Незрелая мышиная модель обратимой односторонней обструкции мочеточника

Резюме

В настоящем протоколе описана пошаговая, воспроизводимая модель односторонней обструкции мочеточника.

Аннотация

Односторонняя обструкция мочеточника (НВО) является распространенной причиной хронической болезни почек (ХБП), приводящей к прогрессированию интерстициального фиброза почек и в конечном итоге приводящей к необратимому повреждению почек. Решающее значение имеет облегчение ситуации с UUO. В литературе было создано несколько животных моделей обратимой односторонней обструкции мочеточника (RUUO), что позволяет наблюдать за структурными изменениями и функциональными повреждениями, а также моделировать физиологические и патофизиологические изменения после облегчения обструкции мочеточника. В этом исследовании была создана обратимая модель обструкции в одностороннем мочеточнике мыши с использованием силиконовой трубки. Значительное повреждение почек наблюдалось до снятия обструкции, а после отмечалось частичное восстановление. В отличие от НВО, эта модель предотвращает прогрессирующий гидронефроз, приводящий к отчетливым патологическим исходам. Эта простая хирургическая процедура демонстрирует высокий процент успеха и является перспективной моделью в качестве классической модели для изучения обратимой обструктивной нефропатии и потенциальных методов лечения интерстициального фиброза почек. Кроме того, она обеспечивает практическую платформу для изучения механизмов восстановления после обструктивной нефропатии, регенерации почечных клеток и ремоделирования тканей.

Введение

Обструкция уретры в значительной степени способствует почечному интерстициальному фиброзу и хронической болезни почек (ХБП), потенциально приводя к необратимым структурным повреждениям и функциональным нарушениям в почке¹. В то время как односторонняя обструкция мочеточника (НН) широко используется для изучения повреждения почек и ХБП, она не точно воспроизводит механизмы спонтанного восстановления, которые происходят после устранения обструкции. Модель UUO включает в себя наложение швов на левый мочеточник, что приводит к постоянной обструкции, расширению мочеточника, гидронефрозу, сдавливанию почечной паренхимы и истончению коры головного мозга. Гистологическое исследование обычно выявляет канальцевую дилатацию, некроз эпителиальных клеток канальцев, а также прогрессирующее интерстициальное воспаление и фиброз². Эта модель в первую очередь исследует интерстициальный фиброз почек и необратимую потерю функции почек из-за стойкой обструкции.

Тем не менее, многие заболевания почек, встречающиеся в клинической практике, такие как обструкция, вызванная камнями мочеточника или опухолями, являются обратимыми. Модель обратимой односторонней обструкции мочеточника (RUUO) позволяет частично восстановить структуру почек и функцию мочевыводящих путей, что в конечном итоге устраняет гидронефроз. Выздоровление может быть оценено с помощью методов визуализации, гистологического исследования и анализа биомаркеров для количественной оценки уменьшения повреждения почек и фиброза³. Эта модель близко имитирует фазу выздоровления при обструктивной нефропатии в клинических условиях и более подходит, чем UUO, для изучения ключевых процессов, таких как воспаление, иммунные реакции, регенерация клеток и ремоделирование тканей 4,5,6,7,8.

Модель RUUO позволяет исследователям анализировать восстановление и регенерацию почек после облегчения травмы, устраняя ограничения UUO в динамических исследованиях. Сравнивая различные временные моменты до и после обструкции, исследователи могут исследовать молекулярные пути, участвующие в травме и восстановлении, включая воспаление, апоптоз, фиброз и регенерацию. Этот подход улучшает понимание механизмов восстановления почек и определяет потенциальные терапевтические мишени 2,3,4,5,8,9,10. В то время как почечный фиброз часто считается необратимым, клинические наблюдения показывают, что раннее облегчение обструкции на начальных стадиях фиброза может остановить или даже обратить вспять прогрессирование заболевания. Модель RUUO представляет собой ценную экспериментальную платформу для исследования этого явления¹¹.

Кроме того, модель RUUO облегчает изучение реверсивного фиброза после снятия обструкции, предлагая понимание механизмов восстановления и потенциальных антифибротических методов лечения ^3,4. Следовательно, эта модель очень практична для трансляционных исследований. Основной целью этой экспериментальной модели является индуцирование обструктивной нефропатии через канюляцию мочеточника с последующей стандартизированной разгрузкой в заранее определенный момент времени для обеспечения согласованности. Он оптимизирован для обеспечения простоты, воспроизводимости и безопасности, что делает его эффективным инструментом для экспериментальных исследований.

протокол

Это исследование на животных проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и было одобрено Комитетом по этике научных исследований Детской больницы Чунцинского медицинского университета. В общей сложности 27 самцов крыс Sprague Dawley (SD) были коммерчески получены и размещены в Центре лабораторных животных Детской больницы Чунцинского медицинского университета (SPF, номер лицензии: SYXK (Chongqing) 2007-0016). Крысы содержались в контролируемых температурных условиях с 12-часовым циклом свет/темнота и имели свободный доступ к пище и воде.

Протокол проведен на крысах-самцах SD в возрасте 6-8 недель и применим к крысам всех возрастов с двусторонними мочеточниками. В этом исследовании пятнадцать 6-недельных самцов крыс SD были случайным образом распределены в три группы: родная группа (n = 5), группа UUO (n = 5) и группа RUUO (n = 5). Кроме того, пять 8-недельных крыс SD (n = 5) были включены в качестве дополнительной контрольной группы. Для создания модели RUUO было использовано 12 крыс, а также 7 дополнительных крыс с учетом потенциальных рисков, таких как интраоперационная и послеоперационная смертность, неудачи хирургических операций, неполная обструкция и неудачное обращение. Это обеспечивало минимум 5 крыс в группе для последующих анализов.

Все хирургические процедуры проводились в строгом соответствии с институциональными и национальными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и их использованию. Хирургический персонал придерживался протоколов использования средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая хирургические маски, перчатки и халаты. Для каждой процедуры использовались стерильные хирургические инструменты, которые были автоклавированы до и после использования для поддержания стерильности. Отходы, в том числе острые предметы и биологические образцы, были утилизированы в соответствии с протоколами обращения с опасными отходами для снижения рисков загрязнения и обеспечения безопасности.

1. Подготовка животных и инструментов

1. Проводить все процедуры с использованием стерильных (автоклавных) инструментов и расходных материалов. Разрежьте стерилизованную силиконовую трубку (внутренний диаметр: 1,5 мм, внешний диаметр: 2,5 мм) на сегменты примерно по 1 см. Сделайте продольный надрез вдоль одной стороны стенки трубки для последующего использования.
2. Обезболивание крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (40 мг/кг) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердите адекватную анестезию, проверив отсутствие рефлекторных реакций, таких как рефлекс отмены педали, при защемлении пальца ноги. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время анестезии.
3. Депилируют брюшную полость крысы от мечевидного отростка к лобковому симфизу и простирают двусторонне до средней линии.
4. Расположите крысу в лежачем положении на подогреваемой хирургической подушке и закрепите ее конечности резиновыми веревками.
5. Накидывайте стерильный фенестрированный лист для поддержания стерильности поля. Подготовьте кожу раствором повидон-йода. Сделайте разрез кожи по средней линии вдоль живота, простирающийся от субксифоидной области до чуть ниже пупка, чтобы обеспечить адекватное обнажение почек и верхних отделов мочеточника.
6. Надрезать подкожные ткани и фасцию по средней линии с помощью хирургических ножниц. Тщательно рассеките кожу и подлежащие ткани слой за слоем и полностью обнажите забрюшинное пространство с помощью тканевых щипцов.

2. Обструктивная хирургия при обратимой односторонней обструкции мочеточника

1. Втяните кишечник в правую сторону брюшной полости с помощью стерильного тампона, чтобы облегчить прямую визуализацию левого мочеточника. Накройте мочеточник марлей, пропитанной солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание.
2. Рассеките и мобилизуйте левый мочеточник с помощью микроскопических щипцов, освободив примерно 1,5 см от окружающих тканей.
3. Поместите силиконовую трубку длиной 1 см (внутренний диаметр: 1,5 мм, внешний диаметр: 2,5 мм) под освобожденный мочеточник. Используйте щипцы, чтобы обеспечить полное прилегание к трубе.
4. Перевязать силиконовую трубку и среднюю часть мочеточника шелковой нитью 3-0, чтобы вызвать обструкцию мочеточника. Избегайте чрезмерной силы лигирования. Постепенно протяните силиконовую трубку вдоль продольной оси мочеточника, чтобы обеспечить надежное, но нескользящее перевязку.
5. Осторожно переместите кишечник в брюшную полость, обеспечивая правильное выравнивание без напряжения или препятствий.
6. Непрерывно сшивайте мышцы живота и фасциальные слои с помощью нерассасывающегося шовного материала 2-0 с изогнутой режущей иглой для обеспечения достаточной прочности на разрыв. Закройте кожу нерассасывающимся швом 4-0, обеспечивая анатомическое выравнивание и равномерное натяжение, чтобы способствовать заживлению и свести к минимуму риск расхождения раны.
7. Продезинфицируйте место разреза раствором повидон-йода. Дайте крысам восстановиться в контролируемых условиях при постоянной температуре в течение 7 дней.

3. Релейная хирургия обратимой односторонней обструкции мочеточника

1. Подготовьте необходимых животных и инструменты, обеспечив стерильную установку для повторного открытия брюшной полости и полного обнажения брюшной полости.
2. Аккуратно рассеките узел силиконовой трубки с помощью лезвия скальпеля. Извлеките трубку и орошите брюшную полость обычным физиологическим раствором, чтобы свести к минимуму спайки и риск инфекции.
3. Вправьте кишечник и зашите разрез брюшной стенки слоями с помощью 4-0 нерассасывающихся швов. Место разреза простерилизовать раствором повидон-йода. Поместите крысу в среду с контролируемой температурой на 7-дневный послеоперационный период восстановления.
4. На 14-й день после операции сделайте крыс под наркозом (следуя процедуре, описанной в шаге 1.2) и соберите образцы почек, поперечно разрезав почки на две половины^.
5. Храните одну половину в 4% параформальдегиде для гистопатологического исследования, а другую половину быстро замораживайте в жидком азоте для хранения при температуре −80 °C для последующего молекулярного анализа. Соберите образцы крови для биохимических анализов.
6. Провести эвтаназию с помощью удушения CO₂ с последующим вывихом шейки матки в соответствии с этическими рекомендациями.

4. Последующая оценка

1. Отслеживайте массу тела после RUUO для оценки общего восстановления. Сравните изменения веса с контрольной группой и группой UUO.
2. Измерьте массу и объем почек для оценки восстановления почек.
3. Мониторинг уровня креатинина (Scr) в сыворотке крови как индикатора улучшения функции почек⁹.
4. Введите метиленовый синий в почечную лоханку для подтверждения проходимости мочеточника. Наблюдайте за перистальтикой и окраской мочеточника для оценки восстановления после обструкции.
5. Проводите окрашивание H&E для оценки целостности канальцев и структуры почек после RUUO ^8,10.
6. Проведение трихромного окрашивания по Массону для оценки регрессии почечного интерстициального фиброза ^8,10.
7. Сравните баллы повреждения почек ^3,8 между группами UUO и RUUO для количественной оценки восстановления тканей.

Результаты

Оценивали влияние UUO и его последующего высвобождения (RUUO) на массу тела, массу почек, объем почек и уровни креатинина (Scr) в сыворотке крови, как показано в таблице 1. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), при этом n = 5 на группу.

Обсуждение

В этой модели используется силиконовая трубка для окружения мочеточника, обеспечивающая структурную поддержку, с последующим лигированием шелковой нитью для вызова полной обструкции мочеточника за счет компрессии. Через семь дней лигирование и силиконовая трубка ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030