di rene sezionando trasversalmente i reni in due metà⁹.
5. Conservare una metà in paraformaldeide al 4% per l'esame istopatologico e congelare rapidamente l'altra metà in azoto liquido per la conservazione a -80 °C per la successiva analisi molecolare. Raccogli campioni di sangue per analisi biochimiche.
6. Eseguire l'eutanasia tramite asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale seguendo le linee guida etiche.

4. Valutazioni di follow-up

1. Monitora il peso corporeo dopo RUUO per valutare il recupero generale. Confrontare le variazioni di peso con i gruppi di controllo e UUO.
2. Misurare il peso e il volume dei reni per valutare il recupero renale.
3. Monitorare i livelli sierici di creatinina (Scr) come indicatore del miglioramento della funzionalità renale⁹.
4. Iniettare il blu di metilene nella pelvi renale per confermare la pervietà ureterale. Osservare la peristalsi ureterale e la colorazione per valutare il recupero post-ostruzione.
5. Eseguire la colorazione H&E per valutare l'integrità tubulare e la struttura renale dopo RUUO ^8,10.
6. Condurre la colorazione tricromica di Masson per valutare la regressione della fibrosi interstiziale renale ^8,10.
7. Confrontare i punteggi di danno renale ^3,8 tra i gruppi UUO e RUUO per quantificare il recupero tissutale.

Risultati

Sono stati valutati gli effetti dell'UUO e del suo successivo rilascio (RUUO) sul peso corporeo, sul peso dei reni, sul volume dei reni e sui livelli di creatinina sierica (Scr), come riassunto nella Tabella 1. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD), con n = 5 per gruppo.

A 6 settimane, il gruppo nativo mostrava un peso corporeo medio di 234 g ± 16 g, un peso renale di 0,9107 g ± 0,0475 g e un volume renale di 0,8962 c...

Discussione

Questo modello utilizza un tubo di silicone per circondare l'uretere, fornendo supporto strutturale, seguito da una legatura con un filo di seta per indurre la completa ostruzione ureterale attraverso la compressione. Dopo sette giorni, la legatura e il tubo in silicone vengono rimossi per facilitare la decompressione renale e il ripristino dell'integrità e della funzionalità delle vie urinarie.

I tubi in silicone, realizzati con elastomeri siliconici, offro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030